孫 倩，李開雄，李 春，段海燕，葉 海，曹 紅，*

(1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000; 2.石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院/化工綠色過程新疆兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832000)

甲殼素固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的研究

孫 倩1，李開雄1，李 春2，段海燕2，葉 海2，曹 紅2，*

(1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000; 2.石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院/化工綠色過程新疆兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832000)

以甲殼素為載體、戊二醛為交聯(lián)劑，固定β-葡萄糖醛酸苷酶，對β-葡萄糖醛酸苷酶的固定化條件進(jìn)行了研究，并通過正交實(shí)驗(yàn)確定了酶固定的最佳條件:戊二醛濃度0.7%，交聯(lián)時間4h，吸附時間為9h，反應(yīng)溫度40℃，此時酶活力回收率可達(dá)67.32%。

β-葡萄糖醛酸苷酶，甲殼素，固定化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種來源 課題組前期從土壤中篩選得到的Penicillium sp.Li-3;β-葡萄糖醛酸苷酶 實(shí)驗(yàn)室自制;其他試劑和藥品 均為國產(chǎn)分析純;基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基 每升水中含甘草酸單銨鹽2g，NaNO33g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，F(xiàn)eSO4· 7H2O 0.01g。

紫外可見分光光度計 澳大利亞GBC公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 β-葡萄糖醛酸苷酶的制備 將真菌Penicillium sp.Li-3接種到80mL的基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，然后于30℃恒溫?fù)u床(170r/min)培養(yǎng)120h后，發(fā)酵終點(diǎn)的菌體用pH 4.5的醋酸-醋酸銨緩沖液洗滌、重懸后定容至50mL，于冰浴條件下超聲破碎細(xì)胞(超聲破碎條件:變幅桿末端直徑φ10，工作時間2s，間隔時間4s，全程凈超聲時間20min，輸出功率400W)。離心去除沉淀，上清液即為粗酶液。

1.2.2 β-葡萄糖醛酸苷酶的固定 稱取0.1g的甲殼素，加入體積比為0.7%的戊二醛，交聯(lián)4h后徹底水洗至洗脫液中沒有戊二醛，然后加入pH6.0、總酶活為2098U的β-葡萄糖醛酸苷酶于冰浴中攪拌1h后，放入冰箱中4℃吸附過夜。次日用蒸餾水徹底水洗，過濾干燥，即可得到固定化 β-葡萄糖醛酸苷酶［11］。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取經(jīng)105℃干燥3h的甘草酸單銨鹽對照品30.5mg，用50%乙醇定容于50 mL容量瓶中，使其終濃度為0.61mg·mL-1，備用。精密吸取甘草酸標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于10mL容量瓶中，分別加入蒸餾水至刻度、搖勻、定容。以50%乙醇作空白對照，在252nm波長處測定各吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸光度對溶液總甘草酸的含量進(jìn)行回歸分析［12］。

1.2.4 游離酶和固定化酶活力的測定

1.2.4.1 游離酶活力測定 測定方法如下:200μL粗酶液加入到800μL含有甘草酸濃度2mg·mL-1、pH為4.5的醋酸-醋酸銨緩沖溶液中，40℃條件下反應(yīng)1h后，沸水浴中使酶失活，取0.25mL反應(yīng)液用50%乙醇定容至10mL，搖勻，在252nm下測定吸光度?？瞻讓φ罩灰獙?00μL粗酶液用相同體積煮沸失活的酶來代替，其余步驟相同。甘草酸的含量可根據(jù)甘草酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得［12］。用空白對照中的甘草酸含量減去反應(yīng)液中甘草酸量便可得消耗的甘草酸量。

β-葡萄糖醛酸苷酶的活力(U):在上述條件下，1mL酶液每小時分解消耗1μg甘草酸的量定義為一個酶活力單位。

1.2.4.2 固定化酶活力測定 固定化酶活力的測定將200μL粗酶液用200μL蒸餾水和一定量的固定化酶來代替，其余步驟相同。

固定化酶的相對酶活力，指在同組實(shí)驗(yàn)中以活性最高的為100，與其余的固定化酶活力之比，以百分?jǐn)?shù)表示。

酶活力回收率(%)=(固定化酶活力/投入的游離酶活力)×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過測定的吸光度值，以吸光度對溶液中甘草酸濃度進(jìn)行回歸分析。經(jīng)線性回歸，得甘草酸對照品濃度Y(mg·mL-1)與吸光度(A)之間的線性回歸方程:Y=0.0764X-0.0003，R2=0.9999。結(jié)果表明甘草酸在0.0122～0.0610mg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 甘草酸對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 各種因素對固定化β－葡萄糖醛酸苷酶的影響

2.2.1 戊二醛濃度對酶活力的影響 稱取0.1g的甲殼素，分別加入濃度0.3%～0.9%的戊二醛溶液，后續(xù)步驟見1.2.2。由圖2可知，當(dāng)戊二醛濃度為0.7%時，固定化酶的相對酶活力最高。戊二醛濃度較高或較低時酶活均比較低。這是因?yàn)槲於┘仁墙宦?lián)劑，又是酶的變性劑。過低濃度的戊二醛使得酶交聯(lián)到載體上的程度不夠，所以酶的相對酶活力不高。但過高濃度的戊二醛會使載體交聯(lián)度過大，形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)太緊密而限制了底物和反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)散，使得酶活性降低;同時，過高濃度的戊二醛會與酶蛋白產(chǎn)生過度交聯(lián)，導(dǎo)致活性中心的改變而使酶失活。因此，戊二醛濃度以0.70%最佳。

圖2 戊二醛濃度對固定化酶相對酶活力的影響

2.2.2 戊二醛與甲殼素交聯(lián)時間對酶活力的影響由圖3可知，當(dāng)戊二醛與甲殼素的交聯(lián)時間為4h時，固定化酶的相對酶活力達(dá)到最大值。這主要是因?yàn)榻宦?lián)的時間越長，交聯(lián)的戊二醛量越多，最后固定化的酶量也越多。因此，交聯(lián)時間以4h為最佳。

圖3 交聯(lián)時間對固定化酶相對酶活力的影響

2.2.3 酶吸附時間對酶活力的影響 分別選擇不同的吸附時間3～10h，間隔1h測定固定化酶活力，從而確定不同的吸附時間對固定化酶相對酶活力的影響。由圖4可知，雖然固定化酶活力在吸附5h時酶活力較高，但隨著時間的推移，酶活力又開始下降，也就是說在這個時間段內(nèi)酶蛋白與載體吸附并沒有達(dá)到穩(wěn)定，而在8h后載體固化能力才達(dá)到穩(wěn)定，因此，選取吸附時間為8h。

圖4 吸附時間對固定化酶相對酶活力的影響

2.2.4 固定化酶與底物反應(yīng)溫度對酶活力的影響分別選擇不同的反應(yīng)溫度使固定化酶與底物反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度為40℃時，固定化酶的相對酶活力最高，而隨著溫度的逐漸升高，相對酶活力急劇下降。這是因?yàn)闇囟冗^高導(dǎo)致大部分酶活力喪失。因此，反應(yīng)溫度以40℃為最佳。

圖5 反應(yīng)溫度對固定化酶相對酶活力的影響

2.2.5 β-葡萄糖醛酸苷酶的固定化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)所得出的最佳結(jié)果，稱取0.1g的甲殼素，加入體積比為0.7%的戊二醛，交聯(lián)4h后徹底水洗至洗脫液中沒有戊二醛，然后加入pH6.0、總酶活為2098U的β-葡萄糖醛酸苷酶于冰浴中攪拌1h后，放入冰箱中4℃吸附8h，然后用蒸餾水徹底水洗，過濾干燥，得到固定化酶的酶活回收率為59.86%。

2.3 固定化β－葡萄糖醛酸苷酶的正交實(shí)驗(yàn)

通過對酶固定化條件的單因素實(shí)驗(yàn)，得出影響酶固定化的4個主要因素:戊二醛濃度、吸附時間、交聯(lián)時間、反應(yīng)溫度(加酶量為2098U)。分別選取三個水平進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表1和表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平表

由表2可看出，A、C因素顯著，B和D均為不顯著因素，各因素對實(shí)驗(yàn)指標(biāo)影響的主次順序?yàn)?C＞A＞D＞B。由表2還可得出，最佳的工藝條件組合為A2B3C2D2，即戊二醛濃度為0.70%，交聯(lián)時間為4h，反應(yīng)溫度40℃，吸附時間9h。在此條件下做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測得固定化酶的酶活回收率可達(dá)67.32%，證明了實(shí)驗(yàn)的可靠性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以甲殼素為載體，通過單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的活力受到戊二醛濃度、交聯(lián)時間、反應(yīng)溫度以及吸附時間的影響，后又通過正交實(shí)驗(yàn)得出最佳固定化條件為:戊二醛濃度為0.7%，交聯(lián)時間為4h，反應(yīng)溫度40℃，吸附時間9h，此時固定化酶的酶活回收率可達(dá)67.32%。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，以甲殼素為載體，固定化β-葡萄糖醛酸苷酶，過程簡單，條件溫和，酶活回收率較高，并且載體甲殼素來源廣泛，價格低廉，安全無毒，為固定化β-葡萄糖醛酸苷酶生物轉(zhuǎn)化甘草酸合成GAMG的新工藝研究奠定了良好的基礎(chǔ)，具有一定的實(shí)用意義。

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Study on immobilization of β-glucuronidase by chitin

SUN Qian1，LI Kai-xiong1，LI Chun2，DUAN Hai-yan2，YE Hai2，CAO Hong2，*
(1.Food College，Shihezi University，Shihezi 832000，China; 2.College of Chemistry and Chemical Engineer/Xinjiang Bingtuan Key Laboratory for Green Processing of Chemical Engineering，Shihezi University，Shihezi 832000，China)

The method of immobilized β-glucuronidase was studied in this paper，β-glucuronidase has been immobilized on chitin with glutaraldehyde as crosslinking agent.Some factors that had effect on activity of immobilized β-glucuronidase were studied.The optimal conditions of immobilization were achieved by using the method of orthogonal test，when glutaraldehyde concentration was 0.7%，cross-linking time was 4h，adsorption time was 9h and reaction temperature was 40℃，the recovery rate of immobilized β-glucuronidase activity was 67.32%.

β-glucuronidase;chitin;immobilization

TS201.2+3

B

1002-0306(2011)09-0267-04

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，與甘草中的主要有效成分甘草酸(Glycyrrhizin，GL)相比，單葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetinic acid monoglucuronide，GAMG)的甜度更高、熱量更低，其甜度是GL的5倍多，是蔗糖的1000多倍。GAMG在體液中具有更好的溶解度和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力，藥物作用起效更快;動物實(shí)驗(yàn)研究表明，GAMG的LD50為5000mg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于GL的LD50(805mg/kg)，無致畸變作用［1-3］。無論作為食品添加劑，還是作為原料藥，GAMG均有望替代GL，并且可獲得相當(dāng)可觀的經(jīng)濟(jì)效益。因此，關(guān)于GL生物法轉(zhuǎn)化合成高生物活性(GAMG)現(xiàn)已成為國際上食品行業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本課題組前期從新疆主要甘草種植區(qū)的土壤中，篩選分離到可以利用甘草酸(GL)為唯一碳源進(jìn)行生長的真菌-Penicillium sp. Li-3，由該菌表達(dá)的β-葡萄糖醛酸苷酶具有較高的化學(xué)鍵選擇性，能定向催化甘草酸生成GAMG［4-8］，其摩爾轉(zhuǎn)化率可達(dá)到88.45%［9］。但在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，游離β-葡萄糖醛酸苷酶的穩(wěn)定性較差，易失活，并且反應(yīng)后混入催化產(chǎn)物，純化困難，不能重復(fù)使用。本文研究固定化β-葡萄糖醛酸苷酶制備技術(shù)能夠有效彌補(bǔ)游離酶存在的這些不足。甲殼素是一種天然氨基多糖，是甲殼類動物殼的主要成分。據(jù)估計它在生物圈合成與分解一年可達(dá)1×106t，是世界上產(chǎn)量最豐富的、可再生的有機(jī)資源之一［10］。由于甲殼素的特性和環(huán)保性，使其成為較好的酶固定化載體材料，而且酶經(jīng)固定化后耐酸堿性強(qiáng)，耐熱性好，酶活不受金屬離子干擾，同時減輕對環(huán)境的污染，近年來，國際上也十分重視對這一資源的開發(fā)和利用，因此具有良好的發(fā)展前景。

2010-09-09 *通訊聯(lián)系人

孫倩(1985-)，女，碩士，研究方向:生物技術(shù)與酶工程。

教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(209146);兵團(tuán)博士資金項(xiàng)目(2009JC13);2008年度石河子大學(xué)高層次人才科研啟動資金專項(xiàng)(RCZX200805)。