楊宜婷，羅琥捷，葉勇樹，廖金花，李藥蘭，*

(1.無限極(中國)有限公司，廣東廣州510665;2.暨南大學(xué)藥學(xué)院中藥及天然藥物研究所，廣東廣州510632; 3.暨南大學(xué)中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及創(chuàng)新藥物研究廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632)

不同儲存年限廣陳皮的多甲氧基黃酮提取研究

楊宜婷1，羅琥捷1，葉勇樹2，3，廖金花2，3，李藥蘭2，3，*

(1.無限極(中國)有限公司，廣東廣州510665;2.暨南大學(xué)藥學(xué)院中藥及天然藥物研究所，廣東廣州510632; 3.暨南大學(xué)中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及創(chuàng)新藥物研究廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632)

采用水、95%乙醇、水蒸汽蒸餾和超臨界CO2流體分別提取廣陳皮中的多甲氧基黃酮(PMFs)，用紫外分光光度法(UV)測定所得提取物中PMFs的含量，并考察了廣陳皮的儲存年份對提取的影響。結(jié)果表明，在四種提取物中，超臨界CO2流體萃取產(chǎn)物(SFE提取物)的PMFs含量(以提取物計(jì)算)最高，其次為醇提物，水蒸汽蒸餾產(chǎn)物(SD提取物)和水提物中PMFs的含量較低。值得注意的是，由于95%乙醇對廣陳皮的提取率較高，醇提物中PMFs的提取率(以藥材計(jì)算)最高。因此，95%乙醇和超臨界CO2流體均能較好地將廣陳皮中PMFs提取出來。但是，隨著廣陳皮的儲存年份延長，其95%乙醇提取物和SFE提取物中PMFs的含量均呈下降趨勢。

廣陳皮，多甲氧基黃酮，提取方法，儲存年份

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

廣陳皮 購于廣東省江門市新會區(qū)，包括四年、十年、二十年和三十年的廣陳皮，經(jīng)暨南大學(xué)藥學(xué)院周光雄鑒定為茶枝柑(Citrus reticulata‘Chachi’)的干燥成熟果皮，經(jīng)粉碎后過50目篩備用;橘皮素對照品 自制，分離自廣陳皮的SFE提取物，經(jīng)1HNMR、13CNMR和MS等光譜學(xué)技術(shù)和理化性質(zhì)鑒定其結(jié)構(gòu)，用HPLC峰面積歸一法測定純度在98%以上(分離和分析過程另文報(bào)道)。

HA-121-50-02超臨界CO2萃取裝置 江蘇南通華安超臨界萃取有限公司;V-550紫外-可見光譜儀 廣州科橋?qū)嶒?yàn)技術(shù)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 廣陳皮的提取 95%乙醇提取:分別取粉碎的四年、十年、二十年和三十年的廣陳皮粉末1kg，置于2000mL圓底燒瓶中，加入95%乙醇1000mL，加熱回流提取1h，重復(fù)3次，合并3次提取液，減壓濃縮、干燥，得到四個(gè)深黃色的醇提物。

蒸餾水提取:取粉碎的四年廣陳皮粉末1kg，置于2000mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水1000mL，加熱回流提取1h，重復(fù)3次，合并3次提取液，減壓濃縮、干燥，得淺褐色的水提物。

水蒸汽蒸餾提取:取粉碎的四年廣陳皮粉末1kg，置于2000mL圓底燒瓶中，加蒸餾水1000mL，用揮發(fā)油提取器提取8h，用石油醚萃取揮發(fā)油，萃取液中加入無水硫酸鈉干燥，過濾，揮去石油醚，得到淡黃色的SD提取物。

超臨界CO2流體萃取:分別取粉碎的四年、十年、二十年和三十年的廣陳皮粉末1kg，置于超臨界CO2萃取儀中，萃取壓力為 25MPa、萃取溫度為35℃、流速為20L/h、提取時(shí)間為1.5h，得到四個(gè)橘黃色的SFE提取物。

1.2.2 供試品溶液的配制 精密稱取廣陳皮的水提物、醇提物、SD提取物和SFE提取物，分別用70%乙醇溶液溶解并定容于25mL容量瓶中，溶液經(jīng)微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.2.3 對照品溶液的配制 精密稱取橘皮素對照品4.7mg，用70%乙醇溶液溶解并定容于25mL容量瓶中，配成0.188mg/mL的對照品溶液。

1.2.4 UV測定波長的選擇 精密量取1.2.3處配好的對照品溶液0.5～25mL于容量瓶中，用70%乙醇定容，混合均勻，進(jìn)行UV掃描，以70%乙醇溶液為空白溶劑，結(jié)果見圖1。

圖1 橘皮素對照品溶液紫外吸收曲線

由圖1可見，橘皮素在330nm處有最大吸收。另外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，陳皮中的幾個(gè)PMFs的UV最大吸收均在330nm左右［6］，而橙皮苷在330nm處無吸收，其UV最大吸收波長在285nm處［7］。故采用UV法測定廣陳皮提取物中PMFs的含量時(shí)，選擇330nm為檢測波長。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密吸取1.2.3處配好的對照品溶液0.15、0.25、0.35、0.45、0.55、0.65mL，分別置于10mL容量瓶中，加入70%乙醇定容。以70%乙醇為空白對照，在330nm處測定吸光度，以橘皮素的濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，求回歸方程為A= 0.076C+0.0195，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，表明樣品在2.82～12.22μg/mL的濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

1.2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 分別取高、中、低3個(gè)濃度的對照品溶液，在330nm處進(jìn)行測定它們的吸光度A值，連續(xù)測定6次，測定值的RSD值均小于0.5%，表明測定方法的精密度符合要求。

1.2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一樣品6份，分別按“1.2.2”項(xiàng)制備成供試品液，精密量取1.0mL置于25mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度。在330nm處測定A值，計(jì)算它們含量值的RSD小于3.9%，表明測定方法的重復(fù)性良好。

1.2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密量取各供試品溶液1.0mL，分別置于25mL容量瓶中，用70%乙醇定容，分別放置0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，在330nm處進(jìn)行測定它們的吸光度，測定值的RSD值均小于0.5%，表明樣品溶液在2.5h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.9 回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取各個(gè)已知含量的供試品液1.0mL，分別置于6個(gè)25mL容量瓶中，分別加入對照品溶液適量，加70%乙醇定容至刻度，在330nm處測定它們的吸光度。經(jīng)計(jì)算，各樣品的加樣回收率在95.3%～102.7%之間，RSD值均小于3.1%，表明測定方法的準(zhǔn)確度良好。

1.2.10 多甲氧基黃酮的含量測定 分別精密量取廣陳皮的水提物、SD提取物、各醇提物和各SFE提取物1.0mL置于25mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度。在330nm處進(jìn)行測定它們的吸光度A值，重復(fù)測定6次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各提取物中PMFs的百分含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 廣陳皮各提取物中PMFs的提取和含量

實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果見表1。由表1數(shù)據(jù)可見，對于儲存四年的廣陳皮來說，在四種提取物中，SFE提取物的PMFs含量(以提取物計(jì)算)最高(達(dá)25.34%)，其次為醇提物，SD提取物和水提物PMFs的含量較低。值得注意的是，由于醇提物的提取率較高，因此采用95%乙醇提取廣陳皮，以藥材計(jì)算其PMFs的提取率最高(為0.95%)。另外，隨著廣陳皮儲存年份(四年、十年、二十年和三十年)的延長，其SFE提取物和醇提物中PMFs的含量均呈下降趨勢。

研究結(jié)果表明，在四種廣陳皮提取物中，SFE提取物的PMFs含量最高，這是由于PMFs的極性比其對應(yīng)的多羥基取代黃酮的極性低，因此超臨界CO2流體能將廣陳皮中PMFs較好地溶解出來;另一方面，由于95%乙醇對廣陳皮的提取率較高，因此醇提物中PMFs的提取率最高。總之，95%乙醇和超臨界CO2流體均能較好地將廣陳皮中PMFs提取出來。由于SFE提取物中PMFs的含量較高，因此采用SFE法提取廣陳皮，更利于其中PMFs的富集和進(jìn)一步純化;而且與有機(jī)溶劑(如乙醇和石油醚等)提取的方法比較，SFE的提取方法具有條件溫和、對環(huán)境友好、操作簡便及成本較低等特點(diǎn)，更適合應(yīng)用于食品和藥品的有效成分提取和富集。

表1 廣陳皮各提取物中多甲氧基黃酮的提取和含量測定結(jié)果

2.2 廣陳皮的儲存年份對其PMFs提取的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著廣陳皮的儲存年份延長，其醇提物和SFE提取物中PMFs的含量均逐漸下降，但下降幅度不會很大。有文獻(xiàn)報(bào)道采用甲醇提取不同儲存年限的廣陳皮，用HPLC分析法測定各提取物中橙皮苷和PMFs的含量，結(jié)果表明，儲存時(shí)間較短的一年、三年、六年和九年的廣陳皮，其甲醇提取物中PMFs的含量均高于儲存年限三十三年的廣陳皮［2］。因此，從廣陳皮中提取PMFs時(shí)，可選用儲存時(shí)間較短的藥材。

另外，本文還建立了UV法測定廣陳皮中PMFs含量的分析方法。文獻(xiàn)報(bào)道，UV法測定陳皮中總黃酮含量時(shí)，多以蘆丁或橙皮苷作對照品，通過金屬離子(硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉)絡(luò)合顯色，在510nm處進(jìn)行測定［8-9］，或不經(jīng)過顯色步驟，在橙皮苷的最大吸收波長285nm處直接測定［7］。但這兩種測定方法對PMFs都沒有專屬性，而且絡(luò)合顯色僅局限于苯環(huán)上有鄰二酚羥基的黃酮類化合物。以廣陳皮中含量較高的PMFs橘皮素為對照品，以其最大吸收波長330nm為檢測波長，測定各提取物中PMFs的含量。由于橙皮苷在330nm處無大的吸收峰，所以本文建立的PMFs分析方法具有一定的專屬性。另外，與HPLC分析法比較，采用UV分析法測定陳皮中總PMFs含量具有操作簡便，實(shí)驗(yàn)條件要求較低，利于在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用等特點(diǎn)。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用四種提取溶劑(方法)分別提取廣陳皮中的PMFs，并考察了不同儲存年限的廣陳皮對其PMFs提取的影響。結(jié)果表明，95%乙醇和超臨界CO2流體均能較好地將廣陳皮中PMFs提取出來。但是，隨著廣陳皮的儲存年份延長，其95%乙醇提取物和SFE提取物中PMFs的含量均呈下降趨勢。本文還建立了專屬性較好、操作簡便的廣陳皮中PMFs含量測定方法。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人們共和國藥典2010年版一部［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄57.

［2］鄭國棟，蔣林，楊雪，等.不同儲存年限廣陳皮黃酮類成分的變化規(guī)律研究［J］.中成藥，2010，32(6):977-980.

［3］王磊，蘇學(xué)素，付陳梅，等.柑橘中多甲氧基黃酮生物活性及應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2009，30(7):285-290.

［4］周芳，彭朵花，杜方麓.多甲氧基黃酮的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中南藥學(xué)，2008，6(6):734-737.

［5］ ChenJ，MontanartAM，WidmerW W.Twonew polymethoxylated flavones，a class of compounds with potential anticancer activity，isolated from cold pressed dancy tangerine peel oil solids［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，1997，45:364-368.

［6］吳宏偉，雷海民，李強(qiáng)，等.高效液相色譜法測定陳皮多甲氧基黃酮部位中3種黃酮的含量［J］.藥物分析雜志，2007，27 (12):1895-1897.

［7］林林，林子夏，莫云燕，等.不同年份新會陳皮總黃酮及橙皮苷含量動態(tài)分析［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19(6):1432 -1433.

［8］周錫蘭，杜曦，杜軍.不同法陳皮提取物中總黃酮的測定［J］.化學(xué)工程與裝備，2008(5):103-104.

［9］康永勝，田寶娟，王孟歌，等.陳皮中總黃酮含量的測定［J］.保定?？茖W(xué)院學(xué)報(bào)，2006(2):51-52.

Study on the extraction of polymethoxylated flavones from Citrus reticulata‘Chachi’of different storage years

YANG Yi-ting1，LUO Hu-jie1，YE Yong-shu2，3，LIAO Jin-hua2，3，LI Yao-lan2，3，*
(1.Infinitus(China)Company Ltd，Guangzhou 510665，China;2.Institute of Traditional Chinese Medicine＆Natural Products，College of Pharmacy，Jinan University，Guangzhou 510632，China;3.Guangdong Province Key Laboratory of Pharmacodynamic Constituents of TCM and New Drugs Research，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

The extraction of polymethoxylated flavones(PMFs)from Citrus reticulata‘Chachi’was investigated in the present study.The Citrus reticulata‘Chachi’was extracted using distilled water，95%ethanol，steam distillation (SD)and supercritical CO2fluid extraction(SFE)，respectively，and the obtained extracts were then subjected to ultraviolet analysis to evaluate their contents of PMFs.As a result，the content of PMFs(%of dry weigh of the extract)in the SFE extract was highest among the four extracts，followed by that in the ethanol extract.The contents of PMFs in the aqueous extract and SD extract were lower.It is noteworthy that the extractive yield of PMFs(%of dry weigh of the plant)in the ethanol extract was higher than that in the SFE extract due to the higher extractive yield of the ethanol extract.In summary，both 95%ethanol and supercritical CO2fluid could effectively extract PMFs from Citrus reticulate‘Chachi’.Subsequently，the contents of PMFs in SFE and ethanol extracts obtained from the plants of different storage years were investigated.The result indicated that the contents of PMFs in both SFE and ethanol extracts decreased with the increaseing of the storage years.

Citrus reticulata‘Chachi’;polymethoxylated flavones;extraction;store years

TS201.2

B

1002-0306(2011)09-0258-03

陳皮為蕓香科柑橘(Citrus reticulata Blanco)屬植物及其栽培變種的干燥成熟果皮，分為“陳皮”和“廣陳皮”，具理氣健脾、燥濕化痰功效［1］。廣陳皮為茶枝柑(Citrus reticulata‘Chachi’)的干燥成熟果皮，主產(chǎn)地為廣東省的新會地區(qū)［2］，為廣東省十大道地藥材之首，也是歷史悠久，藥食同源的廣東地方特產(chǎn)。多甲氧黃酮(Polymethoxyflavonoids，PMFs)是甲氧基數(shù)大于或等于4的黃酮類化合物，也是蕓香科柑橘屬植物的主要化學(xué)成分之一［3-5］，陳皮中含量較高的PMFs是橘皮素(紅橘素)和川陳皮素［6］。近年來，PMFs因其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗誘變等生物活性而受到重視［3-5］，但這類化合物的提取方法的研究報(bào)道不多。本文采用水、95%乙醇、水蒸汽蒸餾和超臨界CO2流體分別提取廣陳皮中的PMFs，并考察了廣陳皮的儲存年份對其提取率的影響，為廣陳皮在食品和藥品中的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

2011-05-13 *通訊聯(lián)系人

楊宜婷(1976-)，女，工程師，研究方向:天然產(chǎn)物化學(xué)。

國家自然科學(xué)基金(81072535);廣東省自然科學(xué)基金團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(8351063201000003)。