劉樹興，侯 屹，*，李 祥，彭書翰

(1.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021; 2.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西西安710021)

盾葉薯蕷皂苷酸解液中鼠李糖的提取研究

劉樹興1，侯 屹1，*，李 祥2，彭書翰2

(1.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021; 2.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西西安710021)

以盾葉薯蕷為原料，研究了從皂苷酸解液中提取鼠李糖的工藝。通過正交實(shí)驗(yàn)確定了脫色最佳工藝為:活性炭加入量為1.5%，脫色時(shí)間為40min，脫色溫度為70℃，酸解液pH為2。在酵母加入量2%，溫度36℃的條件下，發(fā)酵5h能除去葡萄糖，獲得鼠李糖，得率為1.5%。且實(shí)驗(yàn)排放水符合國家標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值、降低皂素工業(yè)污染有一定意義。

盾葉薯蕷，薯蕷皂苷，鼠李糖，提取

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

盾葉薯蕷 陜西省安康市采購;鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):20080928) 北京畢特博生物技術(shù)有限責(zé)任公司;活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;硫酸、氫氧化鈣、甲醇、葡萄糖、活性炭、丙三醇、乙酸乙酯、冰醋酸等 均為分析純。

SC-Ⅲ型多頻聲化學(xué)發(fā)生器 成都市九洲機(jī)電工程研究所;BS2202S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司;7230G型可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。

1.2 酸解液的制備［12］

干黃姜經(jīng)粉碎研磨(粗粉40～60目)，準(zhǔn)確稱取10g，以體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇為萃取劑，與用量為17.408×10-3mol/L的十二烷基硫酸鈉混勻。在黃姜與乙醇的質(zhì)量比為1∶10，超聲波頻率為25.8kHz，超聲時(shí)間為40min的條件下，進(jìn)行總皂苷的提取，完畢后抽濾，將濾液濃縮，加入濃度為1.5mo/L的硫酸20mL，于電熱套內(nèi)水解4h，完畢后抽濾，濾渣沖洗至中性后烘干，可于索氏提取器內(nèi)提取制備皂苷元，濾液即為酸解液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 鼠李糖的提取

酸解液中加入Ca(OH)2調(diào)節(jié)pH至中性或者偏酸性，過濾除去CaSO4沉淀，于濾液中加入活性炭進(jìn)行脫色，過濾除去色素，得到無明顯顏色的濾液。然后加入2%的活化酵母，36℃恒溫發(fā)酵，用薄層色譜法跟蹤測(cè)定葡萄糖，待其耗盡即可終止發(fā)酵，過濾除去雜質(zhì)，將濾液進(jìn)行鼠李糖含量測(cè)定并計(jì)算得率。濾液濃縮后用甲醇重結(jié)晶，可得鼠李糖晶體。

1.4 脫色條件優(yōu)化

對(duì)中和后的酸解液進(jìn)行脫色，脫色效果好壞直接影響產(chǎn)品的獲得，是本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重要步驟。以波長為446nm下的吸光度為指標(biāo)［13］，來衡量脫色效果。分別以脫色溫度、活性炭用量、脫色時(shí)間和酸解液pH四個(gè)條件做單因素實(shí)驗(yàn)，然后設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)脫色條件進(jìn)行優(yōu)化。

脫色率(%)=(酸解液吸光度-脫色液吸光度)/酸解液吸光度×100%

1.5 鼠李糖的測(cè)定與分析

1.5.1 鼠李糖含量的測(cè)定 采用DNS法進(jìn)行鼠李糖含量的測(cè)定［14］。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液置于試管中，用蒸餾水補(bǔ)足到0.5mL，然后分別加入1.5mL的DNS試劑，混勻后于沸水中加熱5min，冷卻后再分別加入4mL蒸餾水，混勻，以未加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的試管為對(duì)照，在540nm的波長下測(cè)定吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，葡萄糖在0～0.498g/L的范圍內(nèi)與吸光度(A)呈良好的線性關(guān)系。回歸方程為:y=0.50543x-0.01005，R2=0.9987。

得率的計(jì)算:得率(%)=鼠李糖質(zhì)量/盾葉薯蕷原料質(zhì)量×100%

1.5.2 薄層色譜分析 薄層色譜條件為:展開劑:V (乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(醋酸)∶V(水)=60∶15∶15∶10;顯色劑:10%硫酸乙醇溶液;Rf值=0.76，斑點(diǎn)為圓形且無拖尾;噴濕潤后于100℃烘烤10min，得到鼠李糖斑點(diǎn)，與標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)一致［15］。

1.6 處理后水質(zhì)測(cè)定

分別對(duì)酸解液和處理后的排放液進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定，查看是否符合國家標(biāo)準(zhǔn)。各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定方法為:化學(xué)需氧量的測(cè)定:參照文獻(xiàn)［16］;銨含量的測(cè)定:參照文獻(xiàn)［17］;氯化物含量的測(cè)定:參照文獻(xiàn)［18］;色度的測(cè)定:參照文獻(xiàn)［19］。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸解液脫色條件的優(yōu)化

2.1.1 脫色溫度對(duì)脫色效果的影響 在pH為6，脫色時(shí)間為40min，活性炭用量為1%的條件下，分別改變脫色溫度，考察脫色溫度與吸光度之間的關(guān)系。由圖1可知，溫度在60℃以下時(shí)，脫色效果不好，但吸光度隨著溫度的增加呈下降趨勢(shì)。當(dāng)溫度到達(dá)60℃以后，吸光度基本持平，達(dá)到一個(gè)較平穩(wěn)的狀態(tài)。說明在相對(duì)低溫時(shí)不利于活性炭的吸附作用，考慮經(jīng)濟(jì)因素，選用60℃為最佳脫色溫度。

圖1 脫色溫度與吸光度的關(guān)系

2.1.2 活性炭用量對(duì)脫色效果的影響 在pH為6，脫色溫度為60℃，脫色時(shí)間為40min的條件下，分別改變活性炭的用量，考察活性炭用量與吸光度之間的關(guān)系。由圖2可知，當(dāng)活性炭用量較小時(shí)，脫色效果并不好，隨著用量增加達(dá)到1.5%時(shí)，繼續(xù)增加用量，脫色效果差別不大?？梢酝茰y(cè)，在活性炭用量達(dá)到1.5%以后，色素已經(jīng)基本吸附完全，考慮經(jīng)濟(jì)因素，選用1.5%為最佳活性炭用量。

圖2 活性炭用量與吸光度的關(guān)系

2.1.3 脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響 在pH為6，脫色溫度為60℃，活性炭用量為1.5%的條件下，分別改變脫色時(shí)間，考察脫色時(shí)間與吸光度之間的關(guān)系。由圖3可知，隨著脫色時(shí)間的增加，吸光度逐漸減少，脫色效果越來越好，當(dāng)脫色40min后，脫色效果基本達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，選用40min為最佳脫色時(shí)間。

表3 水質(zhì)測(cè)定結(jié)果

圖3 脫色時(shí)間與吸光度的關(guān)系

2.1.4 酸解液pH對(duì)脫色效果的影響 在脫色溫度為60℃，活性炭用量為1.5%，脫色時(shí)間為40min的條件下，分別改變酸解液pH，考察酸解液pH與吸光度之間的關(guān)系。由圖4可知，pH較高時(shí)反而脫色效果不好，在pH為3左右時(shí)，能得到較好的脫色效果，因此最佳酸解液pH為3。

圖4 酸解液pH與吸光度的關(guān)系

2.1.5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化 正交實(shí)驗(yàn)的各因素和水平選擇如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析如表2所示。各因素影響次序?yàn)锳＞C＞D＞B，即對(duì)脫色效果影響最大的因素是活性炭加入量，然后依次是脫色溫度，酸解液pH和脫色時(shí)間;根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析，得到的優(yōu)化條件為 A2B2C3D1，即活性炭加入量為1.5%，脫色時(shí)間為40min，脫色溫度為70℃，酸解液pH為2。

根據(jù)優(yōu)化工藝條件，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，吸光度分別為0.010、0.011、0.013，平均吸光度為0.0113，表明工藝穩(wěn)定可靠。經(jīng)測(cè)定，未脫色酸解液的吸光度為1.569，根據(jù)1.4的脫色率計(jì)算公式，得到平均脫色率為99.28%。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 鼠李糖測(cè)定結(jié)果與分析

在脫色液里放入酵母發(fā)酵，可以有效地除去葡萄糖。根據(jù)酵母生產(chǎn)商的建議，確定發(fā)酵溫度為36℃，酵母用量為2%，pH在中性或偏酸性左右。發(fā)酵時(shí)間用薄層色譜法跟蹤觀察確定，當(dāng)發(fā)酵5h后，平板上葡萄糖斑點(diǎn)完全消失，因此確定發(fā)酵時(shí)間為5h。

根據(jù)1.5.1的測(cè)定方法，分別對(duì)未發(fā)酵糖液和發(fā)酵后糖液進(jìn)行還原糖測(cè)定，測(cè)定結(jié)果為，盾葉薯蕷總還原糖的得率為2.19%，鼠李糖得率為1.5%。

2.3 處理后水質(zhì)測(cè)定結(jié)果

根據(jù)各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)酸解液和排放液進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表3所示。工業(yè)上采用直接酸解法生產(chǎn)皂素，其廢液的各項(xiàng)污染指標(biāo)都十分驚人。本實(shí)驗(yàn)采用預(yù)分離法生產(chǎn)皂素，雖然減少了酸污染，但酸解液的各項(xiàng)指標(biāo)仍然不合格，無法達(dá)到國家直接排放標(biāo)準(zhǔn)的要求。然而，通過對(duì)酸解液進(jìn)行鼠李糖的提取后，僅排放水洗液，則各項(xiàng)指標(biāo)皆符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)研究了從盾葉薯蕷皂苷酸解液中提取鼠李糖的方法，通過中和、脫色以及發(fā)酵等一系列手段，成功地獲得了鼠李糖，鼠李糖得率達(dá)1.5%。

3.2 通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，確定了脫色的最佳優(yōu)化方案:活性炭加入量為1.5%，脫色時(shí)間為40min，脫色溫度為70℃，酸解液pH為2，平均脫色率可達(dá)99.28%。

3.3 在預(yù)分離法獲得高得率皂苷元的基礎(chǔ)上，通過對(duì)酸解液的處理，既得到了具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的鼠李糖，又對(duì)強(qiáng)污染的酸解液進(jìn)行了處理，為減少污染，合理利用盾葉薯蕷資源提供了一種新思路。

3.4 通過對(duì)排放水的化學(xué)需氧量、氨氮、氯化物、pH、色度等標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定，確定符合國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，為本工藝的可行性提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

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Study on extraction of rhamnose from dioscin hydrolyzation liquid of Dioscorea zingiberensis C.H.Wright

LIU Shu-xing1，HOU Yi1，*，LI Xiang2，PENG Shu-han2
(1.College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science＆Technology，Xi’an 710021，China; 2.College of Chemistry＆Chemical Engineering，Shaanxi University of Science＆Technology，Xi’an 710021，China)

The technology of rhamnose extraction from dioscin hydrolyzation liquid was studied with Dioscorea zingiberensis C.H.Wright as the raw material.The rhamnose was successful obtained through a set of methods as crushing，dioscin extraction，acid hydrolysis，neutralization，decolorization and fermentation.Optimized process by orthogonal experiments was obtained for the best decolor conditions as active carbon addition at 1.5%，40min of decolor time，70℃ of decolor temperature，pH of hydrolyzation liquid at 2.With the conditions of 2%yeast addition and temperature of 36℃，glucose can be removed through 5h fermentation，obtained rhamnose with a yield of 1.5%.Experimental discharge water conforms to national standards，had a certain sense to improve economic value and reduce saponin industrial pollution.

Dioscorea zingiberensis C.H.Wright;dioscin;rhamnose;extraction

TS255.1

B

1002-0306(2011)09-0239-04

盾葉薯蕷(Dioscorea zingiberensis C.H.Wright)俗稱黃姜，為我國特有的薯蕷科薯蕷屬植物。其根莖富含薯蕷皂苷元(diosgenin)，是合成甾體激素和避孕類藥物的主要原料［1］。目前，工業(yè)上生產(chǎn)薯蕷皂苷元主要還是采用直接酸水解法，該法水解耗酸量大，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，且許多資源沒有得到應(yīng)用［2-3］。采用預(yù)分離法，先從黃姜中提取薯蕷皂苷，然后再進(jìn)行酸水解提取皂苷元［4］。這樣不但能減少酸的污染，而且能夠?qū)Φ矸酆吞穷愘Y源進(jìn)行利用，從而降低成本。生產(chǎn)皂苷元后殘余的酸解液是一種強(qiáng)酸性高濃度的有機(jī)廢水，其主要污染物是酸、葡萄糖、鼠李糖和色素［5］。其中皂苷水解后的糖鏈中包含一個(gè)葡萄糖和兩個(gè)鼠李糖，可作為一種生產(chǎn)鼠李糖的原料［6］。鼠李糖作為一種還原糖，主要應(yīng)用于生化研究和醫(yī)藥食品等領(lǐng)域。它是許多藥物的重要中間體，能用于合成香料，也可作為甜味劑，添加到高檔咖啡、飲料和肉質(zhì)品中，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［7-8］。本實(shí)驗(yàn)在獲得高得率的皂苷元的前提下，對(duì)水解后的酸解液進(jìn)行了處理。利用中和法和活性炭吸附作用可以除去酸和色素，應(yīng)用葡萄糖的可發(fā)酵性，以及鼠李糖溶于甲醇而葡萄糖不溶于甲醇的特性［9-10］，可以除去葡萄糖，從而得到鼠李糖產(chǎn)品。這樣不但提高了皂苷元產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，而且經(jīng)過處理后出水水質(zhì)符合《皂素工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》［11］。

2010-11-19 *通訊聯(lián)系人

劉樹興(1962-)，男，碩士，教授，主要從事食品加工與食品添加劑的研究。

陜西省自然科學(xué)基金(2007C125);陜西省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目。