曾 俊，楊國(guó)龍，畢艷蘭，張 潔，孫尚德

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450052)

乙醇溶液體系中Span修飾豬胰脂酶的研究

曾 俊，楊國(guó)龍*，畢艷蘭，張 潔，孫尚德

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450052)

在乙醇-水溶液體系中采用Span系列表面活性劑對(duì)豬胰脂酶進(jìn)行了修飾，以其催化酯交換的交換量為指標(biāo)衡量修飾的效果，并且比較了修飾酶與未修飾酶的熱穩(wěn)定性差異。結(jié)果表明:40℃下30min即可完成Span對(duì)豬胰脂酶的修飾，但各種表面活性劑修飾的最佳條件并不相同。Span20修飾脂肪酶的最佳條件是水與乙醇的比例為4∶1(v/v)，Span20用量為25%;Span40修飾豬胰脂酶的最佳條件是水與無(wú)水乙醇的比例為2∶1(v/v)，Span40用量為20%; Span65修飾豬胰脂酶的最佳條件為水與無(wú)水乙醇的比例為1∶1(v/v)，Span65的用量為20%;Span60、Span80和Span85修飾脂肪酶的最佳條件是水與無(wú)水乙醇的比例為3∶1(v/v)，用量均為20%。通過(guò)修飾后酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)可以看出，六種表面活性劑修飾的酶在30～70℃間催化反活性都高于未修飾酶，在40℃下，修飾酶的催化活性基本達(dá)到最高，而未修飾酶要70℃才能達(dá)到最高催化活性。Span60修飾脂肪酶的效果優(yōu)于其它五種表面活性劑。

豬胰脂酶，Span，修飾，乙醇溶液

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬胰脂酶 購(gòu)于Novo公司;茶油 購(gòu)于河南信陽(yáng)長(zhǎng)園野生茶油有限公司;棕櫚酸、Span表面活性劑購(gòu)于Sigma公司;其他化學(xué)試劑 均購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純。

氣相色譜儀 Agilent6890N，美國(guó)Agilent公司;色譜柱 BPX-70(30.0m×250μm×0.25μm)，澳大利亞SGE公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬胰脂酶的修飾

1.2.2 修飾前后脂肪酶促酯交換反應(yīng)催化活性的測(cè)定 稱(chēng)取3g茶油于50mL燒瓶中，加入一定量棕櫚酸，反應(yīng)底物比為棕櫚酸∶茶油=2∶1(mol/mol)，加入脂肪酶為茶油重的15%(m/m)，加入異辛烷30mL，體系含水量為體系總重的0.5%，在40℃下攪拌反應(yīng)4h。分離混合物中的甘三酯，進(jìn)氣相分析脂肪酸組成。以4h后的酯交換量來(lái)評(píng)價(jià)脂肪酶修飾前后的催化活性。催化活性(酯交換反應(yīng)的交換量) =產(chǎn)物甘三酯中棕櫚酸的百分含量-原料茶油中棕櫚酸的百分含量。

1.2.3 甘三酯脂肪酸組成分析 將0.5mL反應(yīng)產(chǎn)物溶解于1.0mL石油醚中，然后進(jìn)行薄層層析(吸附劑為硅膠G，展開(kāi)劑為石油醚-無(wú)水乙醚-甲酸混合物，石油醚∶無(wú)水乙醚∶甲酸=70∶30∶1，v/v/v)，再將薄層板置于通風(fēng)櫥中晾干，并將2，7-二氯熒光素均勻地噴在薄層板上，晾干后放于紫外分析儀上觀察并刮下甘三酯譜帶［7］。

將從薄層板上刮下的甘三酯譜帶(甘三酯與硅膠的混合物)溶于 2.5mL正己烷中，加入 1mL 0.5mol/L甲醇鈉溶液，室溫下輕搖5min，然后加入少量無(wú)水硫酸鈉，靜置1h后，于2000～3000r/min離心2～3min，取上清液用于GC分析［7］。

原料茶油及酶催化反應(yīng)產(chǎn)物甘三酯脂肪酸組成分析條件:氣相色譜儀:Agilent6890N;色譜柱:BPX-70 (30.0m×250μm×0.25μm);進(jìn)樣口溫度:230℃;柱溫: 180℃;檢測(cè)器溫度:300℃;氮?dú)饬魉?1.5mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 水與無(wú)水乙醇的比例對(duì)修飾效果的影響

無(wú)水乙醇與水的比例對(duì)修飾效果的影響見(jiàn)圖1。就Span20修飾豬胰脂酶的效果而言，催化活性隨無(wú)水乙醇用量的減小先增加后減小，水與無(wú)水乙醇的比例為4∶1(v/v)時(shí)豬胰脂酶的催化活性達(dá)到極大值;用Span40修飾豬胰脂酶時(shí)，催化活性隨無(wú)水乙醇用量的減小先增加后減小，水與無(wú)水乙醇的比例為2∶1(v/v)時(shí)豬胰脂酶的催化活性達(dá)到極大值;用Span60修飾豬胰脂酶時(shí)，其活性隨乙醇用量的減小而逐漸增加，水與無(wú)水乙醇的比例大于3∶1(v/v)以后，豬胰脂酶的催化活性較高并趨于穩(wěn)定;用Span65修飾豬胰脂酶時(shí)，催化活性隨無(wú)水乙醇用量的減小先增加后減小，水與無(wú)水乙醇的比例為1∶1(v/v)時(shí)豬胰脂酶的催化活性達(dá)到極大值;用 Span80和Span85修飾豬胰脂酶時(shí)，催化活性隨無(wú)水乙醇用量的減小先增加后減小，水與無(wú)水乙醇的比例為3∶1 (v/v)時(shí)豬胰脂酶的催化活性達(dá)到極大值。Kamiya等［8］研究表面活性劑修飾過(guò)程中采用緩沖溶液/乙醇(v/v)混合體系，在乙醇體積占總體積的0%～20%時(shí)，對(duì)修飾酶活性略有提高，混合體系可以提高表面活性的分散性，而且還可以改變酶的溶解性。

圖1 水與無(wú)水乙醇的比例對(duì)豬胰脂酶修飾效果的影響注:攪拌時(shí)間:30min;Span用量:25%(Span占豬胰脂酶與Span總量的質(zhì)量百分?jǐn)?shù));溫度:40℃。

2.2 Span用量對(duì)修飾效果的影響

Span占Span和酶總重的百分比對(duì)修飾酶催化反應(yīng)活性的影響見(jiàn)圖2。由圖可以看出，對(duì)于Span40、65、80和85來(lái)說(shuō)，在用量為20%時(shí)修飾效果達(dá)到最佳，增加Span的用量對(duì)酶的修飾并沒(méi)有很大的影響;Span60在用量為20%修飾效果最佳，隨后增大用量，修飾效果略有下降;Span20最佳的修飾用量為25%。較低和較高的Span用量都會(huì)降低對(duì)豬胰脂酶的修飾效果。Thakar等［9］研究發(fā)現(xiàn)，修飾過(guò)程中表面活性劑的種類(lèi)和用量對(duì)修飾酶催化酯交換反應(yīng)有重要的影響，非離子型表面活性劑修飾效果比陽(yáng)離子型的效果好，陰離子型表面活性劑會(huì)抑制修飾酶活力，修飾過(guò)程中較低的表面活性劑用量能顯著提高修飾酶的活性。

圖2 Span用量對(duì)豬胰脂酶修飾效果的影響

2.3 攪拌時(shí)間對(duì)修飾效果的影響

由圖3可以看出，對(duì)于六種表面活性劑修飾的豬胰脂酶，在攪拌時(shí)間為30min時(shí)，催化酯交換的催化活性最高，隨著攪拌時(shí)間的增加，催化酯交換的催化活性略有下降，Span65修飾的豬胰脂酶最為明顯。由此可見(jiàn)，對(duì)于六種表面活性劑來(lái)說(shuō)，修飾最佳的攪拌時(shí)間為30min，較長(zhǎng)或者較短的攪拌時(shí)間，都會(huì)降低酶催化酯交換反應(yīng)的催化活性。

圖3 攪拌時(shí)間對(duì)豬胰脂酶修飾效果的影響

2.4 脂肪酶熱穩(wěn)定性

對(duì)六種表面活性劑修飾酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，主要研究了在30、40、50、60、70、80℃下修飾酶催化酯交換的反應(yīng)，并用未修飾酶在相同溫度下反應(yīng)進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 修飾酶與未修飾酶的熱穩(wěn)定性

由圖4可以看出，六種表面活性劑修飾的酶，在30～70℃間，催化活性都高于未修飾酶，是未修飾脂肪酶的1.5～2倍;在40℃時(shí)催化活性基本達(dá)到最高，40～70℃間的催化活性基本不變，未修飾酶在70℃時(shí)催化活性才能達(dá)到最高。80℃時(shí)修飾酶和未修飾酶的催化活性均急速下降，高溫導(dǎo)致酶失活的緣故; Span60修飾的脂肪酶在相同溫度下的催化活性均高于其它五種。

3 結(jié)論

在乙醇-水溶液體系中采用Span系列表面活性劑對(duì)豬胰脂酶進(jìn)行修飾，以催化酯交換反應(yīng)的交換量為指標(biāo)，研究修飾條件對(duì)豬胰脂酶修飾效果的影響。研究發(fā)現(xiàn):40℃下30min即可完成Span對(duì)豬胰脂酶的修飾，但各種表面活性劑修飾的最佳條件并不相同。Span20修飾脂肪酶的最佳條件是水與乙醇的比例為4∶1(v/v)，Span20用量為25%;Span40修飾豬胰脂酶的最佳條件是水與無(wú)水乙醇的比例為2∶1 (v/v)，Span40用量為20%;Span65修飾豬胰脂酶的最佳條件為水與無(wú)水乙醇的比例為1∶1(v/v)，Span65的用量為20%;Span60、Span80和Span85修飾脂肪酶的最佳條件是水與無(wú)水乙醇的比例為3∶1 (v/v)，用量均為20%。通過(guò)修飾后酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)可以看出，六種表面活性劑修飾的酶，在30～70℃間催化活性都高于未修飾酶，在40℃下，修飾酶的催化活性基本達(dá)到最高，而未修飾酶要在70℃才能達(dá)到最高催化活性。Span60修飾脂肪酶的效果優(yōu)于其它五種表面活性劑。

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Modification of porcine pancreas lipase by Span in ethanol solution

ZENG Jun，YANG Guo-long*，BI Yan-lan，ZHANG Jie，SUN Shang-de
(School of Food Science and Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450052，China)

The porcine pancreas lipase was modified by Span in the ethanol-water solution，the effectiveness of the modification of the porcine pancreas lipase was determined by incorporation of interesterification of oils catalyzed by them，and the thermal stability of the modified lipase and the original lipase were investigated.The results indicated that the modification was finished for 30min at 40℃，however the optimum conditions for Span were different.For Span20，the optimum conditions were the ratio of water to ethanol 4∶1(v/v)，the amount of Span20 25%.For Span40，the optimum conditions were the ratio of water to ethanol 2∶1(v/v)，the amount of Span40 20%. For Span65，the optimum conditions were the ratio of water to ethanol 1∶1(v/v)，the amount of Span65 20%.For Span60，Span80 and Span85，the optimum conditions were the ratio of water to ethanol 3∶1(v/v)，the amount of them 20%.The the catalytic activity of the modified lipase was increased comparison to that of the native lipase in the rang of 30～70℃，the modified lipases showed the better catalytic activity in the range of 40～70℃，while the native lipases showed the better catalytic activity at 70℃.The modification effectiveness of Span60 was better than those of others.

porcine pancreas lipase;Span;modification;ethanol solution

TS201.2+5

A

1002-0306(2011)09-0187-03

脂肪酶除了能催化甘油酯類(lèi)化合物的水解和合成之外，還可以催化酯交換反應(yīng)、多肽合成和藥物的合成等，尤其是利用脂肪酶的立體專(zhuān)一性催化合成一些特殊結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，因而脂肪酶在食品、日用化學(xué)、油脂化學(xué)以及藥物合成等許多領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用［1］。脂肪酶廣泛存在于原核生物和真核生物中，按其來(lái)源可分為三種:動(dòng)物酶、植物酶和微生物酶［2］。脂肪酶催化的反應(yīng)是一種界面反應(yīng)，脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性和其在界面上的分布狀態(tài)決定催化活性［3］。脂肪酶通過(guò)化學(xué)修飾后，改變了脂肪酶的表面特性，使底物和脂肪酶更容易發(fā)生接觸，從而提高反應(yīng)速率［4］。Banu Babali等［5］研究在水溶液體系中采用Span 60修飾脂肪酶，修飾后的脂肪酶在異辛烷體系中催化薄荷醇與月桂酸的酯化反應(yīng)，修飾酶催化反應(yīng)1h后酯化率81%，4h后達(dá)94%，而未修飾酶在72h后才達(dá)到93%。Sobhi Basheer等［6］研究采用糖酯修飾的脂肪酶在正己烷體系中催化脂肪醇和長(zhǎng)碳鏈脂肪酸的酯化反應(yīng)，與未修飾酶相比，修飾脂肪酶能提高反應(yīng)速率。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來(lái)看，失水山梨醇脂肪酸酯(Span系列)是多元醇的部分脂肪酸酯，它屬于非離子表面活性劑，是一種優(yōu)良的油包水或水包油型表面活性劑，廣泛地用在食品、化妝品和醫(yī)藥等精細(xì)化工領(lǐng)域。本文研究在醇溶液體系中采用Span系列表面活性劑修飾豬胰脂酶，S20、S40、S60、S65、S80和 S85分別代表 Span20、Span40、Span60、 Span65、Span80和Span85，探討了最佳的修飾條件和修飾條件對(duì)修飾效果的影響。

2010-10-11 *通訊聯(lián)系人

曾俊(1985-)，男，碩士研究生，研究方向:油脂化學(xué)。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071558);河南工業(yè)大學(xué)校科研基金(08XZZ027)。