羅堾子，張 弘，鄭 華，許 玉，張加研，甘 瑾，涂行浩

(1.西南林業(yè)大學材料工程學院，云南昆明650224; 2.中國林業(yè)科學研究院資源昆蟲研究所，云南昆明650224; 3.西南林業(yè)大學林學院，云南昆明650224)

超聲波微波協(xié)同提取瑪咖總生物堿

羅堾子1，2，張 弘2，*，鄭 華2，許 玉3，張加研1，甘 瑾2，涂行浩2

(1.西南林業(yè)大學材料工程學院，云南昆明650224; 2.中國林業(yè)科學研究院資源昆蟲研究所，云南昆明650224; 3.西南林業(yè)大學林學院，云南昆明650224)

為研究瑪咖中總生物堿的含量，本實驗利用超聲波微波協(xié)同提取瑪咖總生物堿，并在單因素超聲波功率、微波功率、處理時間、液料比等四個條件下進行優(yōu)化，結果表明:超聲波微波協(xié)同處理有助于瑪咖總生物堿的提取，最佳提取條件為超聲波功率300W、微波功率352W、超聲波微波共同作用時間1.2min、液料比60∶1(mL/g)，瑪咖總生物堿含量可達0.69%，比傳統(tǒng)方法索氏提取中瑪咖總生物堿含量高8.7%。

超聲波，微波，瑪咖，生物堿

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干制瑪咖 由中國林業(yè)科學院資源昆蟲研究所滇中高原實驗站提供;鹽酸小檗堿 Aladdin Chemistry Co.，Ltd.;鹽酸 重慶川東化工(集團)有限公司;95%乙醇、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水氯化鈣 天津市風船化學試劑科技有限公司;氯仿 云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司;溴麝香草酚藍 上海試劑三廠。

DYQ參茸切片機、116搖擺式六兩裝高速中藥磨粉機 浙江省瑞安市永歷制藥機械有限公司; HR83-P型快速鹵素水分測定儀、AB204-S精密型電子天平 梅特勒-托利多(中國)有限公司;超聲波微波組合反應系統(tǒng) 南京先歐生物科技有限公司; Z323K高速離心機 德國赫默公司;旋轉蒸發(fā)儀日本東京理化儀器有限公司;DU800紫外可見光分光光度計 美國貝克曼庫爾特有限公司;TY742X2A純水機 美國Barnstead公司;實驗室常規(guī)玻璃儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物堿提取液的制備 將瑪咖切片，磨粉備用，測得含水率為9.87%，取一定質量的瑪咖干粉分散在0.5%鹽酸的95%乙醇溶液［16］，用超聲波微波協(xié)同處理后，過濾，得瑪咖乙醇提取溶液，濃縮為浸膏。然后用質量分數(shù)2%HCl溶液洗滌溶解，共洗滌3次，合并酸液，10000r/min離心15min。取酸溶液，用質量分數(shù)10%NaOH調(diào)至pH10，再用等體積氯仿萃取3次，合并萃取液并定容至25mL［17］。

1.2.2 標準曲線的制作

1.2.2.1 溶液的配制 溴麝香草酚藍顯色劑配制：稱取溴麝香草酚藍0.1250g，溶于1000mL的pH為7的磷酸緩沖溶液中，顯色劑濃度為2.0×10-4mol/L。緩沖溶液由0.2mol/L Na2HPO4·12H2O與0.2mol/L NaH2PO4·2H2O配制而成。

1.2.2.2 酸性染料比色法最大吸收波長掃描 取1.0mL氯仿溶液為空白，取瑪咖總生物堿提取液0.5mL和對照品溶液0.5mL，加氯仿至1.0mL，分別在空白、樣品和對照品溶液中加入2.0×10-4mol/L溴麝香草酚藍顯色劑6.0mL，氯仿5.0mL，密塞振搖2min，倒入分液漏斗中，靜置2h，取氯仿層4.0mL，在氯仿溶液中加入無水硫酸鈉(105℃干燥4h)0.2g，搖勻，放置10min，于300～700nm范圍內(nèi)掃描測定最大吸收波長。

1.2.2.3 鹽酸小檗堿標準曲線 精密稱取在105℃干燥至恒重的鹽酸小檗堿對照品5.0mg，置于25mL容量瓶中，加氯仿至刻度，搖勻，得到200μg/mL對照品溶液，放入4℃冰箱冷藏備用。精密量取對照品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL［16］，加氯仿至1mL。再加入pH7.0的2.0×10-4mol/L溴麝香草酚藍顯色劑6.0mL，氯仿5.0mL，密塞振搖2min，倒入分液漏斗中，靜置2h，取氯仿層4.0mL，在氯仿層中分別加入無水硫酸鈉0.2g，搖勻，放置10min，以未加鹽酸小檗堿的實驗樣為空白對照，于最大吸收波長處測定吸光度。以鹽酸小檗堿對照品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得出線性回歸方程［17］。

1.2.3 對照實驗 用索氏提取法提取瑪咖中的生物堿，并與超聲波微波協(xié)同處理法比較。將干燥的瑪咖粉末，稱取2.0g用濾紙包好，將其置于索氏提取器中，加入0.5%鹽酸的95%乙醇溶液150mL。水浴溫度為90～100℃，提取3次后，將每次提取液混合，此為瑪咖乙醇提取液［18］。后續(xù)處理參照實驗1.2.1得生物堿溶液。

1.2.4 生物堿的測定 參照實驗1.2.2.3中的方法測定，并將所得吸光度代入回歸方程，求得瑪咖乙醇液中總生物堿的含量。

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 超聲波功率 稱取瑪咖干粉 5.0g，加入100mL 0.5%鹽酸的95%乙醇溶液，分別在超聲波功率為100、150、200、250、300、350、400W下超聲90s (脈沖時間4s，間隙時間4s)，同時控制微波功率300W，微波時間1.5min，控制溫度不超過90℃，超聲波微波協(xié)同處理后，過濾，得瑪咖乙醇提取溶液。按實驗1.2.1進行處理，得生物堿提取液，再按實驗方法1.2.2.3測定總生物堿的含量。

1.2.5.2 微波功率 稱取瑪咖干粉5.0g，加入100mL 0.5%鹽酸的95%乙醇溶液，在已確定好的最佳超聲波功率下超聲90s(脈沖時間4s，間隙時間4s)，分別控制微波功率100、150、200、250、300、350、400W，微波時間1.5min，控制溫度不超過90℃，超聲波微波協(xié)同處理后，過濾，得瑪咖乙醇提取溶液。按實驗1.2.1進行處理，得生物堿提取液，再按實驗方法1.2.2.3測定總生物堿的含量。

1.2.5.3 超聲波微波共同處理時間 其他條件同實驗1.2.5.1，并在實驗1.2.5.1和1.2.5.2確定的最優(yōu)超聲波功率和微波功率下，用超聲波微波共同處理0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1min，按實驗1.2.1進行處理，得生物堿提取液，再按實驗方法1.2.2.3測定總生物堿的含量。

1.2.5.4 液料比 其他條件同實驗1.2.5.3，分別按液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1(mL/g)取對應體積0.5%鹽酸的95%乙醇溶液，在上述實驗所確定的最佳超聲波功率、微波功率和時間下進行處理，測定總生物堿的含量。

1.2.6 響應曲面實驗設計 根據(jù)單因素實驗結果，選擇超聲波功率、微波功率、超聲波微波共同作用時間和液料比4個因素作為響應變量，利用Designexpert8.0軟件，按照Box-Behnken的中心組合實驗設計原理，以瑪咖乙醇提取液中總生物堿的含量為響應值，通過響應面曲面分析進行制備條件的優(yōu)化，從而得到最優(yōu)制備條件。各實驗組的編碼與取值見表1。

表1 響應面分析實驗因素水平表

1.2.7 驗證實驗 在響應曲面法優(yōu)化出的最佳條件下進行實驗，將實驗實際得到的瑪咖總生物堿含量與預測值相比較。

1.2.8 提取級數(shù)［19］在已確定好的最佳超聲波功率，微波功率，超聲波微波共同處理時間及液料比下，取對應瑪咖干粉與0.5%鹽酸的95%乙醇溶液，處理后過濾，得瑪咖乙醇提取溶液，按實驗1.2.1進行處理，得生物堿提取液，再按實驗方法1.2.2.3測定總生物堿的含量。再加入等量溶劑再次提取，重復到瑪咖總生物堿幾乎不再溶出。

表2 實驗方案和結果

2 結果與分析

2.1 酸性染料比色法最大吸收波長的確定

樣品和對照品溴麝香草酚藍顯色后波長掃描詳見圖1，其中樣品波長掃描曲線最大波長為411nm，對照品最大波長為414nm。樣品吸收峰和對照品吸收峰略有差異，以樣品吸收峰為準，因此選擇411nm為測定波長。

圖1 對照品和樣品溴麝香草酚藍顯色后波長掃描

2.2 鹽酸小檗堿標準曲線

鹽酸小檗堿標準曲線詳見圖2，由圖2可知，鹽酸小檗堿濃度與吸光度值的線性回歸方程為A= 0.0079c-0.0056，R2=0.9995，結果表明，其線性關系良好。

圖2 鹽酸小檗堿標準曲線

2.3 對照實驗結果

用索氏提取法提取測得的瑪咖總生物堿含量為0.63% ±0.02%。

2.4 單因素實驗結果

超聲波功率、微波功率、超聲波微波共同處理時間、液料比四因素對瑪咖總生物堿含量的影響詳見圖3。由圖3可知，各因素以含量最高為依據(jù)，超聲波功率選擇200W，微波功率選擇350W，處理時間選擇1.5min，料液比選擇50∶1(mL/g)。

2.5 響應曲面分析

結合單因素實驗結果，按Box-Behnken實驗方案進行四因素三水平實驗，所得結果見表2。表2中有24個析因實驗，5個中心實驗，用來估計實驗誤差。將所得的實驗數(shù)據(jù)用Design Expert軟件進行多元回歸擬合，得到以瑪咖總生物堿含量為目標函數(shù)的二次多項回歸方程如下：

表3 響應面二次模型方差分析結果

圖3 各單因素對瑪咖生物堿含量的影響

設計的方差回歸分析結果如表3所示。由表3可知，所選用的二次多項模型不顯著(P=0.7313＞0.05)。失擬項在 α=0.05水平上亦不顯著(P= 0.3906＞0.05)?；貧w方程各項的方差分析結果表明，該模型中各項均不顯著。

超聲波功率、微波功率、時間以及液料比兩兩交互作用對瑪咖總生物堿含量的響應曲面圖如圖4所示。

2.6 驗證實驗

根據(jù)Box-Behnken實驗所得的結果和二次多項回歸方程，利用Design Expert8.0獲得各個因素的最佳提取組合為超聲波 300W，微波 352W，時間1.2min，液料比60∶1(mL/g)。在此條件下瑪咖總生物堿含量理論可達0.72%。為檢驗模型預測的準確性，在最佳條件下進行瑪咖總生物堿的提取，做3組平行實驗所得結果為0.69%±0.03%。由此可知，采用響應面分析法對瑪咖總生物堿最佳提取條件的優(yōu)化是可行的。

2.7 提取級數(shù)

瑪咖總生物堿提取級數(shù)見圖5。由圖5可知，前3次的瑪咖總生物堿含量已占五次提取總含量的94.83%，因此提取級數(shù)定為3級即可。

3 結論

3.1 瑪咖總生物堿最佳提取組合為超聲波300W，微波352W，時間1.2min，液料比60∶1(mL/g)。在此條件下瑪咖總生物堿含量理論可達0.72%，實際可達0.69%±0.03%，比傳統(tǒng)方法索氏提取中瑪咖總生物堿含量高8.7%，由此可知，利用新型提取技術超聲波微波協(xié)同提取瑪咖總生物堿效果更佳。

3.2 瑪咖總生物堿提取級數(shù)選定為3級。

圖4 各因素交互作用影響瑪咖生物堿含量的響應曲面圖

圖5 瑪咖總生物堿提取級數(shù)

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Combined ultrasonic-microwave extraction of alkaloids from maca(Lepidium meyenii)

LUO Chun-zi1，2，ZHANG Hong2，*，ZHENG Hua2，XU Yu3，ZHANG Jia-yan1，GAN Jin2，TU Xing-hao2
(1.College of Materials Engineering，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China; 2.Research Institute of Resources Insects，Chinese Academy of Forestry，Kunming 650224，China; 3.College of Forestry，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China)

In order to research the alkaloids of maca，ultrasonic wave and microwave collaborative were used to extract alkaloids of maca.The ultrasonic power，ultrasonic power，time and solution to solid ratio was studied by conducting single factor tests.The optimization results showed that the collaborative of ultrasonic and microwave was in favour of extracting alkaloids of maca.The best condition was that ultrasonic power was 300W，microwave power was 352W，time was 1.2min，solution to solid ratio ratio were 60∶1(mL/g)，and the content of alkaloids of maca can reach 0.69%，was 8.7%higher than Soxhlet extraction method.

ultrasonic;microwave;maca(Lepidium meyenii);alkaloids

TS201.2

A

1002-0306(2011)12-0354-05

瑪咖(Lepidium meyenii Walp.)，十字花科獨行菜，屬一年生或兩年生草本植物，原產(chǎn)于秘魯安第斯山區(qū)［1］，其塊根可以藥食兼用，具有悠久歷史，近十多年來更逐漸成為開發(fā)的熱點之一?，斂е袪I養(yǎng)物質豐富，化學成分多樣，主要包括：蛋白質和氨基酸、脂肪酸、還原糖、礦物質元素［2］，以及多種次生代謝產(chǎn)物(生物堿、芥子油苷和異硫氰酸酯、甾醇及其衍生物、單寧等)。另有大量研究表明，瑪咖可抗疲勞、抗氧化、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、緩解更年期綜合癥、抑制癌細胞、治療風濕、貧血、抑郁癥等多種功效［3-10］。生物堿是含負氧化態(tài)氮原子的環(huán)狀化合物［11］，廣泛存在于生物有機體中。適量的生物堿對人體具有鎮(zhèn)痛、消炎、降壓、抑菌、抗氧化及抗癌等多種生理活性［12］，因此研究瑪咖中總生物堿的含量具有重要意義。總生物堿含量定量分析方法常用方法有滴定法和酸性染料比色法、薄層掃描法、高效液相色譜法、毛細管電泳法和氣相色譜法等［13］，本實驗采用操作相對簡單、穩(wěn)定性、重復性較好、靈敏度高、準確可靠的酸性染料比色法進行測定。超聲波和微波萃取技術均具有快捷、高效、安全的特點［14-15］，近年來被廣泛用于食品、生物醫(yī)學、造紙業(yè)、環(huán)境科學、化學化工等領域，本研究采用超聲波-微波協(xié)同萃取，充分利用超聲波的空化作用及微波的高能作用，以加快提取瑪咖中的總生物堿。

2011-08-31 *通訊聯(lián)系人

羅堾子(1987-)，女，碩士研究生，主要從事林產(chǎn)化學與加工研究。

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201004028)。