張科平，鄭 宇，賈鈞輝，駱健美，王 敏

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室(天津科技大學(xué))，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457)

巴斯德醋酸桿菌AC2005乙醇脫氫酶基因克隆與蛋白序列分析

張科平，鄭 宇，賈鈞輝，駱健美，王 敏*

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室(天津科技大學(xué))，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457)

以具有優(yōu)良醋酸發(fā)酵性能的巴斯德醋酸桿菌AC2005基因組DNA為模板，利用PCR的方法分別克隆了編碼乙醇脫氫酶亞基I和乙醇脫氫酶亞基 II的基因adhA和adhB。序列分析表明，adhA與 GenBank已報道的序列(accession number:D13893.1)具有94%的同源性，氨基酸序列同源性達(dá)98%;adhB與 GenBank已報道的序列(accession number:D13893.1)同源性為93%，氨基酸序列同源性達(dá)97%。利用TMHMM 2.0軟件，對乙醇脫氫酶跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)乙醇脫氫酶亞基I和乙醇脫氫酶亞基II均為膜結(jié)合蛋白。利用Swiss－Model在線軟件模擬了巴斯德醋酸桿菌AC2005乙醇脫氫酶亞基I的三維立體結(jié)構(gòu)。該研究對該酶的結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步分析提供了基礎(chǔ)。

巴斯德醋酸桿菌，乙醇脫氫酶，基因克隆，序列分析

醋酸是食醋的主要成分。醋酸發(fā)酵是利用醋酸菌(Acetic Acid Bacteria)完成從乙醇到醋酸的氧化反應(yīng)，醋酸菌中含有多種乙醇氧化酶，其中結(jié)合于細(xì)胞膜上依賴 PQQ作為輔酶的乙醇脫氫酶(Alcohol Dehydrogenase，ADH)和乙醛脫氫酶 (Aldehyde Dehydrogenase，ALDH)是醋酸發(fā)酵過程中起主要作用的酶［1］。醋桿菌屬(Acetobacter)由于具有較強(qiáng)的乙醇氧化能力并且能夠在發(fā)酵過程中積累大量乙酸，而被廣泛應(yīng)用于醋酸發(fā)酵中［2－4］。通過比較多株醋酸生產(chǎn)菌中乙醇脫氫酶的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)定位于細(xì)胞膜上的乙醇脫氫酶的催化活性和其對高濃度醋酸的耐受性，對醋酸發(fā)酵和醋酸菌在高醋酸濃度條件下的生長非常重要［5］，并且乙醇脫氫酶的溫度穩(wěn)定性也決定了醋酸菌在較高溫度下生長的能力［6］。不同的醋酸菌在不同的生長環(huán)境下，其乙醇脫氫酶的表達(dá)有很大的區(qū)別［7］，在醋酸菌中過量表達(dá)乙醇脫氫酶可以提高醋酸的生產(chǎn)速率和醋酸濃度［1］。本課題組在前期工作中篩選得到一株醋酸發(fā)酵菌株——巴斯德醋酸桿菌(Acetobacter pasteurianus)AC2005(中國普通微生物菌種保藏中心編號:CGMCC 3089)［8］。通過比較發(fā)現(xiàn)，巴斯德醋酸桿菌AC2005對酒精和醋酸的耐受性均優(yōu)于目前工業(yè)上常用的醋酸生產(chǎn)菌株惡臭醋酸桿菌(Acetobacter rancens)AS1.41［8］。因此，本論文采用生物信息學(xué)的方法對巴斯德醋酸桿菌AC2005膜結(jié)合的乙醇脫氫酶進(jìn)行研究，該研究將為今后對該酶的結(jié)構(gòu)和功能分析提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴斯德醋酸桿菌(Acetobactorpasteurianus) AC2005 由本實驗室保存;大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態(tài)、Taq－DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 北京全式金生物技術(shù)有限公司;T載體pJET 1.2 Fermentas公司;T4 DNA連接酶 Promega公司;限制性內(nèi)切酶 寶生物工程(大連)有限公司;凝膠純化試劑盒(Column DNA back試劑盒) 北京天恩澤基因科技有限公司;引物合成及測序 由上海生工生物工程有限公司完成;其余試劑 為國產(chǎn)分析純。

PCR儀 德國BIOMETRA公司;全自動凝膠成像儀 美國Bio－Rad公司;電泳儀和電泳槽 北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA和質(zhì)粒的提取 DNA和質(zhì)粒的提取方法按參考文獻(xiàn)［9］所述方法進(jìn)行。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank報道的巴斯德醋酸桿菌乙醇脫氫酶亞基 I和亞基II的基因 adhA和adhB全序列設(shè)計PCR引物，為了便于重組克隆質(zhì)粒的酶切鑒定，在引物中加入了酶切位點。

1.2.2.1 乙醇脫氫酶亞基I基因adhA的克隆 上游引物P1:5’－CGGGGTACCATGACCCGCCCCGCCTCCGCCAAGA－3’，下劃線為Kpn I酶切位點;下游引物P2:5’－ACGCGTCGACTTAGGGGTTAATGCCAAGTGTCG－3’，下劃線為Sal I酶切位點。

PCR反應(yīng)體系:總 DNA模板2μL;引物 P1 (20μmol/L)0.5μL，P2(20μmol/L)0.5μL;dNTPs (2.5mmol/L each)5μL;5×buffer 10μL;FastPfu DNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，加 ddH2O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件:95℃變性5min，95℃變性50s，50℃退火30s，72℃延伸150s，設(shè)置30個循環(huán)，最后72℃延伸10min使產(chǎn)物延伸完全。PCR產(chǎn)物4℃保存。

1.2.2.2 乙醇脫氫酶亞基II基因adhB的克隆 上游引物P3:5’－CGGGATCCGATGATGATGAACAGGCTAAAAACTGC－3’，下劃線為Bam HⅠ酶切位點;下游引物P4:5’－CCCAAGCTTTTACTGGGCTTCATCCACACCAGCA－3’，下劃線為HindⅢ酶切位點。

PCR反應(yīng)體系:總 DNA模板2μL;引物 P3 (20μmol/L)0.5μL，P4(20μmol/L)0.5μL;dNTPs (2.5mM each)5μL;5×buffer 10μL;FastPfu DNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，加ddH2O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件:96℃變性5min，96℃變性50s，55℃退火30s，72℃延伸80s，設(shè)置3個循環(huán);96℃變性50s，57℃退火30s，72℃延伸80s，設(shè)置4個循環(huán);96℃變性50s，59℃退火30s，72℃延伸80s，設(shè)置22個循環(huán);總共設(shè)置30個循環(huán)，最后72℃延伸10min使產(chǎn)物延伸完全。PCR產(chǎn)物4℃保存。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆與測序 將純化后的目的條帶，分別與pJET 1.2克隆載體混合，16℃過夜進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，雙酶切篩選陽性重組質(zhì)粒，并將鑒定正確的重組質(zhì)粒pJET－adhA和pJET－adhB委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4 基因與蛋白序列分析 利用NCBI Blast軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行序列同源性分析;TMHMM 2.0 軟 件 (http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)域分析;Swiss－Model在線軟件(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行蛋白三維立體結(jié)構(gòu)預(yù)測。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇脫氫酶亞基I和亞基II編碼基因——adhA和adhB的克隆

分別以巴斯德醋酸桿菌AC2005的基因組DNA為模板，用設(shè)計好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一，大小分別約2.2kb和1.4kb，與預(yù)期一致，說明PCR擴(kuò)增結(jié)果正確，將回收的目的條帶分別命名為adhA和adhB。將回收的目的片段同T載體連接、轉(zhuǎn)化，將鑒定正確的陽性克隆子交由上海生工生物工程有限公司測序。

圖1 基因adhA和基因adhB的PCR產(chǎn)物

2.2 adhA和adhB的序列分析

根據(jù)測序結(jié)果，adhA基因和adhB基因全長分別為2229bp和1314bp，起始密碼子均為ATG，終止密碼子均為TAA，分別編碼724個氨基酸殘基和472個氨基酸殘基。

2.3 基因同源性分析

2.3.1 adhA序列同源性分析 將測序所得adhA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與已公布的巴斯德醋酸桿菌乙醇脫氫酶亞基I基因(accession number:D13893.1)同源性最高，為94%，蛋白序列相似度達(dá)98%，說明所克隆序列為巴斯德醋酸桿菌乙醇脫氫酶亞基I基因。

2.3.2 adhB序列的同源性分析 將測序所得adhB序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行Blast，發(fā)現(xiàn)與已公布的巴斯德醋酸桿菌乙醇脫氫酶亞基Ⅱ基因(accession number:D13893.1)同源性最高，為93%，蛋白序列相似度達(dá)97%，說明所克隆序列為巴斯德醋酸桿菌乙醇脫氫酶亞基Ⅱ基因。

2.4 物理參數(shù)和跨膜螺旋及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4.1 乙醇脫氫酶亞基I的物理參數(shù)和跨膜螺旋及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4.1.1 物理參數(shù)分析 如表1所示。

表1 乙醇脫氫酶亞基I物理參數(shù)分析

2.4.1.2 跨膜螺旋及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測 利用TMHMM 2.0軟件，對乙醇脫氫酶亞基I進(jìn)行跨膜分析。如圖2所示，從第1～20位氨基酸殘基位于細(xì)胞膜內(nèi)，從2～43位和527～555位氨基酸殘基結(jié)合在細(xì)胞膜上，其余位氨基酸殘基位于細(xì)胞膜外。

圖2 乙醇脫氫酶亞基I的跨膜螺旋及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4.2 乙醇脫氫酶亞基Ⅱ的物理參數(shù)和跨膜螺旋及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4.2.1 物理參數(shù)分析 如表2所示。

表2 乙醇脫氫酶亞基II物理參數(shù)分析

2.4.2.2 跨膜螺旋及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測 利用TMHMM 2.0軟件，對乙醇脫氫酶亞基II進(jìn)行跨膜分析。如圖3所示，第5～22位氨基酸殘基定位在細(xì)胞膜上，第23～473位氨基酸殘基位于細(xì)胞膜外。

2.5 三維立體結(jié)構(gòu)預(yù)測

在Swiss－Model蛋白數(shù)據(jù)庫中對乙醇脫氫酶亞基Ⅰ蛋白序列進(jìn)行分析，以同源性較高的假單胞菌中依賴PQQ作為輔酶的乙醇脫氫酶為模型，模擬出了乙醇脫氫酶亞基Ⅰ的三維立體結(jié)構(gòu)，如圖4所示。

通過對克隆得到的巴斯德醋酸桿菌AC2005乙醇脫氫酶的基因序列分析表明，AC2005中的乙醇脫氫酶為膜結(jié)合蛋白，該酶是醋酸發(fā)酵過程中的關(guān)鍵酶。醋酸菌中膜結(jié)合乙醇脫氫酶的活性大小，影響乙醇氧化的速率和菌株對醋酸的耐受性，從而影響醋酸發(fā)酵的產(chǎn)物濃度［10－11］。乙醇脫氫酶的活性降低會導(dǎo)致菌體生長緩慢和醋酸發(fā)酵濃度降低［11］，而在醋酸菌中過量表達(dá)乙醇脫氫酶可以提高醋酸發(fā)酵的生產(chǎn)速率和產(chǎn)物濃度［1］。乙醇脫氫酶亞基I主要負(fù)責(zé)同底物乙醇和輔酶PQQ的結(jié)合，而亞基II主要負(fù)責(zé)乙醇脫氫酶在細(xì)胞膜上的定位和電子的傳遞［7］。因此，在今后的研究過程中可以重點研究定位于細(xì)胞膜外的氨基酸殘基序列對乙醇脫氫酶活性和醋酸生產(chǎn)的影響，即重點研究亞基I從43～527位氨基酸殘基序列和亞基II從第23～473位氨基酸殘基序列變化對乙醇脫氫酶活性的影響和醋酸發(fā)酵的影響。

圖3 乙醇脫氫酶亞基Ⅱ的跨膜螺旋及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測

圖4 乙醇脫氫酶亞基I三維立體結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 結(jié)論

本研究采用 PCR技術(shù)，從巴斯德醋酸桿菌AC2005基因組中成功克隆了分別編碼乙醇脫氫酶亞基Ⅰ和亞基II的adhA和adhB基因。利用生物信息學(xué)軟件分析表明，adhA和adhB所編碼的乙醇脫氫酶為膜結(jié)合蛋白。乙醇脫氫酶亞基I從第43～527位氨基酸殘基序列、亞基Ⅱ從第23～473位氨基酸殘基序列定位與細(xì)胞膜外，這些氨基酸殘基對乙醇脫氫酶的催化活性和電子傳遞起重要作用，該研究為進(jìn)一步對該酶的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析提供了參考。

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Cloning and protein sequence analysis of alcohol dehydrogenase of Acetobacter pasteurianus AC2005

ZHANG Ke－ping，ZHENG Yu，JIA Jun－h(huán)ui，LUO Jian－mei，WANG Min*
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology(Tianjin University of Science and Technology)，Ministry of Education，School of Biological Engineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)

The genes，adhA and adhB，coding the subunit I and II of alcohol dehydrogenase(ADH)were amplified by the polymerase chain reaction(PCR)，using genomic DNA of Acetobacter pasteurianus AC2005 as template，which had been demonstrated a potential strain for acetic acid production.The sequences were blasted in GenBank databases.The results showed that adhA shared 94%identity and 98%amino acid sequence homology，besides adhB shared 93%identity and 97%amino acid sequence homology with the reported gene(accession number:D13893.1).The characterization of transbilayer helix of ADH was analyzed，using software of TMHMM 2.0.It was found that the subunits I and II were both membrane－bound protein.Furthermore，the three dimensional structure of subunit I of ADH in A.pasteurianus AC2005 was produced by using Swiss－Model workspace.Those results provided that some information for further researching the relationship of structure and function of ADH.

Acetobacter pasteurianus;alcohol dehydrogenase;gene clone;sequence analysis

Q789

A

1002－0306(2011)12－0265－04

2011－03－07 *通訊聯(lián)系人

張科平(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:菌株特性及菌種改造方面的研究。

國家十一五科技支撐計劃子課題(2008BAI63B06);高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(20101208120003);天津市科技攻關(guān)重點項目(06YFGZNC00400)。