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        巴斯德醋酸桿菌AC2005乙醇脫氫酶基因克隆與蛋白序列分析

        2011-11-02 08:34:12張科平賈鈞輝駱健美
        食品工業(yè)科技 2011年12期
        關(guān)鍵詞:巴斯德脫氫酶殘基

        張科平,鄭 宇,賈鈞輝,駱健美,王 敏

        (工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué)),天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津300457)

        巴斯德醋酸桿菌AC2005乙醇脫氫酶基因克隆與蛋白序列分析

        張科平,鄭 宇,賈鈞輝,駱健美,王 敏*

        (工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué)),天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津300457)

        以具有優(yōu)良醋酸發(fā)酵性能的巴斯德醋酸桿菌AC2005基因組DNA為模板,利用PCR的方法分別克隆了編碼乙醇脫氫酶亞基I和乙醇脫氫酶亞基 II的基因adhA和adhB。序列分析表明,adhA與 GenBank已報(bào)道的序列(accession number:D13893.1)具有94%的同源性,氨基酸序列同源性達(dá)98%;adhB與 GenBank已報(bào)道的序列(accession number:D13893.1)同源性為93%,氨基酸序列同源性達(dá)97%。利用TMHMM 2.0軟件,對乙醇脫氫酶跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)乙醇脫氫酶亞基I和乙醇脫氫酶亞基II均為膜結(jié)合蛋白。利用Swiss-Model在線軟件模擬了巴斯德醋酸桿菌AC2005乙醇脫氫酶亞基I的三維立體結(jié)構(gòu)。該研究對該酶的結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步分析提供了基礎(chǔ)。

        巴斯德醋酸桿菌,乙醇脫氫酶,基因克隆,序列分析

        醋酸是食醋的主要成分。醋酸發(fā)酵是利用醋酸菌(Acetic Acid Bacteria)完成從乙醇到醋酸的氧化反應(yīng),醋酸菌中含有多種乙醇氧化酶,其中結(jié)合于細(xì)胞膜上依賴 PQQ作為輔酶的乙醇脫氫酶(Alcohol Dehydrogenase,ADH)和乙醛脫氫酶 (Aldehyde Dehydrogenase,ALDH)是醋酸發(fā)酵過程中起主要作用的酶[1]。醋桿菌屬(Acetobacter)由于具有較強(qiáng)的乙醇氧化能力并且能夠在發(fā)酵過程中積累大量乙酸,而被廣泛應(yīng)用于醋酸發(fā)酵中[2-4]。通過比較多株醋酸生產(chǎn)菌中乙醇脫氫酶的性質(zhì),發(fā)現(xiàn)定位于細(xì)胞膜上的乙醇脫氫酶的催化活性和其對高濃度醋酸的耐受性,對醋酸發(fā)酵和醋酸菌在高醋酸濃度條件下的生長非常重要[5],并且乙醇脫氫酶的溫度穩(wěn)定性也決定了醋酸菌在較高溫度下生長的能力[6]。不同的醋酸菌在不同的生長環(huán)境下,其乙醇脫氫酶的表達(dá)有很大的區(qū)別[7],在醋酸菌中過量表達(dá)乙醇脫氫酶可以提高醋酸的生產(chǎn)速率和醋酸濃度[1]。本課題組在前期工作中篩選得到一株醋酸發(fā)酵菌株——巴斯德醋酸桿菌(Acetobacter pasteurianus)AC2005(中國普通微生物菌種保藏中心編號:CGMCC 3089)[8]。通過比較發(fā)現(xiàn),巴斯德醋酸桿菌AC2005對酒精和醋酸的耐受性均優(yōu)于目前工業(yè)上常用的醋酸生產(chǎn)菌株惡臭醋酸桿菌(Acetobacter rancens)AS1.41[8]。因此,本論文采用生物信息學(xué)的方法對巴斯德醋酸桿菌AC2005膜結(jié)合的乙醇脫氫酶進(jìn)行研究,該研究將為今后對該酶的結(jié)構(gòu)和功能分析提供理論參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        巴斯德醋酸桿菌(Acetobactorpasteurianus) AC2005 由本實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態(tài)、Taq-DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 北京全式金生物技術(shù)有限公司;T載體pJET 1.2 Fermentas公司;T4 DNA連接酶 Promega公司;限制性內(nèi)切酶 寶生物工程(大連)有限公司;凝膠純化試劑盒(Column DNA back試劑盒) 北京天恩澤基因科技有限公司;引物合成及測序 由上海生工生物工程有限公司完成;其余試劑 為國產(chǎn)分析純。

        PCR儀 德國BIOMETRA公司;全自動凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司;電泳儀和電泳槽 北京六一儀器廠。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 DNA和質(zhì)粒的提取 DNA和質(zhì)粒的提取方法按參考文獻(xiàn)[9]所述方法進(jìn)行。

        1.2.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank報(bào)道的巴斯德醋酸桿菌乙醇脫氫酶亞基 I和亞基II的基因 adhA和adhB全序列設(shè)計(jì)PCR引物,為了便于重組克隆質(zhì)粒的酶切鑒定,在引物中加入了酶切位點(diǎn)。

        1.2.2.1 乙醇脫氫酶亞基I基因adhA的克隆 上游引物P1:5’-CGGGGTACCATGACCCGCCCCGCCTCCGCCAAGA-3’,下劃線為Kpn I酶切位點(diǎn);下游引物P2:5’-ACGCGTCGACTTAGGGGTTAATGCCAAGTGTCG-3’,下劃線為Sal I酶切位點(diǎn)。

        PCR反應(yīng)體系:總 DNA模板2μL;引物 P1 (20μmol/L)0.5μL,P2(20μmol/L)0.5μL;dNTPs (2.5mmol/L each)5μL;5×buffer 10μL;FastPfu DNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL,加 ddH2O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件:95℃變性5min,95℃變性50s,50℃退火30s,72℃延伸150s,設(shè)置30個循環(huán),最后72℃延伸10min使產(chǎn)物延伸完全。PCR產(chǎn)物4℃保存。

        1.2.2.2 乙醇脫氫酶亞基II基因adhB的克隆 上游引物P3:5’-CGGGATCCGATGATGATGAACAGGCTAAAAACTGC-3’,下劃線為Bam HⅠ酶切位點(diǎn);下游引物P4:5’-CCCAAGCTTTTACTGGGCTTCATCCACACCAGCA-3’,下劃線為HindⅢ酶切位點(diǎn)。

        PCR反應(yīng)體系:總 DNA模板2μL;引物 P3 (20μmol/L)0.5μL,P4(20μmol/L)0.5μL;dNTPs (2.5mM each)5μL;5×buffer 10μL;FastPfu DNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL,加ddH2O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件:96℃變性5min,96℃變性50s,55℃退火30s,72℃延伸80s,設(shè)置3個循環(huán);96℃變性50s,57℃退火30s,72℃延伸80s,設(shè)置4個循環(huán);96℃變性50s,59℃退火30s,72℃延伸80s,設(shè)置22個循環(huán);總共設(shè)置30個循環(huán),最后72℃延伸10min使產(chǎn)物延伸完全。PCR產(chǎn)物4℃保存。

        1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆與測序 將純化后的目的條帶,分別與pJET 1.2克隆載體混合,16℃過夜進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,雙酶切篩選陽性重組質(zhì)粒,并將鑒定正確的重組質(zhì)粒pJET-adhA和pJET-adhB委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

        1.2.4 基因與蛋白序列分析 利用NCBI Blast軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行序列同源性分析;TMHMM 2.0 軟 件 (http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)域分析;Swiss-Model在線軟件(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行蛋白三維立體結(jié)構(gòu)預(yù)測。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 乙醇脫氫酶亞基I和亞基II編碼基因——adhA和adhB的克隆

        分別以巴斯德醋酸桿菌AC2005的基因組DNA為模板,用設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一,大小分別約2.2kb和1.4kb,與預(yù)期一致,說明PCR擴(kuò)增結(jié)果正確,將回收的目的條帶分別命名為adhA和adhB。將回收的目的片段同T載體連接、轉(zhuǎn)化,將鑒定正確的陽性克隆子交由上海生工生物工程有限公司測序。

        圖1 基因adhA和基因adhB的PCR產(chǎn)物

        2.2 adhA和adhB的序列分析

        根據(jù)測序結(jié)果,adhA基因和adhB基因全長分別為2229bp和1314bp,起始密碼子均為ATG,終止密碼子均為TAA,分別編碼724個氨基酸殘基和472個氨基酸殘基。

        2.3 基因同源性分析

        2.3.1 adhA序列同源性分析 將測序所得adhA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)與已公布的巴斯德醋酸桿菌乙醇脫氫酶亞基I基因(accession number:D13893.1)同源性最高,為94%,蛋白序列相似度達(dá)98%,說明所克隆序列為巴斯德醋酸桿菌乙醇脫氫酶亞基I基因。

        2.3.2 adhB序列的同源性分析 將測序所得adhB序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行Blast,發(fā)現(xiàn)與已公布的巴斯德醋酸桿菌乙醇脫氫酶亞基Ⅱ基因(accession number:D13893.1)同源性最高,為93%,蛋白序列相似度達(dá)97%,說明所克隆序列為巴斯德醋酸桿菌乙醇脫氫酶亞基Ⅱ基因。

        2.4 物理參數(shù)和跨膜螺旋及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測

        2.4.1 乙醇脫氫酶亞基I的物理參數(shù)和跨膜螺旋及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測

        2.4.1.1 物理參數(shù)分析 如表1所示。

        表1 乙醇脫氫酶亞基I物理參數(shù)分析

        2.4.1.2 跨膜螺旋及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測 利用TMHMM 2.0軟件,對乙醇脫氫酶亞基I進(jìn)行跨膜分析。如圖2所示,從第1~20位氨基酸殘基位于細(xì)胞膜內(nèi),從2~43位和527~555位氨基酸殘基結(jié)合在細(xì)胞膜上,其余位氨基酸殘基位于細(xì)胞膜外。

        圖2 乙醇脫氫酶亞基I的跨膜螺旋及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測

        2.4.2 乙醇脫氫酶亞基Ⅱ的物理參數(shù)和跨膜螺旋及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測

        2.4.2.1 物理參數(shù)分析 如表2所示。

        表2 乙醇脫氫酶亞基II物理參數(shù)分析

        2.4.2.2 跨膜螺旋及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測 利用TMHMM 2.0軟件,對乙醇脫氫酶亞基II進(jìn)行跨膜分析。如圖3所示,第5~22位氨基酸殘基定位在細(xì)胞膜上,第23~473位氨基酸殘基位于細(xì)胞膜外。

        2.5 三維立體結(jié)構(gòu)預(yù)測

        在Swiss-Model蛋白數(shù)據(jù)庫中對乙醇脫氫酶亞基Ⅰ蛋白序列進(jìn)行分析,以同源性較高的假單胞菌中依賴PQQ作為輔酶的乙醇脫氫酶為模型,模擬出了乙醇脫氫酶亞基Ⅰ的三維立體結(jié)構(gòu),如圖4所示。

        通過對克隆得到的巴斯德醋酸桿菌AC2005乙醇脫氫酶的基因序列分析表明,AC2005中的乙醇脫氫酶為膜結(jié)合蛋白,該酶是醋酸發(fā)酵過程中的關(guān)鍵酶。醋酸菌中膜結(jié)合乙醇脫氫酶的活性大小,影響乙醇氧化的速率和菌株對醋酸的耐受性,從而影響醋酸發(fā)酵的產(chǎn)物濃度[10-11]。乙醇脫氫酶的活性降低會導(dǎo)致菌體生長緩慢和醋酸發(fā)酵濃度降低[11],而在醋酸菌中過量表達(dá)乙醇脫氫酶可以提高醋酸發(fā)酵的生產(chǎn)速率和產(chǎn)物濃度[1]。乙醇脫氫酶亞基I主要負(fù)責(zé)同底物乙醇和輔酶PQQ的結(jié)合,而亞基II主要負(fù)責(zé)乙醇脫氫酶在細(xì)胞膜上的定位和電子的傳遞[7]。因此,在今后的研究過程中可以重點(diǎn)研究定位于細(xì)胞膜外的氨基酸殘基序列對乙醇脫氫酶活性和醋酸生產(chǎn)的影響,即重點(diǎn)研究亞基I從43~527位氨基酸殘基序列和亞基II從第23~473位氨基酸殘基序列變化對乙醇脫氫酶活性的影響和醋酸發(fā)酵的影響。

        圖3 乙醇脫氫酶亞基Ⅱ的跨膜螺旋及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測

        圖4 乙醇脫氫酶亞基I三維立體結(jié)構(gòu)預(yù)測

        3 結(jié)論

        本研究采用 PCR技術(shù),從巴斯德醋酸桿菌AC2005基因組中成功克隆了分別編碼乙醇脫氫酶亞基Ⅰ和亞基II的adhA和adhB基因。利用生物信息學(xué)軟件分析表明,adhA和adhB所編碼的乙醇脫氫酶為膜結(jié)合蛋白。乙醇脫氫酶亞基I從第43~527位氨基酸殘基序列、亞基Ⅱ從第23~473位氨基酸殘基序列定位與細(xì)胞膜外,這些氨基酸殘基對乙醇脫氫酶的催化活性和電子傳遞起重要作用,該研究為進(jìn)一步對該酶的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析提供了參考。

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        [2]Matsushita K,Inoue T,Adachi O,et al.Acetobacter aceti possesses a proton motive force-dependent efflux system for acetic acid[J].Journal of Bacteriology,2005,187(13):4346-4352.

        [3]Prust C,Hoffmeister M,Liesegang H,et al.Complete genome sequence of the acetic acid bacterium Gluconobacter oxydans[J]. Nature Biotechnology,2005,23:195-200.

        [4] Kanchanarach W,Theeragool G,Yakushi T,et al.Characterization ofthermotolerantAcetobacter pasteurianus strains and their quinoprotein alcohol dehydrogenases[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2010,85(3):741-751.

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        Cloning and protein sequence analysis of alcohol dehydrogenase of Acetobacter pasteurianus AC2005

        ZHANG Ke-ping,ZHENG Yu,JIA Jun-h(huán)ui,LUO Jian-mei,WANG Min*
        (Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology(Tianjin University of Science and Technology),Ministry of Education,School of Biological Engineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

        The genes,adhA and adhB,coding the subunit I and II of alcohol dehydrogenase(ADH)were amplified by the polymerase chain reaction(PCR),using genomic DNA of Acetobacter pasteurianus AC2005 as template,which had been demonstrated a potential strain for acetic acid production.The sequences were blasted in GenBank databases.The results showed that adhA shared 94%identity and 98%amino acid sequence homology,besides adhB shared 93%identity and 97%amino acid sequence homology with the reported gene(accession number:D13893.1).The characterization of transbilayer helix of ADH was analyzed,using software of TMHMM 2.0.It was found that the subunits I and II were both membrane-bound protein.Furthermore,the three dimensional structure of subunit I of ADH in A.pasteurianus AC2005 was produced by using Swiss-Model workspace.Those results provided that some information for further researching the relationship of structure and function of ADH.

        Acetobacter pasteurianus;alcohol dehydrogenase;gene clone;sequence analysis

        Q789

        A

        1002-0306(2011)12-0265-04

        2011-03-07 *通訊聯(lián)系人

        張科平(1985-),女,碩士研究生,研究方向:菌株特性及菌種改造方面的研究。

        國家十一五科技支撐計(jì)劃子課題(2008BAI63B06);高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20101208120003);天津市科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目(06YFGZNC00400)。

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