孫 強(qiáng)，孫潔心，張永忠

(1.黑龍江農(nóng)墾職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150025; 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系，黑龍江哈爾濱150030; 3.教育部大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030)

少孢根霉發(fā)酵豆粕制備大豆異黃酮苷元

孫 強(qiáng)1，孫潔心1，張永忠2，3，*

(1.黑龍江農(nóng)墾職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150025; 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系，黑龍江哈爾濱150030; 3.教育部大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030)

研究了以少孢根霉作為菌種對(duì)豆粕進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)大豆異黃酮苷元的方法，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定了發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基是豆粕∶水=1∶3，0.8%乳酸，最佳發(fā)酵條件是發(fā)酵時(shí)間24h，發(fā)酵溫度30℃。在此條件下，黃豆苷元轉(zhuǎn)化率為90.95%，染料木黃酮轉(zhuǎn)化率為92.24%。為豆粕的綜合利用和大豆異黃酮苷元的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

少孢根霉，固態(tài)發(fā)酵法，大豆異黃酮苷元，高效液相色譜

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆豆粕 哈高科大豆食品有限責(zé)任公司;少孢根霉(CCTCC AF 96004) 由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供;斜面菌種保藏培養(yǎng)基和菌種擴(kuò)培培養(yǎng)基 均為PDA培養(yǎng)基;染料木黃酮、黃豆苷元、染料木苷和黃豆苷標(biāo)準(zhǔn)品 sigma公司;甲醇色譜純;冰醋酸等 國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

高效液相色譜儀 含P682HPLC泵、UVD170U紫外檢測器、ASI-100自動(dòng)進(jìn)樣器、色譜柱Nova-Pak C18柱(3.9×150mm 4μm)，美國戴安公司;電子天平上海天平儀器廠;H.H.S 21-2R型電熱恒溫水浴鍋上海醫(yī)療器械五廠;DH600A型電熱恒溫培養(yǎng)箱天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高效液相色譜法檢測大豆異黃酮含量 測定條件：流動(dòng)相為甲醇∶0.5%乙酸=40∶60(v/v)，柱溫：50℃，流速：1.0mL/min，檢測波長：254nm，進(jìn)樣量：10μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品染料木苷(genistin)和黃豆苷(daidzin)各1mg、染料木黃酮(genistein)和黃豆苷元(daidzein)各5mg，用甲醇分別定容到10mL容量瓶中，制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。然后分別從各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中吸取一定量，用甲醇稀釋到1、2、3、4、5μg/mL待測。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，大豆異黃酮濃度(x)為橫坐標(biāo)，對(duì)各組分濃度與峰面積關(guān)系進(jìn)行回歸分析，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 空白實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱量豆粕，加入4倍水，在0.08MPa滅菌20min。用80%乙醇常溫下在磁力攪拌條件下提取30min，料液比 1∶4，提取2次，在4000r/min離心并合并提取液，定容至50mL，稀釋后過濾，用高效液相色譜法檢測得到發(fā)酵前豆粕中大豆異黃酮糖苷和苷元含量，三組平行數(shù)據(jù)取平均值。

1.2.3 發(fā)酵提取路線 準(zhǔn)確稱量豆粕，加入碳源、無機(jī)鹽等，加入4倍水，在0.08MPa滅菌20min，加入0.8%乳酸，拌勻。加入孢子菌懸液，在恒溫箱中30℃恒溫培養(yǎng)24h。用80%乙醇常溫下在磁力攪拌條件下提取30min，料液比1∶4，提取2次，在4000r/min離心并合并提取液，定容至50mL，稀釋后過濾，用高效液相色譜法檢測，計(jì)算異黃酮苷元的轉(zhuǎn)化率

轉(zhuǎn)化率(%)=發(fā)酵前后異黃酮苷元質(zhì)量之差/發(fā)酵前大豆異黃酮糖苷質(zhì)量×100%

1.2.4 孢子菌懸液的制備 接種少孢根霉于固體平板培養(yǎng)基上，在恒溫箱中30℃恒溫培養(yǎng)72h，用無菌生理鹽水洗下孢子，稀釋至106cfu/mL，放置于冰箱中4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

1.2.5.1 碳源的選擇 分別加入10%葡萄糖、蔗糖和淀粉，按照1.2.3發(fā)酵提取，根據(jù)異黃酮苷元的轉(zhuǎn)化率選擇最佳碳源。

1.2.5.2 碳源添加量的確定 分別添加5%、10%、15%最佳碳源，按照1.2.3發(fā)酵提取，根據(jù)異黃酮苷元的轉(zhuǎn)化率選擇碳源添加量。

1.2.5.3 無機(jī)鹽及其添加量的確定 通過四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)確定添加無機(jī)鹽及其最佳添加量，因素水平如表1所示。

表1 無機(jī)鹽正交實(shí)驗(yàn)因素表

1.2.5.4 水分比例的選擇 分別使發(fā)酵培養(yǎng)基中干料與水分比例為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，按照1.2.3發(fā)酵提取，根據(jù)異黃酮苷元的轉(zhuǎn)化率選擇最佳水分比例。

1.2.6 最佳發(fā)酵條件的確定

1.2.6.1 發(fā)酵時(shí)間的選擇 選用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，在恒溫箱中30℃分別恒溫培養(yǎng)18、24、30、36h，用1.2.3中條件提取檢測，根據(jù)異黃酮苷元轉(zhuǎn)化率確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.2.6.2 發(fā)酵溫度的選擇 選用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在28、30、37、40℃恒溫培養(yǎng)，用1.2.3中條件提取檢測，根據(jù)異黃酮苷元轉(zhuǎn)化率確定最佳發(fā)酵溫度。

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相色譜法測定大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(y-峰面積x-化合物濃度)

2.2 空白實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用HPLC法檢測發(fā)酵前豆粕中大豆異黃酮糖苷和苷元含量，三組平行數(shù)據(jù)取平均值。結(jié)果如表3所示。

表3 豆粕中異黃酮的含量(μg/g)

由表3可知，豆粕中大豆異黃酮主要以糖苷形式為主，苷元形式的異黃酮約占異黃酮總量的4%左右。

2.3 最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

2.3.1 最佳碳源的測定 分別加入10%葡萄糖、蔗糖和淀粉，發(fā)酵提取后，HPLC法檢測黃豆苷元和染料木黃酮結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同碳源對(duì)異黃酮苷元轉(zhuǎn)化率影響的比較

由圖1可以看出，在不加入其他碳源的情況下最高。在加入葡萄糖的條件下，少孢根霉直接利用葡萄糖作為碳源，而降低了對(duì)異黃酮糖苷中糖苷基的利用率，所以對(duì)異黃酮苷元的轉(zhuǎn)化率沒有積極的影響。因此選擇的條件為不加入其他碳源，此時(shí)黃豆苷元的轉(zhuǎn)化率是72.92%，染料木黃酮的轉(zhuǎn)化率為74.64%。

2.3.2 無機(jī)鹽及其添加量的確定 通過4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，HPLC法檢測結(jié)果如表4所示。

表4 無機(jī)鹽正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表

由表4可以看出，不加入無機(jī)鹽的情況下異黃酮苷元的轉(zhuǎn)化率最高。通過極差分析可以看出，四因素對(duì)于異黃酮苷元轉(zhuǎn)化率的影響程度依次為B＞C＞D＞A。加入無機(jī)鹽對(duì)異黃酮苷元的轉(zhuǎn)化率沒有積極影響，因此選用條件為不加入無機(jī)鹽。

2.3.3 水分比例的確定 分別使發(fā)酵培養(yǎng)基中干料與水分比例為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，HPLC法檢測黃豆苷元和染料木黃酮結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同水分比例的比較

由圖2可以看出，培養(yǎng)基中干料與水分比例為1∶3時(shí)異黃酮苷元轉(zhuǎn)化率最高。水分比例為1∶2時(shí)，不利于微生物生長繁殖;少孢根霉是需氧菌，水分過多不利于菌在培養(yǎng)基內(nèi)部的生長。因此，當(dāng)水分比例為1∶3時(shí)為最佳培養(yǎng)基條件。

2.4 最佳發(fā)酵條件的確定

2.4.1 發(fā)酵時(shí)間的選擇 選用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，在恒溫箱中30℃分別恒溫培養(yǎng)18、24、30、36h，HPLC法檢測黃豆苷元和染料木黃酮結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，在發(fā)酵24h后，黃豆苷元和染料木黃酮的轉(zhuǎn)化率變化很小。因此選擇發(fā)酵時(shí)間為24h。

2.4.2 發(fā)酵溫度的選擇 選用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在28、30、37、40℃恒溫培養(yǎng)，HPLC法檢測黃豆苷元和染料木黃酮結(jié)果見圖4。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間的比較

圖4 不同發(fā)酵溫度的比較

由圖4可知，在30℃發(fā)酵，黃豆苷元和染料木黃酮的轉(zhuǎn)化率最高，在37℃和40℃轉(zhuǎn)化率均降低。因此選擇30℃為最佳發(fā)酵溫度。

發(fā)酵后，豆粕中異黃酮的含量如表5所示。

表5 發(fā)酵后豆粕中異黃酮的含量(μg/g)

由表5可以看出，發(fā)酵后苷元形式的大豆異黃酮含量大幅度升高。說明發(fā)酵過程使糖苷形式異黃酮轉(zhuǎn)化為苷元形式的異黃酮，此條件下黃豆苷元轉(zhuǎn)化率為92.24%，染料木黃酮轉(zhuǎn)化率為92.24%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出少孢根霉發(fā)酵豆粕的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵條件，確定少孢根霉發(fā)酵豆粕制備大豆異黃酮苷元的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基是豆粕∶水=1∶3，0.8%乳酸。最佳發(fā)酵條件是發(fā)酵時(shí)間24h，發(fā)酵溫度30℃。此條件下黃豆苷元轉(zhuǎn)化率為90.95%，染料木黃酮轉(zhuǎn)化率為92.24%。微生物發(fā)酵豆粕制備大豆異黃酮苷元及其提取分離的研究，對(duì)綜合利用豆粕資源、提高其附加值具有重要的意義，也為豆粕的綜合利用開辟一條新途徑。

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Study on the solid fermentation in producing of soybean isoflavone glycoside by Rhizopusolig osporus saito

SUN Qiang1，SUN Jie-xin1，ZHANG Yong-zhong2，3，*
(1.Heilongjiang Nongken Vocational College，Harbin 150025，China; 2.Department of Applied Chemistry，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China; 3.Key Laboratory of Soybean Biology，Ministry of Education，Harbin 150030，China)

The experiment was designed to study the method of isoflavone preparation by fermentation on soybean residue.According to the single factors and the orthogonal test，it showed that the optimal substrate was the soybean-water ratio 1∶3 and 0.8%lactic acid，the optimal fermentation conditions was the total time 24h and the temperature 30℃.The transformation ratio of daidzein was 90.95%，and the transformation ratio of genistein was 92.24%under the conditions.It was the reference resources for integrated utilization of soybean residue and production of isoflavone glycoside.

Rhizopusolig osporus saito;solid fermentation;soybean isoflavone glycoside;HPLC

TS201.3

A

1002-0306(2011)12-0258-04

大豆中天然存在的大豆異黃酮總共有12種，可以分為3類，即黃豆苷類(Daidzin Groups)、染料木苷類(GenistinGroups)、大豆黃素苷類 (Glycitin Groups)，以游離型、葡萄糖苷型、乙?；咸烟擒招?、丙二?；咸烟擒招偷?種形式存在［1］。大豆異黃酮中97%～99%是以大豆異黃酮糖苷形式存在，苷元形式僅為大豆異黃酮總量的1%～3%［2］。很多調(diào)查研究報(bào)道以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，大豆異黃酮具有弱雌激素活性、抗氧化活性、抗溶血活性和抗真菌活性，能有效地預(yù)防和抑制白血病、骨質(zhì)疏松、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、婦女更年期綜合癥等多種疾病，尤其是對(duì)乳腺癌和前列腺癌有積極的預(yù)防和治療作用［3-7］。一般認(rèn)為苷元(主要是genistein和daidzein)是大豆異黃酮的主要活性組分。也就是說，大豆異黃酮的苷元形式比糖苷形式活性要高，特別是染料木黃酮(genistein)的活性更高［8-9］。食品中的異黃酮主要以糖苷的形式存在，生物體一般不吸收此種形式［10］。大豆異黃酮糖苷在人的消化酶(特別是β-葡萄糖苷酶)作用下水解成其苷元形式，才開始被吸收［11］。目前大豆異黃酮糖苷水解的常用方法有：酸水解法、堿水解法和酶水解法等［12-13］。利用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)大豆異黃酮，和化學(xué)合成、提取法相比，不但可以使產(chǎn)量大大增加，而且還可以降低成本，更具有吸引力的是能直接生產(chǎn)苷元［14］。發(fā)酵法制備大豆異黃酮苷元具有成本低、適合工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)［15］。而且發(fā)酵不影響異黃酮的含量，但改變了異黃酮種類的分布。這是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中，真菌產(chǎn)生的大量β-葡萄糖苷酶使異黃酮葡萄糖苷大量水解，從而導(dǎo)致游離型的異黃酮顯著增加［16］。本研究旨在確定少孢根霉發(fā)酵豆粕制備大豆異黃酮苷元的最佳條件，以求為發(fā)酵法制備大豆異黃酮苷元的工業(yè)化，為生產(chǎn)低成本、富含大豆異黃酮苷元的產(chǎn)品開辟途徑。

2010-09-17 *通訊聯(lián)系人

孫強(qiáng)(1979-)，男，講師，碩士，研究方向:糧食油脂與植物蛋白工程。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2008AA10Z331)。