王雅萍，曹 榮，江艷華，劉 淇，*，殷邦忠，姜 橋

(1.青島農(nóng)業(yè)大學，食品科學與工程學院，山東青島266109; 2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島266071)

重組海帶面產(chǎn)品中腐敗微生物的分離純化及種類鑒定

王雅萍1，2，曹 榮2，江艷華2，劉 淇2，*，殷邦忠2，姜 橋1

(1.青島農(nóng)業(yè)大學，食品科學與工程學院，山東青島266109; 2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島266071)

以新型重組海帶面產(chǎn)品為研究對象，對其貯藏過程中的腐敗微生物進行了分離、純化，并通過菌落形態(tài)觀察、生理生化初步鑒別、VITEK微生物全自動系統(tǒng)分析對其種類進行了鑒定。結果表明，導致重組海帶面產(chǎn)品腐敗的微生物為產(chǎn)芽孢菌，分離到的6株菌分別為:短芽孢桿菌(Brevibacillus choshinensis)、枝芽孢桿菌(Virgibacillus proomii)、溶淀粉芽孢桿菌(Paenibacillus amylolyticus)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)和緩慢芽孢桿菌(Bacillus lentus)。

重組海帶面，腐敗菌，鑒定

1 材料與方法

1.1 材料與設備

實驗用海帶原料 由山東榮成海之寶海洋科技有限公司提供;平板計數(shù)培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒等 均購于青島海博生物技術有限公司。

SPX－250BSH－II型生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;SW－CJ－IFD型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;BX－51型顯微鏡OLYMPUS;MLS－3780型高壓蒸汽滅菌鍋 SANYO; VITEK全自動微生物分析系統(tǒng) Bios Merieumx。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組海帶面產(chǎn)品的加工工藝 海帶原料→清洗脫鹽→破碎漿化→擠壓成型→固化護色→熟化→清洗→包裝→巴氏殺菌→成品

主要操作流程:a.將選取的海帶原料清洗，去除海帶表面污泥及粘液，清水中浸泡脫鹽，撈出瀝水;b.海帶經(jīng)勻漿機破碎后，加入3%草酸鈉混合，用膠體磨研磨制成漿狀膠體;c.采用真空擠壓脫除漿狀膠體中的氣體，通過成型模具連續(xù)擠出條狀物;d.將條狀物置于固化護色復合液(0.5%檸檬酸鈣，0.2%草酸鎂)中，室溫浸泡15s;e.固化后的海帶面加入碳酸鈉，攪拌處理5min;f.清水沖洗海帶面，去除多余的碳酸鈉。

1.2.2 腐敗菌的分離和純化 在無菌條件下，取腐敗變質的海帶面樣品10.0g，剪碎后勻漿，加90mL無菌生理鹽水制成10－l稀釋液，用10倍遞增法進一步制成10－2、10－3和10－4等稀釋度的稀釋液，取100μL各稀釋度的稀釋液涂布營養(yǎng)瓊脂(NaCl質量分數(shù)調整為3%)平板，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后選取合適的計數(shù)平板，從平板上挑取菌落，劃線分離后保存在試管斜面中。

1.2.3 腐敗菌的鑒定 將1.2.2中分離到的菌株活化復壯后，觀察其菌落特征，進行革蘭氏染色、過氧化氫酶等生化實驗［6］，對菌株進行初步鑒定。

挑取培養(yǎng)24h后的菌落置于3%的無菌NaCl溶液中，配成比濁度為 2.0左右的稀釋菌液，采用VITEK微生物自動鑒定系統(tǒng)進行鑒定，即將芽孢試卡的L型吸管插入菌液中，利用真空原理將菌液吸入每個生化反應小室內(nèi)，將底物溶解并封口，試卡置于培養(yǎng)箱內(nèi)，由系統(tǒng)自動檢測、分析數(shù)據(jù)并給出鑒定結果［7］。

2 結果與分析

2.1 腐敗菌的分離純化

實驗對三批海帶面產(chǎn)品腐敗后的微生物情況進行了分析，從分離到的菌株中篩選了6株具有代表性的細菌，其編號和菌落形態(tài)如表1所示。

表1 重組海帶面產(chǎn)品中分離到的各菌株形態(tài)特征

2.2 腐敗菌的初步鑒定

6株細菌革蘭氏染色后的形態(tài)如圖1所示，6株菌均為革蘭氏陽性菌，可以明顯觀察到芽孢存在，同時過氧化氫酶實驗表現(xiàn)為陽性，初步鑒定為芽孢菌。

表2 菌落初步鑒定結果

2.3 生化鑒定結果

根據(jù)初檢結果確定分離到的6株細菌均為產(chǎn)芽孢菌，因此選用BAC芽孢試卡，采用VITEK系統(tǒng)對6株菌的生理生化性質進行分析，結果見表3。最終鑒定結果見表4，6株菌分別為短芽孢桿菌(Brevibacillus choshinensis)、枝芽孢桿菌(Virgibacillus proomii)、溶淀粉芽孢桿菌(Paenibacillus amylolyticus)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)和緩慢芽孢桿菌(Bacillus lentus)。

圖1 革蘭氏染色后的顯微鏡觀察圖片(1000×)

表4 重組海帶面產(chǎn)品中分離的細菌的鑒定結果

3 結論與討論

微生物是食品衛(wèi)生檢驗與監(jiān)控的重要對象之一。食品中的微生物多種多樣，在加工過程中，如何能快速、高效、安全地殺滅微生物是企業(yè)生產(chǎn)及質量監(jiān)控的關鍵。重組海帶面產(chǎn)品中微生物的種類和數(shù)量與原料和生產(chǎn)環(huán)境密切相關。巴氏殺菌雖然可以在很大程度上將產(chǎn)品中的絕大多數(shù)微生物殺滅，但某些嗜熱性微生物卻能在極端環(huán)境下存活下來，在適宜的條件下迅速生長繁殖，導致產(chǎn)品的腐敗變質［8］。目前對于軟包裝罐藏食品中主要腐敗菌種類有較多研究報道，如喬華林等［9］指出在輕微加工保藏的水產(chǎn)品中，能夠引起腐敗的微生物主要是革蘭氏陽性菌。相關研究也表明，造成罐藏食品酸敗的微生物通常是嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus)和 凝 結 芽 孢 桿 菌 (Bacillus coagulans)［10］。目前對于海帶產(chǎn)品中腐敗微生物的研究報道較少。唐勇等［11］人曾對真空包裝的熟食海帶軟罐頭進行了部分研究，認為產(chǎn)品經(jīng)單純的巴氏殺菌放置一段時間后，菌落總數(shù)增殖幅度很大，防腐不穩(wěn)定。劉秀河等［10］對即食海帶腐敗微生物進行了分離，認為導致即食海帶產(chǎn)品腐敗不是由平酸菌引起的，并確定添加增效尼泊金酯鈉0.250g/kg可有效延長即食海帶產(chǎn)品的保質期，但其并沒有繼續(xù)對腐敗微生物的種類進行鑒定。

目前有多種針對芽孢桿菌的鑒定方法，包括形態(tài)和生理生化特征鑒定法、抗菌譜實驗分類法、化學分類法、分子生物學方法等［12］，其中形態(tài)和生理生化特征鑒定是實驗室常規(guī)菌種鑒定中最常用的方法，VITEK微生物自動分析系統(tǒng)是目前世界上最先進、自動化程度最高的細菌鑒定儀器之一，其原理是以各種生理生化實驗為基礎，借助現(xiàn)代電腦技術開發(fā)的快捷而準確的檢測技術，其具有操作簡便、檢測速度快，還具有聯(lián)機孵育、定時掃描、誤差小、微量安全等特點［13－15］。

表3 菌株生理生化實驗結果

本文通過微生物學檢驗，從腐敗的重組海帶面產(chǎn)品中分離得到6株菌，經(jīng)鑒定分別為短芽孢桿菌(Brevibacillus choshinensis)、枝芽孢桿菌(Virgibacillus proomii)、溶 淀 粉 芽 孢 桿 菌 (Paenibacillus amylolyticus)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)和緩慢芽孢桿菌(Bacillus lentus)。微生物種類的鑒別可以為后續(xù)的微生物性質分析、生長控制、殺菌模式等研究奠定理論基礎，促進生產(chǎn)和保藏工藝的改進，從而更加有效地指導企業(yè)生產(chǎn)，同時也為相似類型產(chǎn)品的保藏提供參考。

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Purification and identification of spoilage organisms separated from restructured kelp products

WANG Ya－ping1，2，CAO Rong2，JIANG Yan－h(huán)ua2，LIU Qi2，*，YIN Bang－zhong2，JIANG Qiao1
(1.Food Science and Engineering Department，Qingdao Agriculture University，Qingdao 266109，China; 2.Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qingdao 266071，China)

In order to prolong the shelf life of novel restructured kelp products，spoilage organisms from restructured kelp noodles were separated，purified and identified by colonial morphology observation，physiology and biochemistry analysis，and VITEK systems identification.Results showed that the 6 strains isolated from the spoiled products were Brevibacillus choshinensis，Virgibacillus proomii，Paenibacillus amylolyticus，Bacillus circulans，Bacillus coagulans and Bacillus lentus.

restructured kelp noodle;spoilage organism;identification

TS201.3

A

1002－0306(2011)12－0251－04

海帶(Laminaria japonica)又名昆布，屬于褐藻綱海帶科，在我國有悠久的食用歷史，是一種營養(yǎng)價值極高的海洋植物［1］。海帶含有多種對人體健康有益的營養(yǎng)成分，因此其相關產(chǎn)品的開發(fā)一直是國內(nèi)外的研究熱點。目前，已開發(fā)出一些以海帶為原料的保健食品和方便食品，如海帶紙、海帶食用菌膳食顆粒、海帶富鍺鮮濕面條、海帶牛肉辣椒醬等［2－5］。重組海帶面是將海帶原料充分破碎，再經(jīng)漿化、擠壓成型、殺菌等工序制作的一種新型方便食品，其日益受到消費者的歡迎。但由于產(chǎn)品含水量高，水分活度大，且生產(chǎn)過程完全暴露于空氣中，極易被微生物污染，巴氏殺菌后的產(chǎn)品盡管微生物數(shù)量大幅度減少，但仍有部分微生物不能徹底殺滅，因此該類型產(chǎn)品目前需要冷鏈流通，且保質期較短。為有效地延長重組海帶面產(chǎn)品的保質期，本文對腐敗的產(chǎn)品進行了微生物的分離純化及種類鑒定，以期為該類型產(chǎn)品生產(chǎn)和保藏工藝的改進提供理論參考。

2011－08－05 *通訊聯(lián)系人

王雅萍(1985－)，女，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)品加工與貯藏相關研究。

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(200903030－A－4)。