董訓(xùn)江，鐘 嬋，蔡秋鳳，曹敏杰

(集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建廈門(mén)361021)

雜色鮑組織蛋白酶L的分離純化與性質(zhì)研究

董訓(xùn)江，鐘 嬋，蔡秋鳳，曹敏杰*

(集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建廈門(mén)361021)

通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、SP-Sepharose陽(yáng)離子交換層析、Sephacryl S-200 HR凝膠過(guò)濾和Hydroxyapatite羥基磷灰石層析，從雜色鮑(Haliotis diversicolor)內(nèi)臟中分離純化了組織蛋白酶L。SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化蛋白的分子量約為28ku。該酶最適溫度37℃，最適pH5.5。當(dāng)溫度低于40℃，pH在5.0～6.5范圍內(nèi)該酶較穩(wěn)定。底物特異性實(shí)驗(yàn)與抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該酶屬于半胱氨酸蛋白酶。金屬離子Mn2+、Ba2+和Mg2+對(duì)該酶有不同程度的激活作用，而Co2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+和Ca2+等對(duì)該酶起抑制作用。

雜色鮑，組織蛋白酶L，分離純化，性質(zhì)研究

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雜色鮑 購(gòu)自福建省廈門(mén)市大嶝島養(yǎng)殖場(chǎng)，平均體重(28.0±2.0)g，新鮮的雜色鮑即殺取其內(nèi)臟，立即使用或凍存于-80℃待用;SP-Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-200 瑞典 Amersham Biosciences公司;羥基磷灰石預(yù)裝柱(CHT-ⅡCartridge) Bio-Rad公司;熒光底物Z-Phe-Arg-MCA、Z-Arg-Arg-MCA、Arg-MCA等 日本Peptide Institute公司;反式琥珀酸-亮氨酰胺-胍基丁酮(E-64) Amresco公司;Chymostatin、Leupeptin Roche公司;乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、Benzamidine Sigma公司;標(biāo)準(zhǔn)蛋白 Fermentas公司;其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Avanti JA-25大型高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司;BioPhotometer紫外分光光度計(jì) 德國(guó)Eppendorf公司;FP-6200熒光分光光度計(jì) 日本Jasco公司;G∶BOX凝膠成像儀裝置 美國(guó)Syngene公司;組織搗碎機(jī) 瑞士Kinematica公司;WB-14恒溫水浴鍋 德國(guó)Memmert公司;蛋白質(zhì)電泳裝置美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶活力的測(cè)定 以Z-Phe-Arg-MCA為底物，參照Barrett［9］等人的方法，并略作修改：50μL酶液加入900μL含有1mmol/L EDTA和2mmol/L DTT的0.1mol/L乙酸鈉緩沖液(pH5.5)(緩沖液A)中，混合均勻后加入50μL 10μmol/L熒光底物，在37℃反應(yīng)10min，立即加入1.5mL終止液(甲醇∶異丙醇∶水= 35∶30∶35，v/v/v)終止反應(yīng)，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)后釋放產(chǎn)物7-amino-4-methylcoumarin(AMC)的熒光強(qiáng)度，測(cè)定的激發(fā)波長(zhǎng)為380nm，發(fā)射波長(zhǎng)為450nm。

活力單位(U)定義為每min釋放1nmol AMC所需要的酶量。

1.2.2 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 純化過(guò)程中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定在280nm波長(zhǎng)下的吸光值轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)含量;純化蛋白的濃度采用Lowry法測(cè)定［10］，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.3 酶的純化 鮑魚(yú)內(nèi)臟(約120g)用剪刀剪切成小塊，加入冰冷的4倍體積50mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH4.5)(緩沖液 B)，其中含 1mmol/L PMSF和1mmol/L EDTA，用組織搗碎機(jī)充分搗碎，于12000× g離心20min，取4層紗布過(guò)濾得上清液進(jìn)行30%～80%硫酸銨分級(jí)沉淀。用少量的緩沖液B溶解沉淀后，在相同外液中透析除鹽。

將透析后的酶液上樣于事先用含0.2mol/L NaCl的緩沖液B平衡好的SP-Sepharose Fast Flow(2.6× 15cm)離子交換柱，用緩沖液B充分流洗去除未吸附的雜蛋白后，吸附部分的蛋白用含0.2～1.0mol/L NaCl鹽濃度的緩沖液B進(jìn)行線性梯度洗脫，洗脫液的總體積為600mL，洗脫過(guò)程中每管收集5mL。對(duì)收集到的不同組分進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)定和酶活力的檢測(cè)。收集活性峰部分，用YM-10超濾膜超濾濃縮。

將濃縮后的樣品上樣于用含有0.2mol/L NaCl的緩沖液B平衡好的Sephacryl S-200 HR凝膠過(guò)濾層析柱(1.5×98cm)，然后用相同的緩沖液流洗，每管收集2mL。對(duì)收集的不同組分進(jìn)行A280和酶活力測(cè)定。收集活性部分并在5mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)(緩沖液C)中透析，其中含1mmol/L PMSF和1mmol/L EDTA。

將透析后的樣品上樣于用緩沖液C平衡的羥基磷灰石預(yù)裝柱(5mL)，充分流洗除去未吸附的雜蛋白。吸附部分的蛋白質(zhì)用含 1mmol/L PMSF和1mmol/L EDTA的 5～200mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)進(jìn)行線性梯度洗脫，洗脫總體積為80mL，洗脫時(shí)每管收集1mL。對(duì)收集到的不同組分進(jìn)行蛋白含量和酶活力的檢測(cè)，同時(shí)對(duì)活性部分進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳分析。

1.2.4 分子量的確定和純度鑒定 分子量測(cè)定采用Sephacryl S-200 HR凝膠過(guò)濾柱層析和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)［11］相結(jié)合的方法;純度鑒定通過(guò)SDS-PAGE電泳圖譜和酶譜分析。

明膠酶譜：凝膠制備同SDS-PAGE凝膠制備，只是分離膠中用0.5mL的明膠溶液替換0.5mL蒸餾水。取一定量純化的酶液，加入SDS上樣緩沖液，直接上樣于12%的聚丙烯酰胺凝膠，于4℃下恒流(8mA)電泳。電泳結(jié)束后，凝膠移入體積分?jǐn)?shù)為2.5% 的triton X-100中，置于搖床上搖動(dòng)2×30min以去除SDS。倒掉triton X-100后用蒸餾水洗2～3次，然后將凝膠放入50 mmol/L乙酸鈉緩沖液(含1mmol/L EDTA，pH 4.5)中，在37℃恒溫水浴中孵育18～24h，取出凝膠，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，倒出考馬斯亮藍(lán)染色液后用脫色液緩慢搖動(dòng)脫色，直至條帶清晰為止。

1.2.5 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 最適溫度的測(cè)定是將酶液放置在不同溫度(0～60℃)下進(jìn)行酶活力測(cè)定，其它測(cè)定條件不變。

熱穩(wěn)定性的測(cè)定是將酶液加入緩沖液A中，分別在10、20、30、40、50、60℃下放置30min后測(cè)定其剩余活性，確定酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.6 最適pH和pH穩(wěn)定性 最適pH測(cè)定是將酶液放置在50mmol/L的不同pH緩沖液中進(jìn)行酶活測(cè)定，其它測(cè)定條件不變;pH穩(wěn)定性測(cè)定是將酶液放置在50mmol/L的不同pH緩沖液中4℃下孵育4h處理后，用1.2.1的方法在含有1mmol/L EDTA和2mmol/L DTT的緩沖液A中測(cè)定其剩余酶活力。

其中不同pH緩沖液為乙酸鈉緩沖液(pH3.0～5.5)和磷酸鹽緩沖液(pH6.0～7.0)。

1.2.7 底物特異性測(cè)定 以不同類型的熒光底物為目標(biāo)分解物，酶活測(cè)定的其他條件不變，測(cè)定相應(yīng)的酶活力。以Z-Phe-Arg-MCA熒光底物為對(duì)照。

1.2.8 蛋白酶抑制劑的作用 在緩沖液A中，將酶液與不同類型的蛋白酶抑制劑充分混合，并在室溫下放置30min后，測(cè)定酶的剩余活力。對(duì)照樣品的反應(yīng)條件一致，但不添加任何抑制劑。

所用抑制劑有：E-64、Leupeptin、Chymostatin、PMSF、Benzamidine、EDTA、EGTA、Pepstatin。

1.2.9 金屬離子的作用 在緩沖液A中，將酶液與終濃度為1mmol/L的不同二價(jià)金屬離子溶液充分混合，室溫下放置30min后，測(cè)定剩余酶活力。對(duì)照樣品的反應(yīng)條件一致，但不添加任何金屬離子。

表1 組織蛋白酶L的純化表

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的分離純化

2.1.1 SP-Sepharose陽(yáng)離子交換柱層析 雜色鮑內(nèi)臟經(jīng)過(guò)預(yù)處理和硫酸銨鹽析后，上樣于事先用含0.2mol/L NaCl的緩沖液A平衡的SP-Sepharose陽(yáng)離子交換層析柱，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，SP-Sepharose陽(yáng)離子交換柱層析可以有效地將雜蛋白與目的蛋白分開(kāi)。經(jīng)過(guò)酶活力的測(cè)定和SDSPAGE電泳圖譜分析，收集酶活性高但是雜蛋白相對(duì)少的組分(第 218～245管)，經(jīng)超濾(Amicon，YM-10)濃縮后上樣于Sephacryl S-200 HR凝膠過(guò)濾柱層析。

圖1 SP-Sepharose陽(yáng)離子交換柱層析

2.1.2 Sephacryl S-200 HR凝膠過(guò)濾柱層析 樣品經(jīng)過(guò)Sephacryl S-200 HR凝膠過(guò)濾柱層析的結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，除目的蛋白峰外還有其余多個(gè)蛋白峰，因此，認(rèn)為樣品經(jīng)過(guò)Sephacryl S-200 HR凝膠過(guò)濾柱層析后與大量雜蛋白分離，有利于目的蛋白的進(jìn)一步純化。收集活性峰部分充分透析后，進(jìn)行下一步羥基磷灰石柱層析。

圖2 Sephacryl S-200 HR凝膠過(guò)濾層析

2.1.3 羥基磷灰石柱層析 如圖3所示，樣品經(jīng)過(guò)羥基磷灰石柱層析后酶活峰與蛋白峰基本重疊，表明組織蛋白酶L得到了高度純化。

經(jīng)過(guò)硫酸銨鹽析、SP-Sepharose離子交換柱層析、Sephacryl S-200 HR凝膠過(guò)濾柱層析和羥基磷灰石柱層析等得到純度較高的組織蛋白酶L，結(jié)果如表1所示。純化倍數(shù)為1582.1，得率為13.4%，酶的比活力為3006U/mg。

圖3 羥基磷灰石層析

2.2 組織蛋白酶L的性質(zhì)分析

2.2.1 分子量的確定和純度鑒定 SDS-PAGE電泳圖譜(圖4-A)和明膠酶譜(圖4-B)的結(jié)果顯示，純化的蛋白酶呈單一條帶，表明已達(dá)到電泳純。與標(biāo)準(zhǔn)蛋白相比，其分子量約為28ku。

圖4 鮑魚(yú)組織蛋白酶L的純化結(jié)果電泳圖注：A：SDS-PAGE;B：明膠酶譜;M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白;泳道1：純化的組織蛋白酶L。

2.2.2 最適溫度及溫度穩(wěn)定性 溫度對(duì)酶活力的影響如圖5所示。由圖5可知，組織蛋白酶L的最適溫度為37℃。在50℃時(shí)，組織蛋白酶L表現(xiàn)50%的活性，在10℃和0℃時(shí)，分別表現(xiàn)30%和19%的活性，說(shuō)明該酶在低溫下的活性相對(duì)較低，但仍具有活性。

圖5 組織蛋白酶L的最適溫度以及熱穩(wěn)定性

在30℃下放置30min后，酶的活力基本保持不變，而在40℃下放置30min后，酶活下降30%，而50℃下放置30min后，酶活基本喪失，因此，在低于40℃時(shí)，該酶的穩(wěn)定性較好;而當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，該酶的熱穩(wěn)定性較差。

2.2.3 最適pH及pH穩(wěn)定性 如圖6所示，組織蛋白酶L的最適pH為5.5。pH低于4.0時(shí)，組織蛋白酶L的活性在50%以下;而在pH7.0時(shí)酶活基本全部喪失。由此可見(jiàn)，組織蛋白酶L是一種弱酸性蛋白酶，其在pH5.0～6.5范圍內(nèi)活性較穩(wěn)定。

表2 組織蛋白酶L的底物特異性

表3 蛋白酶抑止劑對(duì)組織蛋白酶L的作用效果

表4 金屬離子對(duì)組織蛋白酶L活性的影響

圖6 組織蛋白酶L的最適pH及pH穩(wěn)定性

2.2.4 底物特異性 用不同的熒光底物來(lái)研究酶的底物特異性，結(jié)果如表2所示，該酶對(duì)組織蛋白酶L特異性底物Z-F-R有最強(qiáng)的分解能力，而對(duì)組織蛋白酶B的特異性底物Z-R-R、胰蛋白酶底物B-F-S -R、胰凝乳蛋白酶底物S-L-L-V-Y和氨肽酶底物Arg-MCA基本沒(méi)有分解作用。

2.2.5 蛋白酶抑制劑的作用 各種蛋白酶抑制劑對(duì)組織蛋白酶L活性的抑制效果如表3所示。半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64在0.01mmol/L時(shí)即可完全抑制該酶的活性;胰凝乳蛋白酶抑制劑Chymostatin和絲氨酸半胱氨酸蛋白酶抑制劑Leupeptin對(duì)該酶也有強(qiáng)烈的抑制作用;絲氨酸蛋白酶抑制(PMSF、Benzamidine)和天冬氨酸蛋白酶抑制劑(pepstatin)則不能有效地抑制其活性，而金屬螯合劑 EDTA和EGTA對(duì)組織蛋白酶L活性有一定的激活作用。結(jié)果表明，組織蛋白酶L為一種半胱氨酸蛋白酶。

2.2.6 金屬離子的作用 由表4可知，在濃度為1mmol/L時(shí)，金屬離子Mg2+、Ba2+和Mn2+有一定的激活作用，F(xiàn)e2+和Ca2+能部分抑制酶活性，而Zn2+、Cu2+和Co2+能強(qiáng)烈抑制該酶的活性。

3 討論

通過(guò)一系列柱層析，從雜色鮑內(nèi)臟中純化到了組織蛋白酶L。其分子量約為28ku，該結(jié)果與從鯉魚(yú)肝胰臟(28ku)［11］、大馬哈魚(yú)(30ku)［12］、箭齒鰈肌肉(27ku)［13］中純化的組織蛋白酶L的分子量相類似，但是與從一些魚(yú)體組織中純化的高分子量的組織蛋白酶L不同。有些組織蛋白酶L其分子量高達(dá)50ku，如日本鮐魚(yú)組織蛋白酶 L的分子量為65～69ku［14］，這種現(xiàn)象可能是組織蛋白酶L與其內(nèi)源抑制劑結(jié)合成酶-抑制劑復(fù)合物的結(jié)果造成的。

底物特異性及抑制劑實(shí)驗(yàn)表明，該酶對(duì)組織蛋白酶L底物Z-Phe-Arg-MCA有強(qiáng)烈的分解能力，而對(duì)組織蛋白酶B的特異性底物Z-Arg-Arg-MCA幾乎不分解，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究純化的是組織蛋白酶L。

從溫度特性來(lái)看，純化的雜色鮑內(nèi)臟組織蛋白酶L最適溫度為37℃，在低溫下活力較強(qiáng)，但熱穩(wěn)定性較差。這與從其他動(dòng)物組織中純化的組織蛋白酶L的最適溫度(50～60℃)不同，如鯉魚(yú)肝臟組織蛋白酶L的最適溫度為50℃［11］，箭齒鰈肌肉組織蛋白酶L最適溫度為60℃［13］。推測(cè)可能與鮑魚(yú)的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)，鮑魚(yú)在水溫7℃以下和水溫26℃以上幾乎不生長(zhǎng)，生長(zhǎng)最佳溫度范圍為15～20℃，在正常的棲息水溫(10～30℃)下有較強(qiáng)的活性以維持其生理活動(dòng)。

從pH特性來(lái)看，雜色鮑組織蛋白酶L的最適pH為5.5，在pH5.0～6.5之間具有較好的穩(wěn)定性，是一種弱酸性的酶，這與從其他組織中純化的組織蛋白酶L具有相似的結(jié)果。組織蛋白酶L作為一種溶酶體蛋白酶，具有很重要的生理功能。而這一功能的發(fā)揮，需要組織蛋白酶L的前體在溶酶體的酸性條件下自動(dòng)水解，或在其它蛋白酶作用下水解去掉前體域，形成有活性的成熟的組織蛋白酶。由此可見(jiàn)，這種酶的pH穩(wěn)定性與這種酶存在的環(huán)境所密切相關(guān)，對(duì)其生理功能的發(fā)揮也是很重要的。

組織蛋白酶L是極其重要的溶酶體型半胱氨酸蛋白內(nèi)肽酶［15］。目前，人們普遍認(rèn)為組織蛋白酶L對(duì)陸生動(dòng)物的諸多蛋白有很強(qiáng)的水解活性［16］，也是導(dǎo)致魚(yú)糜凝膠劣化的重要酶類。本文對(duì)雜色鮑內(nèi)臟組織蛋白酶L進(jìn)行了分離純化，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，以期為今后深入研究組織蛋白酶L的生理功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為鮑魚(yú)深加工提供一定的理論依據(jù)。

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Purification and characterization of cathepsin L from abalone(Haliotis Diversicolor)

DONG Xun-jiang，ZHONG Chan，CAI Qiu-feng，CAO Min-jie*
(College of Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China)

Cathepsin L was purified from the hepatopancreas of abalone(Haliotis diversicolor)by ammonium sulfate fractionation，and chromatographies including SP-Sepharose，Sephacryl S-200 gel filtration and hydroxyapatite prepacked column.The molecular mass of the purified enzyme was estimated to be 28ku by SDS-PAGE.Optimum temperature and pH of the purified enzyme were 37℃and 5.5，respectively.The enzyme was stable in the range of pH from 5.0 to 6.5 and at temperature lower than 40℃.Substrate specificity and inhibitor sensitivity analysis revealed that the enzyme was a cysteine proteinase.A survey of effects of metal ions on the enzyme showed that metal ions including Mn2+，Ba2+and Mg2+activated the enzyme to some degree while Co2+，Cu2+，Zn2+，F(xiàn)e2+and Ca2+revealed inhibitory effect.

Haliotis diversicolor;cathepsin L;purification;characterization

TS254.1

A

1002-0306(2011)12-0247-05

雜色鮑(Haliotis diversicolor)屬于軟體動(dòng)物門(mén)，腹足綱，原始腹足目，鮑科，鮑屬。其足部肥大、肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值，是我國(guó)南方沿海地區(qū)的主要養(yǎng)殖品種［1］。2010年，福建鮑魚(yú)產(chǎn)量突破3萬(wàn)t，其中出口鮑魚(yú)產(chǎn)品約7500t，出口總額超過(guò)1億美元。養(yǎng)殖鮑魚(yú)產(chǎn)量的快速增長(zhǎng)，鮑魚(yú)產(chǎn)品的大量出口，不僅為水產(chǎn)養(yǎng)殖戶帶來(lái)利益，也促進(jìn)了福建省海洋經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展。鮑魚(yú)在養(yǎng)殖過(guò)程中，常遇到病毒、細(xì)菌等微生物感染而引起的疾病以及嚴(yán)重時(shí)的大量死亡等問(wèn)題，因此，提高鮑魚(yú)機(jī)體的自身免疫力尤為重要。組織蛋白酶L(EC 3.4.22.15)是半胱氨酸蛋白酶中木瓜蛋白酶C1家族的主要成員，廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌和病毒等生物體內(nèi)，在溶酶體內(nèi)的蛋白水解過(guò)程中起重要作用［2］。組織蛋白酶L作為一種溶酶體蛋白不僅參與生物體內(nèi)各種蛋白水解過(guò)程，還參與許多重要的生命活動(dòng)［3］，如抗原呈遞［4］、寄生蟲(chóng)感染［5］、骨質(zhì)吸收、主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC)降解和細(xì)胞凋亡［6-8］等。因此，組織蛋白酶L與鮑魚(yú)的免疫力密切相關(guān)。在高等動(dòng)物中，組織蛋白酶L由于參與機(jī)體多種生理、病理過(guò)程，備受學(xué)者的關(guān)注，但在貝類動(dòng)物中對(duì)該酶的研究較少，特別是對(duì)鮑魚(yú)組織蛋白酶L的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)從雜色鮑內(nèi)臟中分離純化得到組織蛋白酶L，并研究其酶學(xué)性質(zhì)，以期為探索組織蛋白酶L的生理學(xué)功能提供一定的理論依據(jù)，同時(shí)也可為鮑魚(yú)加工下腳料的回收利用提供新途徑。

2011-09-01 *通訊聯(lián)系人

董訓(xùn)江(1982-)，男，碩士研究生，從事食品生物技術(shù)研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31071519);福建省自然科學(xué)基金(2011J01227)。