羅 曉,王 婷

(1.河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊 050018;2.河北省污染防治生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北石家莊 050018)

固定化真菌處理土霉素廢水的研究

羅 曉1,2,王 婷1,2

(1.河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊 050018;2.河北省污染防治生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北石家莊 050018)

以自行分離培育的毛霉BFL-5優(yōu)勢(shì)菌株為試驗(yàn)菌種,采用海藻酸鹽包埋法制備固定化真菌,經(jīng)活化處理后,進(jìn)行處理土霉素廢水的試驗(yàn),其COD去除率可穩(wěn)定在80%以上,土霉素的降解率可達(dá)95%以上。顯微鏡觀察結(jié)果說明了海藻酸鹽包埋法制備的固定化真菌屬固定化活細(xì)胞,包埋的孢子經(jīng)活化后成長(zhǎng)為菌絲體,因而降解活力顯著增大。

固定化真菌;土霉素;廢水處理;優(yōu)勢(shì)菌株

固定化真菌技術(shù)在促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶方面比懸浮培養(yǎng)有明顯的優(yōu)勢(shì),主要是由于載體有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞以及菌絲體的充分伸展,進(jìn)而促進(jìn)菌體的次生代謝,提高產(chǎn)酶量[1]。近年來這一技術(shù)在廢水生物處理中的應(yīng)用研究與日俱增[2],但是用于處理抗生素廢水方面的研究報(bào)道較少,筆者以土霉素廢水為處理對(duì)象,研究固定化真菌的制備條件及對(duì)土霉素廢水的處理效果。

1 材料和方法

1.1 菌種來源

試驗(yàn)菌種為BFL-5菌株,該菌種是由河北省污染防治生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在采集腐朽樹木上生長(zhǎng)的真菌樣品的基礎(chǔ)上,通過反復(fù)分離、篩選獲得的具有對(duì)廢水脫色能力強(qiáng)并可降解多種有機(jī)污染物的優(yōu)勢(shì)菌株,經(jīng)鑒定該菌株屬毛霉屬(actinom ucor elegans)。

1.2 主要試劑

氫氧化鈉、鹽酸、海藻酸鈉、氯化鈣、葡萄糖、酒石酸鈉、琥珀酸鈉、磷酸等,均為分析純;甲醇為色譜純,土霉素對(duì)照品來自中國(guó)藥品生物制品檢定所,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為88.2%。

1.3 設(shè)備與儀器

試驗(yàn)所用主要設(shè)備與儀器見表1。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 固體培養(yǎng)基

1)制備土豆液:新鮮土豆洗凈去皮后稱取100 g,切成小塊,置于燒杯中,加入500 mL水,加熱至70℃,放置30 min,冷卻后用雙層紗布過濾取其濾液,再定容到500 m L。

2)在上述土豆汁濾液中加入10 g的葡萄糖,1.5 g的 KH2PO4,0.75 g的M gSO4,10 g的瓊脂,加熱攪拌溶解,p H值調(diào)節(jié)為4.5左右。

表1 試驗(yàn)設(shè)備與儀器Tab.1 Instruments and equipments of experiment

3)上述培養(yǎng)基分裝于錐形瓶或試管后放入立式壓力蒸汽滅菌器,在壓力1.14 kPa下,滅菌20 min。滅菌后將錐形瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基趁熱分裝于平皿中制備固體平板培養(yǎng)基。

1.4.2 液體培養(yǎng)基

按上述方法制備1.0 L土豆液加入燒杯中,然后依次加入0.2 g KH2PO4,0.05 g M gSO4·7H2O,0.01 g的CaCl2,10 g的葡萄糖,0.2 g的氯化銨,0.5 mL體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2,0.28 g的酒石酸鈉,0.54 g的琥珀酸鈉,用玻璃棒攪拌使其溶解,分裝于錐形瓶中放入立式壓力蒸汽滅菌器中在壓力為1.14 kPa個(gè)滅菌20 min。

1.4.3 菌種馴化液體培養(yǎng)基

在1 L液體培養(yǎng)基加入50 mg的土霉素配制成菌種馴化液體培養(yǎng)基,用于菌種馴化,使其適應(yīng)降解土霉素[3-5]。

1.5 菌體培養(yǎng)及孢子懸浮液的制備

將試管保存的菌種接種于菌種馴化液體培養(yǎng)基上,30℃恒溫馴化培養(yǎng)48 h,然后轉(zhuǎn)接到平皿固體培養(yǎng)基上,于30℃下培養(yǎng)48 h,待孢子形成后用無菌生理鹽水洗脫孢子,倒入帶有玻璃珠的三角瓶中,充分振蕩使孢子懸浮液均勻,然后在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)測(cè)定出懸浮液孢子濃度,調(diào)節(jié)用水量可以獲得試驗(yàn)所需的不同濃度的孢子懸浮液。

1.6 固定化方法[6]

取100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的無菌海藻酸鈉溶液與100 mL孢子濃度為106個(gè)/mL的孢子懸浮液混合均勻,用注射器將混合液滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的CaCl2溶液中,形成均勻規(guī)則粒徑為3 mm的小球,靜止固化8 h后,用無菌去離子水清洗3次,即制得固定化真菌,收集備用。同時(shí)制備不含真菌的海藻酸鈣小球,做空白對(duì)比試驗(yàn)。

1.7 土霉素含量的測(cè)定方法

采用高效液相色譜法來測(cè)定土霉素含量具有快速、準(zhǔn)確、省時(shí)的特點(diǎn)。本試驗(yàn)所用儀器為日本島津LA-10A高效液相色譜儀;SPD-M 10AVP二極管檢測(cè)器;Shimadzu ODS C18色譜柱(150 mm×6.0 mm,5μm)。測(cè)定土霉素廢水中土霉素含量時(shí)的色譜條件:流動(dòng)相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))磷酸與甲醇(其體積比為40∶60);檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm;進(jìn)樣量為20μL;流量為0.7 m L/min;柱溫為35℃。用此方法土霉素可得到很好地分離,出峰時(shí)間大約為4.9 min,操作簡(jiǎn)單。在此色譜條件下進(jìn)行精密度試驗(yàn),重復(fù)進(jìn)樣5次,RSD值為1.12%;廢水中土霉素質(zhì)量濃度為5～50μg/m L時(shí),與峰面積大小成良好的線性關(guān)系?；貧w方程為y=5×107x+102 846,R2=0.999 7。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化真菌的活化與顯微觀察

以孢子懸浮液為材料制備出來的固定化真菌需要經(jīng)過活化處理才能具有較高的生物活性,方可用于降解廢水的試驗(yàn)?；罨幚淼倪^程是將制備出來的固定化真菌小球于濾紙上吸去外表水分,量取30 m L表觀體積的固定化真菌小球放入裝有100 m L土霉素廢水的錐形瓶中,在30℃,轉(zhuǎn)速為140 rad/m in的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行活化培養(yǎng)24 h,使固定化真菌小球內(nèi)部的孢子萌發(fā),菌絲充分生長(zhǎng)。用照相顯微鏡觀察活化培養(yǎng)前后的固定化真菌小球切片并拍攝圖片。圖1所示為包埋物內(nèi)的孢子,圖2可見固定化真菌小球內(nèi)部生長(zhǎng)著茂密的真菌菌絲(左側(cè)黑色部分)及小球表面的菌絲(右側(cè))。觀察證明海藻酸鹽固定化真菌屬固定化活細(xì)胞,經(jīng)過活化處理后真菌菌絲生長(zhǎng)良好。

2.2 固定化真菌處理土霉素廢水的降解特性

本研究以石家莊市某制藥廠的土霉素廢水為處理對(duì)象,試驗(yàn)廢水的水質(zhì)為ρ(CODCr)=3 674 mg/L,土霉素的質(zhì)量濃度為50.00μg/m L,p H值為5.6。在錐形瓶中加入土霉素廢水,再加入表觀體積為20%的經(jīng)活化處理的固定化真菌小球,放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱振蕩處理,定時(shí)取樣分析。

2.2.1 固定化真菌對(duì)土霉素廢水處理的CODCr去除規(guī)律

上述試驗(yàn)廢水經(jīng)固定化真菌處理后,每隔8 h取樣測(cè)定廢水CODCr的質(zhì)量濃度,并計(jì)算CODCr的去除率,以分析固定化真菌對(duì)土霉素廢水處理的CODCr去除規(guī)律[7-9]。CODCr的測(cè)定結(jié)果及其去除率隨處理時(shí)間的變化見圖3。

圖3 CODCr含量變化曲線Fig.3 Change of CODCrcontent curve

由圖3可知,經(jīng)固定化真菌降解后,土霉素廢水的CODCr質(zhì)量濃度值顯著下降,由原水的3 674 mg/L降低到621 mg/L;去除率穩(wěn)步上升,24 h時(shí)CODCr的去除率為45.4%,48 h時(shí)CODCr的去除率為74.33%,56 h時(shí)CODCr去除率達(dá)到80.23%,此后CODCr去除率維持在80%以上。

2.2.2 固定化真菌的土霉素降解特性

上述試驗(yàn)廢水經(jīng)固定化真菌處理后,每6 h取一次樣,測(cè)定廢水中土霉素的含量[10]。廢水中土霉素的質(zhì)量濃度及其去除率的整理數(shù)據(jù)見表2。

表2 土霉素含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Result content of oxytetracycline

圖4 土霉素質(zhì)量濃度變化曲線Fig.4 Change curve of oxytetracycline contence

土霉素質(zhì)量濃度隨處理時(shí)間的變化曲線見圖4。

由圖4可知,土霉素廢水經(jīng)固定化真菌處理后,廢水中土霉素質(zhì)量濃度顯著下降,降解30 h時(shí)土霉素質(zhì)量濃度由原水的50.00μg/m L降為 8.02μg/m L,降解率達(dá)到83.96%;36 h時(shí)土霉素含量降為 2.97 μg/mL,降解率達(dá)到94.06%,此后土霉素降解率保持穩(wěn)定,維持在95%以上,表明固定化真菌能有效降解土霉素。

2.3 p H值對(duì)降解土霉素的影響

圖5 p H值對(duì)土霉素降解率的影響曲線Fig.5 Curve of influence of p H to oxytetracycline decrease rate

廢水p H值影響生物的活性,因而也影響降解土霉素的效果。試驗(yàn)設(shè)計(jì)一系列不同的p H值來找出降解土霉素的最佳p H值。將土霉素廢水的p H值調(diào)至4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,7.0。控制其他條件不變,處理36 h后取樣過濾,測(cè)定剩余質(zhì)量濃度,計(jì)算土霉素降解率。結(jié)果表明p H值在4.5～5.0降解率最大,達(dá)94.06%。在p H值為4.0和7.0時(shí),降解率分別為90.50%和87.46%。但總體上p H值的變化沒有引起降解率的強(qiáng)烈波動(dòng),而在生產(chǎn)實(shí)際中廢水的p H值經(jīng)常會(huì)有變動(dòng),在一定范圍內(nèi)p H值對(duì)降解土霉素的影響較小,有利于實(shí)際應(yīng)用。土霉素降解率隨p H值變化曲線見圖5。

3 結(jié) 論

1)本研究采用海藻酸鹽包埋法制備固定化真菌的最佳包埋條件:包埋劑海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、固化劑CaCl2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、交聯(lián)時(shí)間為18 h、懸液孢子濃度約為5.0×105個(gè)/m L;制備的固定化真菌經(jīng)活化后具有良好的降解性能。

2)以照相顯微鏡觀察活化培養(yǎng)前后的固定化真菌小球切片,觀察證明海藻酸鹽固定化真菌經(jīng)過活化處理后小球內(nèi)部孢子發(fā)育為真菌菌絲,固定化真菌屬固定化活細(xì)胞。

3)以固定化真菌BFL-5菌株處理土霉素廢水,對(duì)土霉素的降解率可達(dá)95%以上,CODCr去除率可以達(dá)到80%。

4)以固定化真菌BFL-5菌株處理土霉素廢水,其降解土霉素最佳的p H值在4.5～5.0。

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Treatment of oxytetracycline wastewater by immobilized fungus

LUO Xiao1,2,WANG Ting1,2

(1.College of Environmental Science and Engineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang Hebei 050018,China;2.Hebei Key Laboratory of Biological Technique fo r Pollution Control,Shijiazhuang Hebei 050018,China)

One dominant strain of M ucor BFL-5 was separated and cultivated,and used as test organism.A lginate embedding method was used to immobilize fungi,w hich was activated before Terramycin wastewater treatment test.The COD removal rate ismore than 80%,and oxytetracycline degradation rate is up to 95%.M icroscopic observation results show the fungi embedded in alginate are immobilized living cells.Embedded spo res grow into mycelia by activating,thus their oxytetracycline degradation ability is significantly increased.

immobilized fungi;oxytetracycline;wastewater treatment;dominant strain

X703

A

1008-1542(2011)01-0098-05

2010-07-03;責(zé)任編輯:王海云

羅 曉(1973-),男,廣東崖縣人,副教授,博士,主要從事廢水生化處理方面的研究。