林榮生

(廈門(mén)華廈職業(yè)學(xué)院食品藥品安全檢測(cè)中心，福建廈門(mén)361024)

基于抗體微陣列的食源性病原體綜合檢測(cè)平臺(tái)

林榮生

(廈門(mén)華廈職業(yè)學(xué)院食品藥品安全檢測(cè)中心，福建廈門(mén)361024)

針對(duì)超低濃度食源性病原體樣本檢測(cè)的需要，將表面沉積鐵氰酸鎳薄膜的微叉指電極與生物活化的微珠相結(jié)合，設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)了通過(guò)測(cè)定電化學(xué)阻抗變化的抗體微陣列食源性病原體綜合檢測(cè)平臺(tái)樣件。提出了電化學(xué)阻抗等效電路，并通過(guò)電路模型分析表明，生物活化的微珠、微叉指電極之間的電容、溶液的電阻均對(duì)電化學(xué)阻抗傳感單元的輸出特性有顯著影響。以不同濃度的病原體為樣本，完成了Escherichia coli O157∶H7為目標(biāo)病原體的實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該微抗體陣列的檢出極限低至1.0pg/mL，可滿足超低濃度食源性病原體的檢測(cè)需要。

食源性病原體，抗體微陣列，超低濃度，電化學(xué)阻抗，生物活化微珠

1 工作原理與結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

圖1給出了基于抗體微陣列的食源性病原體檢測(cè)平臺(tái)原理示意圖：搜集各種常見(jiàn)食源性病原體樣本，將其固定在抗體淘選(Panning)微系統(tǒng)中;從噬菌體展示抗體庫(kù)中淘選出對(duì)應(yīng)于各種食源性病原體的特征抗體，并將其固化到電化學(xué)阻抗微傳感器陣列中的微電極表面，從而形成針對(duì)多種病原體的抗體微陣列;當(dāng)經(jīng)過(guò)制備的待測(cè)樣本流經(jīng)微傳感器陣列時(shí)，通過(guò)測(cè)定阻抗的變化情況，即可確定樣本中目標(biāo)病原體的存在與否。

圖1 基于抗體微陣列的食源性病原體檢測(cè)平臺(tái)原理示意圖

1.1 抗體微陣列檢測(cè)平臺(tái)

食源性病原體抗體微陣列檢測(cè)平臺(tái)構(gòu)成如圖2所示：(a)為檢測(cè)平臺(tái)樣件原型;(b)為平臺(tái)內(nèi)針對(duì)不同食源性病原體類(lèi)型的抗體微陣列分區(qū)，布置在4英寸的Pyrex 7740玻片上;(c)為以Salmonella為代表，根據(jù)抗原區(qū)分的甲、乙、丙、丁、戊等基本菌屬微陣列分區(qū);(d)為對(duì)應(yīng)于針對(duì)某一特定食源性病原體的ECI傳感單元，包括微通道、微電極以及微電極上的鐵氰酸鎳薄膜等。各抗體微陣列之間通過(guò)微通道結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)互連;微通道結(jié)構(gòu)由聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)經(jīng)SU8模具壓鑄形成。

1.2 ECI傳感單元

ECI傳感單元包括當(dāng)待測(cè)樣本流經(jīng)ECI傳感單元時(shí)，其中存在的目標(biāo)病原體可被ECI單元的電極捕獲;在ECI單元上施加一系列不同頻率的小幅交流電壓，測(cè)量交流電勢(shì)與電流信號(hào)的比值(阻抗)隨正弦波頻率ω的變化，以及阻抗相位角φ隨ω的變化，即可獲知ECI單元中即時(shí)的電極特性，從而確定待測(cè)流體中是否存在目標(biāo)病原體。

圖2 食源性病原體抗體微陣列檢測(cè)平臺(tái)示意圖

為增加ECI電極捕獲目標(biāo)病原體的概率，ECI電極采用叉指微電極(Interdigintated Microelectrodes， IDMs)結(jié)構(gòu)，如圖2(d)所示。叉指微電極除有高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)外，還有便于微型化、響應(yīng)快、高信噪比、易加工等特點(diǎn)［7］。與常規(guī)的三電極結(jié)構(gòu)相比，叉指微電極結(jié)構(gòu)可省去參考電極(Reference electrode)。本文中微電極叉指寬度和間距均為 5mm，長(zhǎng)度為500mm，厚度為100nm，叉指對(duì)數(shù)為25對(duì);采用金(Au)濺射在Pyrex 7740玻片上通過(guò)濕法腐蝕實(shí)現(xiàn)。為增強(qiáng)金電極與玻片基底之間的附著力，在金與玻片之間先濺射鈦/鎘(Ti/Cd)薄膜作為粘附層。

為提高ECI傳感單元的靈敏度，在IDMs表面沉積了一層鐵氰酸鎳(nickel hexacyanoferrate，NiHCF)薄膜。當(dāng)微電極上施加有交流電勢(shì)時(shí)，發(fā)生如(1)式所示的氧化-還原反應(yīng)［11］：

即：溶液中的陽(yáng)離子(K+或Na+)和電子均向陰極區(qū)的NiHCF薄膜遷移;陽(yáng)極區(qū)的NiHCF薄膜則釋放出陽(yáng)離子和電子，如圖3所示。

圖3 氧化-還原反應(yīng)時(shí)，溶液-NiHCF薄膜-電極之間的電荷遷移

此外，NiHCF薄膜還具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：可將6xHis抗體方便地固定到其表面，且與6xHis抗體結(jié)合牢固［12-13］。利用抗體-抗原結(jié)合的特異性，可將目標(biāo)病原體捕獲并固定在微電極表面，改變電極表面的氧化-還原反應(yīng)特性，從而實(shí)現(xiàn)有效檢測(cè)。

1.3 生物活化的微珠

根據(jù)超低濃度目標(biāo)病原體檢測(cè)的需要，為進(jìn)一步提高ECI單元的靈敏度，引入生物活化的微珠(Microbeads)作為捕獲目標(biāo)病原體的輔助工具(圖4)。微珠采用MicrobeadsTM AS的Dynoseeds@TS系列聚苯乙烯(polystyrene，PS)顆粒，直徑為10μm;表面覆涂有與NiHCF薄膜表面固化的同種6xHis抗體。樣本制備時(shí)，生物活化的微珠與樣本預(yù)先混合;由于微珠直徑遠(yuǎn)大于目標(biāo)病原體，如：salmonella菌大小僅為(0.6～0.9μm)×(1～3)μm、Escherichia coli大小為0.5×1μm，且生物活化的微珠濃度較高，因而目標(biāo)病原體易于被生物活化的微珠捕獲，從而增加被微電極固定的幾率。如圖4所示，當(dāng)目標(biāo)病原體被微珠捕獲并被固定于電極表面時(shí)，與6xHis抗體緊密結(jié)合，并呈“三明治”結(jié)構(gòu)。

生物活化微珠的引入，勢(shì)必影響ECI傳感單元的輸出特性：首先，微珠的介電常數(shù)僅為2.1，遠(yuǎn)低于電解質(zhì)溶液的介電常數(shù)(約為75～80);其次，微珠的存在將會(huì)影響陽(yáng)離子的遷移率，從而改變電極NiHCF薄膜上的氧化-還原反應(yīng)特性。藉由微珠引起的電化學(xué)阻抗譜的變化，有望增加ECI傳感單元的靈敏度。

圖4 生物活化的微珠輔助捕獲目標(biāo)病原體

2 ECI單元電路分析

2.1 等效電路

為揭示ECI傳感單元的輸出特性，綜合考慮ECI傳感單元的結(jié)構(gòu)組成，總結(jié)得到如圖5所示的等效電路：Ccell為IDMs之間的電容，其中考慮電解質(zhì)溶液介電常數(shù)的影響;CPE1表示各向異性電極界面上的電容，包括電雙層效應(yīng)電容;CPE2對(duì)應(yīng)于電極表面上陽(yáng)離子的擴(kuò)散效應(yīng)。

圖5 ECI傳感單元等效電路

根據(jù)Retter等的研究結(jié)果［14］，最終可導(dǎo)得總阻抗ZTotal相當(dāng)于NiHCF薄膜阻抗Zfilm與IDMs阻抗Zcell并聯(lián)之和，即：

設(shè)總阻抗的實(shí)部和虛部分別為Ztotal，Re和Ztotal，Im，則有：

利用式(3)～式(5)，可獲得Nyquist或Bode曲線，分析ECI傳感單元的電路特性。

2.2 影響ECI傳感單元輸出特性的因素

2.2.1 生物活化的微珠 首先考慮生物活化的微珠對(duì)ECI單元的影響。圖6給出了有/無(wú)微珠固定條件下，IDMs表面上的電流密度分布情況，通過(guò)Comsol Multiphysics模擬獲得。圖6表明：在有生物活化微珠存在的條件下，微珠明顯影響局部的電流密度分布;這說(shuō)明生物活化微珠的存在，可改變局部的電化學(xué)反應(yīng)特性，從而影響ECI傳感單元的輸出特性。同時(shí)，IDMs上固定微珠數(shù)目的多少，也對(duì)總阻抗有顯著影響。

圖6 生物活化的微珠對(duì)IDMs局部電流密度分布的影響注：(a)無(wú)微珠;(b)有微珠。

2.2.2 Ccell參數(shù)Ccell代表了IDMs本身的特性，同時(shí)也包含了電介質(zhì)(樣本溶液)的影響。圖7分別給出了Ccell對(duì)總阻抗絕對(duì)值大小以及對(duì)總阻抗相位角的影響：當(dāng)Ccell受微珠的影響、其數(shù)值略有減小時(shí)，在較低交流電壓頻率條件下，對(duì)總阻抗絕對(duì)值與相位角的影響不大;而在較高交流電壓頻率條件下，總阻抗絕對(duì)值及相位角均發(fā)生明顯變化，前者略有增大，后者略有降低。

圖7 Ccell對(duì)ECI傳感單元輸出阻抗的影響注：(a)總阻抗絕對(duì)值;(b)總阻抗角頻率。

2.2.3 Rs和Rct等效電路中的Rs為溶液的電阻，直接影響陽(yáng)離子的遷移特性;Rct則是NiHCF薄膜與電極之間電荷遷移相關(guān)的電阻。這兩個(gè)參數(shù)也可影響ECI傳感單元的輸出特性，分別如圖8和圖9所示。

圖8表明，Rs對(duì)ECI傳感單元輸出阻抗的影響顯著;當(dāng)Rs增大時(shí)，ECI單元的阻抗值也顯著增大。圖9則說(shuō)明Rct對(duì)ECI傳感單元的影響比較有限，僅對(duì)較大阻抗的實(shí)部稍有影響。這表明，溶液中陽(yáng)離子擴(kuò)散導(dǎo)致的電阻對(duì)ECI傳感單元的影響更為顯著。引入生物活化的微珠，實(shí)質(zhì)上對(duì)局部陽(yáng)離子的擴(kuò)散有直接影響，而對(duì)NiHCF薄膜與IDMs之間的電子傳輸則影響很小。

圖8 Rs對(duì)ECI傳感單元阻抗的影響

圖9 Rct對(duì)ECI傳感單元阻抗的影響

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)方法

以Escherichia coli O157∶H7為目標(biāo)病原體，對(duì)抗體微陣列檢測(cè)平臺(tái)樣件進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。用高濃度的NaNO3溶液(0.1mol/L)，制備了不同目標(biāo)病原體濃度的待測(cè)樣本，使之依次流經(jīng)表面固化有Escherichia coli O157∶H7抗體的ECI傳感單元。圖10給出了實(shí)驗(yàn)過(guò)程示意圖：(a)待測(cè)樣本與覆涂有相應(yīng)6xHis抗體的生物活化微珠預(yù)先混合;(b)為待測(cè)樣本流入ECI傳感單元的微通道，目標(biāo)病原體被固定在微電極表面;(c)覆涂有其它抗體的微珠被緩沖液沖走，僅剩下目標(biāo)病原體及微珠被固定在NiHCF膜表面。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖10 抗體微陣列實(shí)驗(yàn)過(guò)程示意圖

圖11給出了以Escherichia coli O157∶H7為目標(biāo)病原體實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值對(duì)比。結(jié)果顯示：ECI傳感單元的阻抗變化隨目標(biāo)病原體濃度的增大而增大;ECI傳感單元對(duì)Escherichia coli O157∶H7的檢出最低濃度約為1.0pg/mL。這表明，以IDMs和微珠相結(jié)合的抗體微陣列傳感單元適于檢測(cè)超低濃度的食源性病原體樣本。值得注意的是，實(shí)驗(yàn)測(cè)得的阻抗變化比模型預(yù)測(cè)值要小;其原因是，基于等效電路的模型預(yù)測(cè)與實(shí)際情形仍有一定誤差，有待于在今后的工作中深入研究。

圖11 以Escherichia coli O157∶H7為目標(biāo)病原體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

針對(duì)超低濃度食源性病原體檢測(cè)的需要，采用在微叉指電極上沉積NiHCF薄膜，并引入生物活化的微珠，設(shè)計(jì)并初步實(shí)現(xiàn)了基于電化學(xué)阻抗分析的抗體微陣列食源性病原體綜合檢測(cè)平臺(tái)。通過(guò)對(duì)等效電路的分析和模擬，得出以下結(jié)論：a.微珠對(duì)改變微叉指電極表面局部電化學(xué)反應(yīng)狀況有明顯作用; b.微叉指電極對(duì)之間的電容對(duì)ECI傳感單元的阻抗有一定影響;c.溶液中陽(yáng)離子的遷移對(duì)阻抗特性有顯著影響，NiHCF薄膜與電極之間的電子遷移對(duì)阻抗變化影響很小。

以Escherichia coli O157∶H7為目標(biāo)病原體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基于電化學(xué)阻抗分析的抗體微陣列食源性病原體綜合檢測(cè)平臺(tái)具有極低的檢出極限，可低至1.0pg/mL，適于超低濃度食源性病原體的檢測(cè)需要。在后續(xù)研究中，將進(jìn)一步探索對(duì)該系統(tǒng)的設(shè)計(jì)優(yōu)化工作，以實(shí)現(xiàn)該平臺(tái)的商品化開(kāi)發(fā)。

［1］http://www.who.int/foodsafety/foodborne_disease/general/ en/index.htmL.

［2］Velusamy V，Arshak K，Korostynska O，et al.An overview of foodborne pathogen detection:In the perspective of biosensors［J］.Biotechnology Advances，2010，28:232-254.

［3］Leonard P，Hearty S，Brennan J，et al.Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water［J］.Enzyme and Microbial Technology，2003，32:3-13.

［4］Wang RF，Cao WW，Cerniglia CE.A universal protocol for PCR detection of 13 species of foodborne pathogens in foods［J］. Journal of Applied Microbiology，1997，83:727-736.

［5］Artault S，Blind JL，Delaval J，et al.Detecting Listeria monocytogenes in food［J］.International Food Hygiene，2001，12 (3):23.

［6］Hagens S，Loessner MJ.Application of bacteriophages for detection and control of foodborne pathogens［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，76(3):513-519.

［7］Varshney M，Li Y.Interdigitated array microelectrodes based impedance biosensors for detection of bacterial cells［J］. Biosensors and Bioelectronics，2009，24:2951-2960.

［8］Yang LJ，Li YB，Griffis CL，et al.Interdigitated microelectrode (IME)impedance sensor for the detection of viable Salmonella typhimurium［J］.Biosensors and Bioelectronics，2004，19:1139 -1147.

［9］Yang L，Bashir R.Electrical/electrochemical impedance for rapid detection offoodborne pathogenic bacteria［J］. Biotechnology Advances，2008，26:135-150.

［10］Kim HJ，Park SH，Lee TH，et al.Microarray detection of food -borne pathogens using specific probes prepared by comparative genomics［J］.Biosensors and Bioelectronics，2008，24:238-246.

［11］Yang MH，Yang YH，Qu FL，et al.Attachment of Nickel Hexacyanoferrates Nanoparticles on Carbon Nanotubes: Preparation，Characterization and Bioapplication［J］.Analytica Chimica Acta，2006，571(2):211-217.

［12］王淑敏，屈建瑩.鐵氰酸鎳膜修飾金電極的研制及應(yīng)用［J］.化學(xué)研究，2008，19(3):79-83.

［13］Chen W，Tang J，Cheng H，et al.A simple method for fabrication of sole composition nickel hexacyanoferrate modified electrode and its application［J］.Talanta，2009，80:539-543.

［14］Retter U，Widmann A，Siegler K，et al.On the impedance of potassium nickel hexacyanoferrate composite electrode-the generalization of the Randles model referring to inhomogeneous electrode materials［J］.Journal of Electroanalytical Chemistry，2003，546:87-96.

Comprehensive platform for detecting foodborne diseases pathogens based on antibody microarrays

LIN Rong-sheng
(Testing Lab for Food and Drug Safety，Xiamen Huaxia Vocational College，Xiamen 361024，China)

With the aim to solve the difficulty in detection of ultra-low level foodborne disease pathogens on the spot，a comprehensive antibody microarray platform for rapid detection of multiple foodborne disease pathogens had been designed and realized.By combination of interdigitated microelectrodes(IDMs)deposited with thin nickel hexacyanoferrate film and bioactivated microbeads，the electrochemical impedance(ECI)cell had been rendered with a good sensitivity.An equivalent circuit was proposed to analysis the effects from the parameters of the ECI cell.It was found the existence of the microbeads，capacitance between the IDMs，and resistance in the solution could influence of the impedance of the ECI cell.Witht Escherichia coli O157∶H7 as the target pathogens， experiments were carried out with different concentration of target.The experimental results showed a good detection limitation at 1.0pg/mL.It indicated that the antibody microarray platform was suitable for ultra-low level detection of foodborne disease pathogens.

foodborne pathogens;antibody microarray;ultra-low level;electro-chemical impedance;bioactivated microbeads

TS207.3

A

1002-0306(2011)12-0489-05

食源性病原體，如：Campylobacter、Salmonella、Listeria monocytogenes，Escherichia coli O157∶H7，已被世界衛(wèi)生組織(WHO)確認(rèn)是導(dǎo)致食品污染、影響公共食品安全的元兇［1-2］。能否在短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確測(cè)定樣本中含有病原體，特別地，探測(cè)低濃度以及超低濃度樣本中病原體是否存在，對(duì)于在第一時(shí)間采取措施、防止發(fā)生食品中毒，具有重要意義。常規(guī)的食源性病原體檢測(cè)方法，能夠定性和定量地測(cè)定病原體的存在，具有較高的靈敏度;然而，其檢測(cè)時(shí)間通常需要數(shù)小時(shí)至數(shù)天不等，并且需在專門(mén)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成［3］，例如：NF EN ISO 11290-1法檢測(cè)單核細(xì)胞增多性李斯特菌需要 7d時(shí)間方可得到結(jié)果［4］; polymerase chain reaction (PCR) 和 Reversal Transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)檢測(cè)常規(guī)食源性病原體，也需要在6～8h的微生物培養(yǎng)之后才能進(jìn)行［5］;此外，采用噬菌體技術(shù)檢測(cè)食源性病原體雖然具有快速的特點(diǎn)，但卻不適用于超低濃度樣 本 檢 測(cè)［6］。電 化 學(xué) 阻 抗 (Electrochemical Impedance，ECI)傳感技術(shù)已經(jīng)在用于病原體的生物傳感器中獲得應(yīng)用［7］。Yang等人［8-9］采用差指微電極作為阻抗傳感器研究了活性Salmonella的快速檢測(cè)，記錄了4種頻率下阻抗增長(zhǎng)曲線、阻抗隨細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間的變化曲線，結(jié)果表明，對(duì)濃度為5.4×105CFU/mL的樣本檢測(cè)時(shí)間僅為2.2h。具有高通量特征的微陣列芯片［10］，為開(kāi)發(fā)針對(duì)多種病原體的綜合檢測(cè)，提供了有效的解決方案。本文將電化學(xué)阻抗傳感技術(shù)與抗體微陣列相結(jié)合，把對(duì)應(yīng)于常見(jiàn)食源性病原體的抗體集成到微陣列中，并應(yīng)用微珠(Microbeads)增強(qiáng)阻抗變化信號(hào)，設(shè)計(jì)便攜的食源性病原體綜合檢測(cè)平臺(tái)，尤其適用于超低濃度食源性病原體樣本的預(yù)防性檢測(cè)。

2010-12-23

林榮生(1964-)，男，副主任，研究方向:食品藥品檢測(cè)、有機(jī)高分子材料科學(xué)與工程。