趙 珊，許加超，付曉婷，高 昕

(中國(guó)海洋大學(xué)食品學(xué)院，山東青島266003)

褐藻寡糖分子量測(cè)定方法的研究

趙 珊，許加超*，付曉婷，高 昕

(中國(guó)海洋大學(xué)食品學(xué)院，山東青島266003)

主要研究了快速、準(zhǔn)確的褐藻寡糖分子量測(cè)定方法。通過(guò)高壓降解和氧化降解法制備出褐藻寡糖A和B，分別采用烏式黏度法和高效液相色譜法測(cè)定其分子量。結(jié)果顯示:烏式黏度法測(cè)得A和B的分子量分別是7300和5050;高效液相色譜法測(cè)得A、B的分子量分別是10666和7935。兩種方法測(cè)得的分子量趨勢(shì)關(guān)系基本相似，但是分子量數(shù)值相差較大。因?yàn)闉跏险扯扔?jì)測(cè)量其特性粘度值，不能直接求出絕對(duì)平均分子量，是通過(guò)經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算所得;而在高效液相色譜法(HPLC)中，以分子量對(duì)數(shù)(lgMw)對(duì)保留時(shí)間(t)進(jìn)行回歸處理，得到線(xiàn)性回歸方程:lgMw= -2.0338t+25.834，R2=0.9926，回歸關(guān)系較好。綜上所述，HPLC具有效率高，速度快，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，分辨率高等特點(diǎn)，更適合分子量的測(cè)定，為褐藻寡糖分子量的測(cè)定提供了有利的科學(xué)依據(jù)。

褐藻寡糖，分子量，烏式黏度法，高效液相色譜法

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

褐藻酸 由青島黃海制藥股份有限公司晶巖生物科技提供;標(biāo)準(zhǔn)系列葡聚糖 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，分子量分別為 4320、12600、60600、110000、289000、521000g/mol。

手提式壓力蒸汽滅菌鍋(YXQG02) 山東新華醫(yī)療器械有限公司;高速離心機(jī)(TDL-5-A) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng);烏氏粘度計(jì) 上海申誼玻璃制品有限公司;恒溫水槽(溫度波動(dòng)不大于 ±0.05℃); Aglient1100高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司;TSK -GelGMPWXL色譜柱 日本Tosoh Bioscience公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 褐藻寡糖制備 將12g褐藻酸置于錐形瓶，加入150mL蒸餾水(pH約為2.43)，分為2份。A份不作處理，B份加入1%的H2O2。將兩份樣品分別放入高壓滅菌鍋中，在121℃高壓條件下降解2h。取出后加入2倍體積無(wú)水乙醇，沉淀完全后，滴加5mol/L NaOH，不斷攪拌調(diào)至pH8.5，并維持0.5h以上。將轉(zhuǎn)化好的褐藻寡糖置于離心杯中，5000r/min離心15min。離心后棄去上清液，將沉淀平攤于表面皿上，置于50～60℃干燥箱內(nèi)4h，得褐藻寡糖A和褐藻寡糖B。

1.2.2 烏氏黏度法測(cè)定褐藻寡糖分子量

1.2.2.1 配制待測(cè)溶液 分別稱(chēng)取105℃干燥6h的兩種褐藻寡糖0.5g，撒于約50mL的0.1mol/L NaCl溶液中(內(nèi)含0.05%EDTA-2Na)，放置24h后溶解并稀釋至l00mL，待測(cè)。

1.2.2.2 特性粘數(shù)的測(cè)定 將上述溶液分別用G3砂型漏斗抽濾，棄去初濾液(約1mL)，取續(xù)濾液(不得少于7mL)，按照中國(guó)藥典烏式粘度法測(cè)定特性黏數(shù)［η］。

式中：T為待測(cè)液的流出時(shí)間，s;T＜［0］＞為溶劑的流出時(shí)間，s;η＜［r］＞為T(mén)/T＜［0］＞，100mL/g; c為供試液的濃度，g/mL［8］。

1.2.2.3 計(jì)算分子量 根據(jù)Mark-Houwink公式［η］=KMwα，根據(jù)文獻(xiàn)［11］，取K=2.0×10-5、α=1代入，計(jì)算兩種褐藻寡糖分子量。

1.2.3 高效液相色譜法測(cè)定褐藻寡糖分子量

1.2.3.1 色譜條件［12-13］色譜儀：Agilent 1100高效液相色譜儀(HPLC);色譜柱：TSK-gel GM PWxl色譜柱;檢測(cè)器：示差檢測(cè)器(RID);流動(dòng)相：0.2mol/L NaCl(用0.45μm玻璃砂芯過(guò)濾裝置過(guò)濾并脫氣);流速：0.5mL/min;柱溫：40℃;進(jìn)樣體積：20μL。

1.2.3.2 溶液的制備 將葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品分別溶于流動(dòng)相中，使其終濃度為1g/L，振搖，室溫放置過(guò)夜，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)行HPLC分析。記錄6種色譜圖，以峰位保留時(shí)間(t)為橫坐標(biāo)，重均分子量的對(duì)數(shù)值(lgMw)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.3.4 褐藻寡糖分子量的測(cè)定 將1.2.1制備的兩種褐藻寡糖溶于流動(dòng)相中，使其終濃度為1g/L，振搖，室溫放置過(guò)夜，在“1.2.3.1”項(xiàng)的色譜條件下，進(jìn)行HPLC分析，記錄峰位保留時(shí)間。根據(jù)待測(cè)樣品出峰時(shí)間以及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算樣品的分子量。

2 結(jié)果與討論

2.1 烏氏黏度法測(cè)定褐藻寡糖分子量

烏式黏度法測(cè)定的褐藻寡糖分子量結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 烏式黏度法測(cè)定的褐藻寡糖分子量(n=3，t=(25±0.05)℃)

2.2 高效液相色譜法測(cè)定褐藻寡糖分子量

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 將葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品依次進(jìn)行HPLC分析后發(fā)現(xiàn)，圖譜均只出現(xiàn)一個(gè)吸收峰，峰寬較窄且峰形較好。分子量與保留時(shí)間對(duì)應(yīng)關(guān)系，如表2所示。以標(biāo)準(zhǔn)品的分子量對(duì)數(shù)(lgMw)對(duì)保留時(shí)間(t)進(jìn)行回歸處理，得到線(xiàn)性回歸方程：lgMw=-2.0338t+25.834，R2=0.9926，表明回歸關(guān)系較好，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品分子量與保留時(shí)間的對(duì)應(yīng)表

圖1 分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2.2 褐藻寡糖分子量的測(cè)定 褐藻寡糖A、B的高效凝膠色譜圖，分別如圖2和圖3所示。

圖2表明，褐藻寡糖A的色譜圖峰寬較窄且峰形較好，分離效果較好，出峰時(shí)間為17.642min。

圖3表明，褐藻寡糖B的色譜圖峰寬較窄且峰形較好，分離效果較好，出峰時(shí)間為17.903min。

根據(jù)樣品保留時(shí)間及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求出分子量，結(jié)果如表3所示。

圖2 褐藻寡糖A色譜圖

圖3 褐藻寡糖B色譜圖

表3 高效液相色譜法測(cè)定的褐藻寡糖分子量

結(jié)果表明，兩種方法測(cè)得的分子量趨勢(shì)關(guān)系基本相似，但是分子量數(shù)值相差較大，烏式黏度法測(cè)得的分子量小于高效液相色譜法測(cè)得的分子量。

3 結(jié)論

本文通過(guò)高壓降解和氧化降解的方法制備出褐藻寡糖。分別通過(guò)烏式黏度法和高效液相色譜法測(cè)定其分子量，結(jié)果表明兩種方法測(cè)得的分子量數(shù)量關(guān)系基本相似，但是分子量數(shù)值相差較大，烏式黏度法測(cè)得的分子量小于高效液相色譜法測(cè)得的分子量。對(duì)于測(cè)定方法而言，烏式粘度計(jì)實(shí)驗(yàn)儀器易得，實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，但儀器的使用和清洗費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且用烏氏粘度計(jì)測(cè)量其特性粘度值，不能直接求出絕對(duì)平均分子量，而是間接地通過(guò)經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算，所以會(huì)帶來(lái)較大的誤差;另一種方法，HPLC法具有效率高，速度快，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，分辨率高，樣品用量少，容易回收使用等優(yōu)點(diǎn)，本文以分子量對(duì)數(shù)(lgMw)對(duì)保留時(shí)間(t)進(jìn)行回歸處理，得到線(xiàn)性回歸方程：lgMw=-2.0338t+25.834，R2=0.9926，回歸關(guān)系較好。綜上所述，HPLC法更適合在分子量測(cè)定方面的廣泛應(yīng)用。本文為褐藻寡糖分子量的測(cè)定工作提供了有利的科學(xué)依據(jù)。

［1］成躍祖.凝膠滲透色譜法的進(jìn)展及其應(yīng)用［J］.北京:中國(guó)石化出版社，1993，54(11):5-14.

［2］Hirsh J，Anand SS，Halperin J，et al.Guide to anticoagulant therapy:heparin.A statement for healthcare professionals from the American Heart Association［J］.Circulation，2001，103(24): 2994-3018.

［3］甘純璣，林權(quán).褐藻酸鈉的高效凝膠色譜行為及其分子量參數(shù)測(cè)定［J］.色譜，1997，15(2):147-149.

［4］甘純璣.褐藻酸鈉溶液的超聲輻照效應(yīng)及其對(duì)分子量參數(shù)的影響［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，1995，16(12):1956-1959.

［5］楊釗，范瑩.不同降解方法制備褐藻膠甘露糖醛酸寡糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2007，28(1):69-71.

［6］吳揚(yáng)蘭，王遠(yuǎn)亮，楊亞聯(lián)，等.GPC_十八角激光光散射聯(lián)用法測(cè)定聚乳酸的分子量及分子量分布［J］.現(xiàn)代科學(xué)儀器，1997，2(8):87-90.

［7］劉長(zhǎng)福，劉濤，劉秀梅.高效液相色譜法測(cè)定香菇多糖的分子量［J］.化學(xué)工程師，2005，118(7):91-92.

［8］聶少平，謝明勇，申明月，等.應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定茶葉多糖［J］.食品科學(xué)，2006，27(4):177-181.

［9］陳小蒙，劉成梅，劉偉.龍牙百合多糖的純化及其分子量的測(cè)定［J］.食品科學(xué)，2008，29(11):305-307.

［10］楊迪.凝膠色譜測(cè)定聚合物相對(duì)分子質(zhì)量及其分布［J］.現(xiàn)代塑料加工應(yīng)用，2005，17(6):63-93.

［11］Olav smidsrqd and Arne haug.A light scattering study of alginate［J］.Acta Chemical Scandinavica，1968，22:797-810.

［12］甘純璣，林權(quán)，等.褐藻酸鈉的貯藏穩(wěn)定性及分子量參數(shù)測(cè)定［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1996，31(12):958-962.

［13］王賽貞，林樹(shù)錢(qián)，林志彬，等.高效凝膠滲透色譜法測(cè)定雙靈固本散中多糖肽的峰位分子量［J］.中成藥，2007，29(9): 1386-1388.

Study on the determination method of molecular weight of alginate oligosaccharide

ZHAO Shan，XU Jia-chao*，F(xiàn)U Xiao-ting，GAO Xin
(College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China)

A rapid and accurate determination method of molecular weight of alginate oligosaccharide was studied. Alginate oligosaccharide A and B were degradated by oxidation and high pressure，and their molecular weight were determined respectively by ubbelohde viscometer and high performance liquid chromatography(HPLC).It was showed that，molecular weights of A and B were just 7300 and 5050，by ubbelohde viscometer，which were 10666 and 7935 however by HPLC.The molecular weights determined by two different methods coincided with each other but varied greatly.It was because that，the molecular weight determined by ubbelohde viscometer was calculated in empirical equation，not the absolute value;however，by HPLC，the linear regression equation was established between the log number of molecular weight(lgMw)and the retention time(t):lgMw=-2.0338t+ 25.834，R2=0.9926，which returned to a good relation.In summary，HPLC was precise，efficiency，smart and simple，which was more suitable for the determination，and provided a theoretical and empirical basis for the molecular weight determination of alginate oligosaccharide.

alginate oligosaccharide; molecular weight; ubbelohde viscometer; high performance liquid chromatography

TS207.3

A

1002-0306(2011)12-0486-03

褐藻酸鈉是由α-L-甘露糖醛酸(M單元)與β-D-古羅糖醛酸(G單元)的鈉鹽組成的多糖化合物，是海帶等褐藻類(lèi)植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)多糖。褐藻酸鈉的質(zhì)量要求未見(jiàn)中國(guó)藥典規(guī)定，褐藻酸鈉早在1938就已收入美國(guó)藥典，褐藻酸在1963年收入英國(guó)藥典。對(duì)于褐藻酸鈉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)英國(guó)準(zhǔn)藥典(BPO)和日本藥局方注解中雖已有規(guī)定，也無(wú)含量及分子量的規(guī)定，分子量的測(cè)定雖然不是藥典標(biāo)準(zhǔn)所必需，但對(duì)于進(jìn)一步探討質(zhì)量也是十分必要的。分子量參數(shù)是決定其使用性能的重要因素。褐藻酸鈉的分子量大小影響其各種性能，如流變性能、成膜性能、溶解性能等［1-2］。褐藻酸鈉屬于多糖，是天然高分子中具有多分散性的聚合物，用不同分子量測(cè)定方法測(cè)定的結(jié)果存在很大差異［3-4］。褐藻寡糖可以用很多方法進(jìn)行制備，包括酸降解法、酶降解法和氧化降解法［5］。采用粘度、沉降平衡、膜滲透、凝膠色譜、光散射等方法測(cè)定褐藻酸鈉的分子量參數(shù)，最常用的決定分子量的方法是在粘性和光散射測(cè)定基礎(chǔ)上計(jì)算而得出的。褐藻酸鈉分子量的測(cè)定方法之一是烏氏粘度法。將褐藻酸鈉溶于一定的溶劑中，用烏氏粘度計(jì)測(cè)量其特性粘度值，根據(jù)特性粘度與分子量之間的關(guān)系公式計(jì)算出其粘均分子量，但該方法不能直接求出絕對(duì)平均分子量，而是間接地通過(guò)經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算，所以精確度較差［6］。高效液相色譜法(HPLC)是測(cè)定物質(zhì)分子量的常用方法，該方法既可測(cè)定分子量的數(shù)值，還可反應(yīng)分子量的分布情況，在國(guó)內(nèi)外已得到廣泛應(yīng)用［7-10］。但該法需采用標(biāo)準(zhǔn)樣品校準(zhǔn)，由于市面上很難購(gòu)得褐藻酸鈉分子量標(biāo)準(zhǔn)品，因此關(guān)于褐藻酸鈉的HPLC測(cè)定鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高壓降解和氧化降解法制備出褐藻寡糖，分別采用烏式黏度法和高效液相色譜法測(cè)定其分子量，并對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行研究。

2010-10-14 *通訊聯(lián)系人

趙珊(1985-)，女，碩士，研究方向:海藻加工與利用。

海洋食品精深加工技術(shù)研究與產(chǎn)業(yè)化示范(2008BAD94B00)。