那治國，馬永強(qiáng)，姚 晶，*，岳文靜，王金山

(1.黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部，黑龍江哈爾濱150086; 2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076)

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的膜固定化研究

那治國1，馬永強(qiáng)2，姚 晶1，*，岳文靜2，王金山1

(1.黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部，黑龍江哈爾濱150086; 2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076)

以臭氧活化后的聚丙烯微孔膜為載體，并以丙烯酸為單體、戊二醛為交聯(lián)劑固定轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。研究了臭氧活化時間、接枝反應(yīng)時間、溫度、單體濃度、莫爾鹽濃度對接枝率的影響，并對固定化條件進(jìn)行研究。確定了最佳固定化條件為:己二胺濃度15%，胺烷基化溫度50℃、時間120min，戊二醛濃度3%，交聯(lián)溫度30℃、45min，酶濃度10mg/mL，固定化時間20h。此條件下載酶量為30.23mg/g膜，酶活力可達(dá)16.9U/g膜。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，固定化，聚丙烯微孔膜

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 江蘇泰興一鳴精細(xì)化工有限公司;聚丙烯微孔膜 北京升河誠信膜科技發(fā)展中心;還原型谷胱甘肽、N-α-CBZ-Gln-Gly、L-Glutamic acid γ-monohydroxamic acid sigma公司。

S-3400型掃描電鏡 日本日立公司;80-2型高速離心機(jī) 上海浦東物理光學(xué)儀器廠;S-54型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;臭氧發(fā)生器 鎮(zhèn)江賽格環(huán)?？萍加邢薰尽?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 聚丙烯微孔膜臭氧處理及接枝方法 將聚丙烯微孔膜用丙酮抽提12h，于40℃條件下干燥6h后稱重(W0)。將樣品放入臭氧反應(yīng)器中進(jìn)行臭氧處理，然后真空脫氣30min，以除去吸附在表面的O3和O2，再用乙醇浸泡10min后，立即進(jìn)行接枝反應(yīng)。溶解一定量的莫爾鹽于水中，向其中加入丙烯酸單體，并將膜浸入溶液中，通氮除氧，于一定的溫度反應(yīng)數(shù)小時。將接枝膜用甲醇抽提12h后用清水沖洗，除去表面均聚物、單體及莫爾鹽，最后于40℃真空干燥6h，稱重(W)，接枝率(GD)按下式計算。

GD(grafting degree，%)=(W-W0)/W0×100%

1.2.2 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的膜固定化方法 將己二胺溶解于去離子水中配成一定濃度的溶液，把丙烯酸接枝膜浸入己二胺溶液中，在不同溫度下振蕩一定時間，取出膜后，用大量去離子水沖洗除去吸附于膜上的己二胺。完成后將膜浸入一定濃度的戊二醛水溶液中，于設(shè)定溫度的空氣振蕩器上振蕩一段時間。取出膜，用大量去離子水沖洗以除去附著于膜上的戊二醛。取上述處理后的膜，浸入10mL一定濃度的經(jīng)預(yù)處理的酶溶液中，于4℃下反應(yīng)數(shù)小時。取出膜后，用大量pH7.0磷酸鹽緩沖液沖洗，除去表面黏附的酶液。將固定化酶膜浸入pH7.0磷酸鹽緩沖液中，于4℃下儲存。研究不同條件對固定化酶膜活力的影響。

1.2.3 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活性的測定 采用Folk和Cole報導(dǎo)的分光 Hydroxamate分析法測定［7］。在37℃條件下酶液與試劑A反應(yīng)10min后，添加試劑B終止反應(yīng)并形成紅色鐵化合物，4000r/min離心15min，上清液于525nm處測定吸光度，用L-谷氨酸γ-單羥肟酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中：試劑A為含0.1mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=6.0)，0.1mol/L羥胺，0.01mol/L還原型谷胱甘肽及0.03mol/L N-α-CBZ-Gln-Gly的混合液;試劑B為3mol/L HCl，12%三氯乙酸濃度及5%FeCl3·6H2O(溶解于0.1mol/L HCl中)等體積混合液。1單位轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活力單位定義為：37℃每min產(chǎn)生1μmol L-谷氨酸γ-單羥肟酸所需酶量(U/mL)。

1.2.4 過氧化物濃度測定［8］臭氧處理后的膜于室溫條件下真空脫氣1h后，放入100mL的錐形瓶中，加入25mL異丙醇，1mL飽和碘化鉀，1mL冰醋酸，將混合物加熱至初沸，保持沸騰2～5min，不時搖動錐形瓶。用Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直到黃色消失。按下式計算過氧化物的濃度GPOOH(mol/cm2)。

GPOOH=(V×C)/(A×1000)

式中：V-滴定所用去的 Na2S2O3溶液的體積(mL);C-Na2S2O3溶液的濃度(mol/L);A-膜的表面積(cm2)。

1.2.5 載酶量的確定 采用凱氏定氮法分別測定固定化前后的聚丙烯微孔膜的蛋白質(zhì)含量，以及清洗固定化酶膜所用磷酸鹽緩沖溶液中的蛋白含量［9］。根據(jù)以下公式計算載酶量：

載酶量(%)=［(C0-C)×V-Cw×Vw］/W ×100%

式中：C0-固定化之前酶溶液中蛋白含量;C-固定化之后酶溶液中蛋白含量;Cw-沖洗固定化酶膜之后，所用磷酸鹽緩沖溶液中的蛋白含量;V-固定化實驗所用酶溶液體積;Vw-沖洗固定化酶膜之后，所用磷酸鹽緩沖溶液體積;W-浸入酶溶液中的膜的質(zhì)量。

1.2.6 掃描電鏡(SEM)觀察酶膜表面形貌 空白膜以及酶固定后的膜在清洗后真空烘干至恒重，將樣品剪成1cm×1cm的小塊，經(jīng)過噴金處理后用SEM觀察，掃描放大倍數(shù)為3000倍。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-谷氨酸γ-單羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

線性回歸方程：y=0.6871x+0.1961，R2=0.9992。

圖1 L-谷氨酸γ-單羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同條件對聚丙烯微孔膜臭氧處理及接枝反應(yīng)的影響

2.2.1 臭氧處理時間對過氧化物濃度的影響 聚丙烯微孔膜經(jīng)臭氧處理后，會在膜的表面引入過氧化物，在不同處理時間下臭氧活化效果見圖2。從圖2中可以看出，當(dāng)臭氧處理時間較短時，膜表面的過氧化物濃度隨著處理時間的延長而增大，但當(dāng)處理時間超過45min時過氧化物濃度增加不明顯。

圖2 臭氧處理時間對過氧化物濃度的影響

2.2.2 接枝反應(yīng)時間對接枝率的影響 分別將經(jīng)過不同時間臭氧處理后的聚丙烯微孔膜進(jìn)行接枝反應(yīng)，考察各膜在不同接枝反應(yīng)時間對膜接枝率的影響，如圖3所示，接枝率隨著接枝時間的延長而增加，但當(dāng)接枝時間達(dá)到2h時，接枝率增加不明顯。當(dāng)臭氧處理時間低于45min時接枝率隨臭氧處理時間的延長而增加，但當(dāng)臭氧處理時間為60min時接枝率接近甚至低于臭氧處理45min的膜，臭氧處理時間為75min時接枝率驟然下降。引起這一現(xiàn)象的原因主要是臭氧活化時間過長，會引起高聚物的降解，產(chǎn)生對材料力學(xué)的影響，膜的通透性變差，從而引起接枝率降低。因此，結(jié)合圖2與圖3確定最佳臭氧處理時間為45min，最佳接枝反應(yīng)時間為2h。

圖3 接枝反應(yīng)時間對接枝率的影響

2.2.3 接枝反應(yīng)溫度對接枝率的影響 將臭氧處理后的聚丙烯微孔膜置于不同溫度下進(jìn)行接枝反應(yīng)，考察不同溫度對接枝率的影響。如圖4所示，接枝率隨溫度的升高而降低，引起這一現(xiàn)象的主要原因是臭氧處理后的膜表面引入過氧化物，加入莫爾鹽后活化接枝的引發(fā)體系為氧化-還原引發(fā)體系，這一體系的活化能比較低，可在較低的溫度下引發(fā)聚合，并且有較快的聚合速率。溫度升高，過氧化物的分解加快，活性自由基的壽命降低，導(dǎo)致聚合過程受抑制，接枝率下降。因此，本實驗接枝溫度確定為20℃。

圖4 接枝溫度對接枝率的影響

2.2.4 單體濃度對接枝率的影響 將臭氧處理后的聚丙烯微孔膜在不同濃度的單體溶液中進(jìn)行接枝，考察單體濃度對接枝率的影響，如圖5所示，接枝率隨單體濃度的增加而增加，當(dāng)單體濃度達(dá)到12%之后，接枝率增加的不明顯，因此本實驗設(shè)定的單體濃度為12%。

圖5 單體濃度對接枝率的影響

2.2.5 莫爾鹽濃度對接枝率的影響 對臭氧處理后的聚丙烯微孔膜進(jìn)行接枝反應(yīng)時需添加一定量的莫爾鹽，并需要考慮莫爾鹽添加量對接枝率的影響。如圖6所示，接枝率隨莫爾鹽添加量的增加而降低，當(dāng)莫爾鹽添加濃度為0.05%～0.15%時，接枝率下降非常緩慢，趨勢平穩(wěn);當(dāng)莫爾鹽濃度為0.15%～0.25%時，接枝率驟然下降;但當(dāng)莫爾鹽添加濃度為0.05%、0.1%時雖然接枝率較高，但體系很粘稠，接枝膜變得粗糙。因此，確定莫爾鹽添加濃度為0.15%，此條件下接枝率可達(dá)40.5%。

圖6 莫爾鹽濃度對接枝率的影響

2.3 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的膜固定化研究

2.3.1 己二胺濃度對固定化酶活性的影響 本實驗考察了不同己二胺濃度對固定化酶膜活力的影響，如圖7所示。當(dāng)濃度低于15%時，固定化酶膜活力隨己二胺濃度的增大而增大，當(dāng)己二胺濃度高于15%時，酶膜活力基本穩(wěn)定，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的主要原因是膜表面的有效位點在己二胺濃度為15%時已經(jīng)能夠被充分占據(jù)，而濃度再繼續(xù)增加也不會增加酶的固定化位點。因此，本實驗確定的最佳己二胺濃度為15%。

圖7 己二胺濃度對固定化酶活性的影響

2.3.2 胺烷基化溫度對固定化酶活性的影響 不同胺烷基化溫度對酶固定化的影響見圖8。由圖8可以看出，固定化酶膜活力隨胺烷基化溫度的升高而升高，當(dāng)溫度為50℃時活力便基本達(dá)到最高值，繼續(xù)加熱上升趨勢緩慢，因此選擇胺烷基化溫度為50℃。原因可能是溫度的升高有助于反應(yīng)物越過過渡態(tài)能壘，從而促進(jìn)酰胺化反應(yīng)的進(jìn)行，進(jìn)而增加了膜表面用于固定化酶的氨基的量。

圖8 胺烷基化溫度對固定化酶活性的影響

2.3.3 胺烷基化時間對固定化酶活性的影響 不同胺烷基化時間對酶固定化的影響見圖9。固定化酶膜活力隨胺烷基化時間的延長而升高，但當(dāng)時間為120min時，活力升高非常緩慢，幾乎趨于平穩(wěn)，說明此時的胺烷基化作用較完全，因此，本實驗選定的最佳胺烷基化時間為120min。

圖9 胺烷基化時間對固定化酶活性的影響

2.3.4 戊二醛濃度對固定化酶活性的影響 分別選定不同濃度的戊二醛為交聯(lián)劑，研究其對酶固定化的影響，結(jié)果如圖10所示，固定化酶膜活力隨交聯(lián)劑濃度的增大而略升高，當(dāng)濃度達(dá)3%時酶膜活力最大，濃度高于3%時酶膜活力有略微的下降，由此可見，濃度為3%的戊二醛溶液就可以使戊二醛分子與酶分子上的氨基化學(xué)鍵充分鍵合，濃度過高時，過多的戊二醛有可能修飾酶分子活性基團(tuán)，從而使酶活略微下降。

圖10 戊二醛濃度對固定化酶活性的影響

2.3.5 交聯(lián)時間對固定化酶活性的影響 實驗結(jié)果如圖11所示，固定化酶膜活力隨交聯(lián)時間的增加而增加，當(dāng)交聯(lián)時間超過45min時，酶活力略微下降，引起這一現(xiàn)象的主要原因可能是時間過長，交聯(lián)程度過高，酶不易參加反應(yīng)，從而活力下降。

圖11 戊二醛交聯(lián)時間對固定化酶活性的影響

2.3.6 交聯(lián)溫度對固定化酶活性的影響 實驗結(jié)果如圖12所示，固定化酶膜活力隨交聯(lián)溫度的升高而升高，當(dāng)溫度為30℃時達(dá)到最高，繼續(xù)升高導(dǎo)致其活力下降，引起這一現(xiàn)象的主要原因是交聯(lián)溫度直接影響交聯(lián)反應(yīng)速度。

2.3.7 酶濃度對固定化酶活性的影響 將經(jīng)過之前環(huán)節(jié)處理后的膜浸入不同濃度的酶液中進(jìn)行固定化反應(yīng)，如圖13所示，當(dāng)酶液濃度在2～8mg/mL范圍內(nèi)酶膜活力顯著上升，濃度在8～10mg/mL范圍時活力上升緩慢，當(dāng)濃度超過10mg/mL時活力基本不再上升。由此可見，當(dāng)酶液濃度為10mg/mL時，膜上的可結(jié)合位點基本全部被占據(jù)，再繼續(xù)升高也僅僅附著在膜的表面，隨后被緩沖溶液清洗掉。因此固定化時的酶濃度確定為10mg/mL。

圖12 戊二醛交聯(lián)溫度對固定化酶活性的影響

圖13 酶濃度對固定化酶活性的影響

2.3.8 固定化時間對固定化酶活性的影響 因為酶的固定化反應(yīng)需要在4℃條件下進(jìn)行，所以需要較長的固定化時間，如圖14所示，當(dāng)固定化時間設(shè)定在5～20h之間時，隨著反應(yīng)時間的延長，固定化酶膜的活力升高，說明膜上酶的固定量增多。當(dāng)反應(yīng)20h之后，反應(yīng)進(jìn)行得比較完全，酶活性增加不顯著。因此，最佳酶固定化反應(yīng)時間為20h。

圖14 固定化時間對固定化酶活性的影響

2.3.9 載酶量的確定 在上述單因素實驗確定的最佳條件下進(jìn)行酶的膜固定化反應(yīng)，經(jīng)測定，此反應(yīng)條件下膜的酶蛋白承載量為30.23mg/g膜，此時的固定化酶膜活力達(dá)到16.9U/g膜左右。

2.4 掃描電鏡(SEM)觀察酶膜表面形貌

本實驗分別對空白膜及固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶膜做掃描電鏡(SEM)，照片如圖15所示，從圖15(a)中可以看出，空白聚丙烯微孔膜是由聚丙烯纖維構(gòu)成，纖維相互錯亂交叉，排列不規(guī)則，但表面很平整光滑。從圖15(b)可看出，此時酶蛋白固定化后的膜表面由于交聯(lián)了蛋白的基團(tuán)，存在一些顆?；驁F(tuán)狀的物體而顯得有些粗糙，而且這些顆粒大小不一，形狀各異，附著在纖維表面，可以說明MTG蛋白已經(jīng)固定在聚丙烯微孔膜上。

3 結(jié)論

3.1 通過臭氧活化方法對聚丙烯微孔膜進(jìn)行活化接枝，研究表明：膜表面的過氧化物濃度隨著處理時間的延長而增大，但是超過45min時過氧化物濃度增加不明顯;并用不同臭氧處理時間下的膜在不同接枝時間下進(jìn)行接枝反應(yīng)，確定了最佳臭氧處理時間為45min，最佳接枝反應(yīng)時間為2h。以接枝率為指標(biāo)確定最佳接枝溫度為20℃、最佳單體濃度為12%、最適量莫爾鹽濃度為0.15%，此條件下的接枝率可達(dá)到40.1%。

圖15 固定化酶膜掃描電鏡圖

3.2 通過單因素實驗研究了己二胺濃度、胺烷基化溫度、胺烷基化時間、戊二醛濃度、戊二醛交聯(lián)時間、戊二醛交聯(lián)溫度、酶濃度、固定化時間對固定化酶膜活力的影響情況，確定了最佳的酶固定化條件：己二胺濃度為 15%，胺烷基化溫度為 50℃、時間為120min;戊二醛濃度為3%，交聯(lián)溫度為30℃、時間為45min;酶液濃度為10mg/mL，固定化時間為20h。在此條件下進(jìn)行酶固定化反應(yīng)，載酶量為30.23mg/g膜，且酶膜活力可達(dá)16.9U/g膜。

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Study on immobilization of transglutaminase on membranes

NA Zhi-guo1，MA Yong-qiang2，YAO Jing1，*，YUE Wen-jing2，WANG Jin-shan1
(1.Department of Food and Environmental Engineering，Heilongjiang East College，Harbin 150086，China; 2.College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China)

Transglutaminase was immobilized on polypropylene microporous membranes by using activated ozone as the carrier，acrylic acid as the monomer and glutaraldehyde as the cross-linking agent.The effect of ozone activation time，grafting time，grafting temperature，monomer concentration and ammonium ferrous sulfate concentration on grafting degree were studied，and immobilization conditions were also studied.It was found the optimal reaction conditions as following:consistency of hexamethylendiamine was 15%，at 50℃ for 120min and consistency of glutaraldehyde was 3%，at 30℃ for 45min，consistency of enzyme was 10mg/mL at 4℃ for 20h.So the immobilized amount of protein could come to 30.23mg/g membrane and the activity of immobilized MTG could come to 16.9U/g membrane.

transglutaminase;immobilization;polypropylene microporous membranes

TS201.2+5

A

1002-0306(2011)12-0243-05

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTG，EC2.3.2.13，全稱為蛋白質(zhì)-谷氨酰胺γ-谷氨酰胺基轉(zhuǎn)移酶)是一種能催化轉(zhuǎn)?；磻?yīng)，催化蛋白質(zhì)中賴氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上的γ-羥酰胺基之間的結(jié)合反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)(或多肽)之間發(fā)生共價交聯(lián)形成共價化合物的聚合酶［1］。它可通過胺的導(dǎo)入、交聯(lián)以及脫胺3種途徑改善蛋白質(zhì)的功能特性［2-3］。但是游離酶在水溶液中很不穩(wěn)定，同時，此酶對熱、高離子濃度、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及部分有機(jī)溶劑等均不夠穩(wěn)定，容易失活而降低其催化能力，這些不足大大限制了酶促反應(yīng)的廣泛應(yīng)用［4］。而固定化酶膜能夠?qū)⒚傅拇呋匦院湍さ膬?yōu)良分離性能有機(jī)地結(jié)合起來［5］，從而可以克服這些不足，成為近年來的研究熱點。聚丙烯微孔膜由于具有良好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，易于控制的微孔結(jié)構(gòu)以及制備方法等特點，得到了廣泛的應(yīng)用。然而，其化學(xué)惰性的表面也為酶固定化帶來了困難。通過接枝聚合，在其表面引入反應(yīng)性官能團(tuán)，進(jìn)而共價結(jié)合酶分子，將是聚丙烯膜上化學(xué)固定酶的一種有效手段［6］。本文采用臭氧活化的方法對聚丙烯微孔膜進(jìn)行處理，以引發(fā)丙烯酸單體接枝在膜表面，并利用戊二醛的交聯(lián)作用對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進(jìn)行膜固定化，研究了臭氧活化、接枝反應(yīng)及固定化條件。

2011-08-23 *通訊聯(lián)系人

那治國(1980-)，男，碩士，講師，研究方向:食品化學(xué)。

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(11553071);國家863計劃項目(2008AA102303)。