楊賢慶，楊 燕，2，馬海霞，李來(lái)好，郝淑賢，魏 涯

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東廣州510300; 2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201300)

酶解羅非魚魚骨粉制備可溶性鈣的工藝研究

楊賢慶1，楊 燕1，2，馬海霞1，李來(lái)好1，郝淑賢1，魏 涯1

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東廣州510300; 2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201300)

采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶酶解羅非魚魚骨粉，以酶解液中可溶性鈣含量、水解度和氮收率為特征性指標(biāo)，利用L16(54)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化水解魚骨粉的工藝條件。結(jié)果表明:采用胃蛋白酶水解魚骨粉，效果優(yōu)于其它三種酶;胃蛋白酶水解魚骨粉的最佳條件是:pH2.0、料液比1∶3、酶用量0.3%、時(shí)間5h、溫度37℃;所得酶解液中鈣含量為23.68g/L，水解度和氮收率分別達(dá)14.07%和56.35%，可溶性氮含量達(dá)97.43%，F(xiàn)e、Zn、Mg、P的含量分別為0.36、3.84、716.67mg/L和10.89g/L。

羅非魚魚骨粉，可溶性鈣，胃蛋白酶，水解度

鈣是人體的必需元素，它不僅是構(gòu)成骨骼組織的重要物質(zhì)，而且在機(jī)體各種生理和生物化學(xué)過程中起著重要作用［1］。鈣離子是凝血因子，參與凝血過程;能直接與肌鈣蛋白結(jié)合引起肌肉收縮;參與激素的合成和分泌、神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放;對(duì)維持細(xì)胞的生存和功能起著重要作用［2］。充足的鈣的攝入可以減少患慢性病的風(fēng)險(xiǎn)，如骨質(zhì)疏松癥、高血壓和腸癌以及大量的其他身體機(jī)能的失調(diào)［3］。補(bǔ)鈣不僅要保證一定鈣含量的攝入，還要保證鈣的有效利用［4］。動(dòng)物骨經(jīng)適當(dāng)處理后可溶性鈣含量增大，有利于腸對(duì)鈣的吸收，能大大提高鈣的生物利用率［5－6］。羅非魚是我國(guó)淡水重要養(yǎng)殖對(duì)象之一，也是我國(guó)具有競(jìng)爭(zhēng)力的優(yōu)勢(shì)出口水產(chǎn)品之一。近年來(lái)我國(guó)羅非魚產(chǎn)量及加工出口量呈逐年上升之勢(shì)。目前，我國(guó)羅非魚的加工產(chǎn)品主要是凍羅非魚片、面包羅非魚和凍全魚，羅非魚在加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量的魚頭、魚排等加工下腳料，以往這些下腳料多作為飼料原料廉價(jià)處理或者被扔掉，附加值很低，而且污染環(huán)境［7－8］。魚骨中除含有蛋白質(zhì)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)元素以外，還含有大量的Ca、Fe、Zn、Mg、P及膠原成分［9］。經(jīng)過酶解的魚骨含有豐富的水溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如多肽、氨基酸等還有大量的可溶性鈣，可以被人體直接吸收，是開發(fā)骨源補(bǔ)鈣產(chǎn)品的良好資源［10］。本實(shí)驗(yàn)以羅非魚加工下腳料魚排為原料制備魚骨粉，對(duì)羅非魚骨粉進(jìn)行酶解，以酶解液中可溶性鈣含量、水解度和氮收率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，選出適宜的蛋白酶和最佳的酶解工藝條件，以充分提高羅非魚骨蛋白及骨鈣的利用率，為今后進(jìn)一步加強(qiáng)羅非魚下腳料的綜合開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍羅非魚魚骨 廣州市恒發(fā)水產(chǎn)有限公司提供;胰蛋白酶 25萬(wàn)U/g，AMRESCO;胃蛋白酶 50萬(wàn)U/g，sigma;木瓜蛋白酶 100萬(wàn)U/g，MERCK;中性蛋白酶 8萬(wàn)U/g，北京奧博星生物科技有限公司;鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液 1000μg/mL，Merck;氧化鑭 天津市福晨化學(xué)試劑廠;鹽酸、氫氧化鈉、硝酸、甲醛等均為分析純;實(shí)驗(yàn)所用水 均為去離子水。

DKN612C恒溫干燥箱 上海進(jìn)申工貿(mào)有限公司;FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 東莞市塘廈興萬(wàn)電子廠;PB－10酸度計(jì) sartorius儀器有限公司;MARS微波消解儀 美國(guó)CEM公司;AA240FS原子吸收光譜儀 美國(guó)Varian公司;DK－S24電熱恒溫水浴鍋上海華巖儀器設(shè)備有限公司;TDZ25－WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī) 湖南滬康離心機(jī)有限公司;HG63鹵素水分測(cè)定儀 瑞士Mettler Toledo公司;2050脂肪自動(dòng)分析儀(索氏抽提系統(tǒng))、2300全自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司;VULCAN 3－550馬弗爐 美國(guó)Neytech公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 新鮮魚排→清洗→蒸煮→清洗→干燥→粉碎過篩→魚骨粉→加酶水解→滅酶→離心→上清液→可溶性鈣液

1.2.2 魚骨粉的制備 用清水將魚排表面污物洗凈，常壓蒸煮2h后，洗去附著的魚肉及去油。105℃烘4h，然后將干燥后的魚骨粉碎成顆粒過篩(孔徑0.15mm)，制得所需的魚骨粉。

1.2.3 蛋白酶的篩選 實(shí)驗(yàn)中分別采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)骨粉進(jìn)行水解。將骨粉與水以1∶4(m/m)比例混合，以酶用量2000U/g蛋白質(zhì)分別加入四種蛋白酶，混勻后分別在各自理論最適宜的溫度和pH(各酶的最適溫度和pH見表1)條件下水解5h后，90℃滅酶10min，然后經(jīng)4000r/min離心10min，得到酶解上清液。取上清液測(cè)定魚骨粉蛋白質(zhì)的水解度、氮收率和可溶性鈣含量。

表1 4種酶的理論最適酶解條件

1.2.4 pH對(duì)水解效果及鈣含量的影響 將骨粉與水以1∶4(m/m)比例混合，在不同pH下分別進(jìn)行酸水解和酶水解，考察在pH分別為1.0、2.0、3.0、4.0、 5.0、6.0時(shí)，胃蛋白酶對(duì)水解液中可溶性鈣含量、總氮和水解度的影響。每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 胃蛋白酶水解工藝條件的優(yōu)化 在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇胃蛋白酶水解魚骨粉，選擇料液比、酶用量、時(shí)間和溫度四因素，以鈣含量、水解度和氮收率為評(píng)定指標(biāo)，采用L16(54)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)胃蛋白酶水解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，其因素水平如表2所示。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表

1.2.6 測(cè)定指標(biāo) 水分測(cè)定:直接干燥法，參照GB/T 5009.3－2003《食品中水分的測(cè)定》執(zhí)行;灰分測(cè)定:灼燒稱重法，參照GB/T 5009.4－2003《食品中灰分的測(cè)定》執(zhí)行;脂肪測(cè)定:索氏抽提法，參照GB/T 5009.6－2003《食品中脂肪的測(cè)定》執(zhí)行;蛋白質(zhì)、總氮量測(cè)定:微量凱氏定氮法，參照GB/T 5009.5－2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》執(zhí)行;鈣、鐵、鋅、鎂含量的測(cè)定:原子吸收法，參照GB 5413.21－2010《嬰幼兒食品和乳品中鈣、鐵、鋅、鈉、鉀、鎂、銅和錳的測(cè)定》執(zhí)行;磷的測(cè)定:參照GB/T5009.87－2003《食品中磷的測(cè)定》執(zhí)行。上清液中氨基態(tài)氮測(cè)定:甲醛電位滴定法［11］。酶解液中可溶性氮含量的測(cè)定［12］:將10mL 20%三氯乙酸溶液加到10mL酶解液中，混合振蕩，靜置60min后于4000r/min離心20min，取上清液測(cè)定總氮量。

可溶性氮(%)=三氯乙酸上清液中總氮含量/酶解液中總氮含量×100%

水解度DH(%)=(上清液中氨基酸態(tài)氮含量×上清液體積)/(原料氮含量×原料質(zhì)量)×100%

氮收率(%)=(上清液中氮含量×上清液體積)/(原料氮含量×原料質(zhì)量)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚骨粉的基本成分

羅非魚骨粉的基本成分見表3。

表3 羅非魚魚骨粉的基本成分

2.2 最佳水解酶種類的確定

由表4可知，在酶用量相同的情況下，四種酶酶解與空白對(duì)照相比均差異極顯著(P＜0.01)，其中胃蛋白酶酶解液中的鈣含量、水解度和氮收率均顯著高于其它三種酶(P＜0.01)，分別是14.45g/L，9.89%和41.04%。四種酶的酶解液中鈣含量大小順序依次為:胃蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶，水解度和氮收率大小順序依次均為胃蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶。四種酶的水解度和氮收率呈正相關(guān)，而水解度和氮收率高，鈣含量不一定相應(yīng)地增高。胃蛋白酶是一種酸性蛋白酶，能分解蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸或酸性氨基酸的氨基所組成的肽鍵，而胰蛋白酶只斷裂精氨酸或賴氨酸羧基端的肽鍵，Ca2+、Mg2+等金屬離子可降低其活性，木瓜蛋白酶有較廣泛的特異性，對(duì)動(dòng)植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強(qiáng)的水解能力，同時(shí)，還具有合成功能，能把蛋白水解物合成為類蛋白質(zhì)，中性蛋白酶能斷裂蛋白質(zhì)中亮氨酸和苯丙氨酸的肽鍵［13］。采用胃蛋白酶水解魚骨粉，鈣含量、水解度和氮收率較高，可能與骨粉液的pH有關(guān)，胃蛋白酶酶解時(shí)需將pH調(diào)至2.0左右，酸對(duì)蛋白水解亦有影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇胃蛋白酶，且進(jìn)一步考察pH對(duì)水解效果的影響。

表5 pH和胃蛋白酶的水解效果對(duì)照

表4 四種酶水解魚骨粉結(jié)果比較

2.3 pH對(duì)水解效果及鈣含量的影響

固定料液比為1∶4(m/m)，水解溫度37℃，水解時(shí)間5h，加酶量為 2000U/g蛋白質(zhì)，水解效果見表5。

由表5可知，兩種水解方式都能達(dá)到一定的水解效果且有利于鈣的溶出，pH接近中性時(shí)酸水解和酶水解效果很低，在pH2.0左右時(shí)水解效果都明顯提高。由于酸水解過程中隨著水解液中pH的下降，H+增多，骨蛋白展開程度增大，肽鍵斷裂，分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露在分子表面，羥磷灰石毫無(wú)保護(hù)的裸露出來(lái)，在H+作用下，水解度增大，可溶性鈣含量逐漸增多［10］。從結(jié)果可知，低pH有利于鈣的溶出，pH1.0時(shí)可溶性鈣含量最高，但水解度和氮收率低于添加胃蛋白酶水解組。這是由于酸和胃蛋白酶協(xié)同作用的結(jié)果，在酸性條件下，骨蛋白有一定程度的水解，同時(shí)肽鍵的暴露，容易受到蛋白酶的攻擊，增加其對(duì)酶的敏感性。胃蛋白酶水解在pH2.0時(shí)水解度和氮收率最高，pH1.0時(shí)胃蛋白酶活性被抑制，水解效果較低。綜合考慮上清液中的鈣含量和水解效果，過低的pH易對(duì)氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)造成破壞［14］，故選用胃蛋白酶在pH2.0條件下水解羅非魚魚骨粉。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化胃蛋白酶水解工藝條件

根據(jù)因素水平表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，測(cè)定酶解液的鈣含量、水解度和氮收率，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 極差分析與討論 由表7極差分析可知，A、B、C、D對(duì)鈣含量、氮收率的影響大小均是:A＞D＞C＞B，最優(yōu)組合分別為A2B2C3D2、A2B3C3D2;對(duì)水解度的影響為:A＞D＞B＞C，最優(yōu)組合為A2B3C4D2。從影響鈣含量、水解度和氮收率的各因素水平均值可以看出，料液比為1∶3時(shí)酶解液的鈣含量、水解度和氮收率都為最高。料液比過高或過低都不利于鈣的溶出，同時(shí)也不利于蛋白質(zhì)的水解，這是因?yàn)轸~骨中的鈣大多是以羥磷灰石結(jié)晶形式存在的，羥磷灰石中磷酸鈣和氫氧化鈣是鈣離子在魚骨中的主要存在形式［15］。同時(shí)由于魚骨中存在大量的蛋白質(zhì)，骨中的羥磷灰石與膠原纖維有機(jī)結(jié)合，在外部還有水合殼的保護(hù)［16－17］。因此，魚骨中鈣含量雖然豐富，但游離鈣含量很少。只有去除外圍的膠原纖維，酸堿才能作用于羥磷灰石上，使骨鈣轉(zhuǎn)換為游離鈣。當(dāng)?shù)孜餄舛容^高時(shí)，水解液的粘度增大，影響胃蛋白酶的擴(kuò)散，不利于酶與底物充分接觸，而當(dāng)料液比大于1∶3時(shí)，底物濃度較小，酶未與骨粉充分接觸，不利于水解。在37℃時(shí)鈣含量、水解度和氮收率都最高，這是由于溫度影響蛋白酶的活性，溫度過低會(huì)抑制酶活，溫度過高則會(huì)加速胃蛋白酶的失活，不利于包圍在魚骨外面的膠原纖維的解開，骨鈣未能充分裸露出來(lái)，從而影響鈣的溶出。在鈣含量考察指標(biāo)中酶用量為0.3%時(shí)可溶性鈣含量最高，而水解度和氮收率均在酶用量為0.4%時(shí)最高。酶解液中鈣含量和氮收率在酶解5h效果最好，水解度在酶解時(shí)間為6h時(shí)最高，因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的增加，水解效果逐漸增強(qiáng)，超過一定酶解時(shí)間，酶活力下降不利于水解。

表7 極差分析表

表8 方差分析表

表9 水解產(chǎn)物成分分析

2.4.2 方差分析與討論 在方差分析的基礎(chǔ)上，計(jì)算各因素對(duì)考察指標(biāo)變異的貢獻(xiàn)率(因素平方和與總平方和之比)見表8。貢獻(xiàn)率的大小可對(duì)因素的重要程度進(jìn)行量化，某一因素的平方和對(duì)總平方和的貢獻(xiàn)率越大，則表示該項(xiàng)因素對(duì)該評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響能力越強(qiáng)［18］。

由表8可知，A、D對(duì)鈣含量均可視為重要影響因素，其中A達(dá)到極顯著水平、貢獻(xiàn)率達(dá)70.2%，D達(dá)到顯著水平、貢獻(xiàn)率為16.0%;A、B、D可視為水解度的重要影響因素，其中A達(dá)到顯著水平，貢獻(xiàn)率分別為48.5%、19.9%、18.8%;A對(duì)氮收率的影響達(dá)到顯著水平，貢獻(xiàn)率為54.3%，D的貢獻(xiàn)率也達(dá)到24.0%，但沒達(dá)到顯著水平。

2.4.3 最優(yōu)水平組合的確定 由直觀分析表可知，不同評(píng)價(jià)指標(biāo)下各因素的最優(yōu)水平存在一定的差異，但表8中的方差分析和因素貢獻(xiàn)率表明在確定最優(yōu)水平時(shí)應(yīng)優(yōu)先考慮酶解液中的鈣含量，然后考慮水解度和氮收率。同時(shí)根據(jù)顯著性分析，可以確定料液比為1∶3，溫度為37℃最佳。酶用量和時(shí)間均為不顯著因素，從經(jīng)濟(jì)成本考慮，選擇酶用量為0.3%，酶解時(shí)間 5h。據(jù)此最優(yōu)水平組合應(yīng)為A2B2C3D2，即料液比1∶3，酶用量0.3%，時(shí)間5h，溫度37℃。在所得酶解液中鈣含量為23.68g/L，水解度14.07%，氮收率56.35%。

2.5 水解產(chǎn)物成分分析

魚骨中不僅含有豐富的蛋白質(zhì)，還含有大量的Ca、Fe、Zn、Mg、P及膠原成分。三氯乙酸中可溶性氮含量是評(píng)價(jià)水解產(chǎn)物中小分子肽類的重要指標(biāo)［19］?？扇苄缘吭礁?，表明產(chǎn)物中小分子肽類越多。根據(jù)胃蛋白酶最佳水解條件進(jìn)行水解，測(cè)得三氯乙酸中可溶性氮含量為97.43%，結(jié)果表明，胃蛋白酶水解產(chǎn)物中絕大部分為小分子肽類，可溶性較高。水解產(chǎn)物主要成分分析見表9。

3 結(jié)論

3.1 實(shí)驗(yàn)用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶四種酶酶解羅非魚骨粉，結(jié)果表明，胃蛋白酶酶解效果優(yōu)于其它三種酶(P＜0.01)，得到的酶解液鈣含量、水解度和氮收率最高。

3.2 在低pH條件下，添加胃蛋白酶能顯著提高羅非魚骨粉水解液中的鈣含量、水解度和氮收率，當(dāng)pH為2時(shí)，胃蛋白酶酶解羅非魚骨粉效果最好，鈣含量、水解度和氮收率達(dá)到最大值。

3.3 胃蛋白酶酶解魚骨粉的最佳條件:pH2.0、料液比1∶3、酶用量 0.3%、時(shí)間 5h、溫度 37℃，鈣含量為23.68g/L，水解度和氮收率分別達(dá)到14.07%和56.35%。

3.4 胃蛋白酶水解產(chǎn)物中可溶性氮達(dá)到97.43%，表明水解產(chǎn)物多為低分子肽類，可溶性高。水解液中Fe、Zn、Mg和P的含量分別為0.36、3.84、716.67mg/L和10.89g/L。

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Enzymatic hydrolysis of tilapia bone for preparing the soluble calcium

YANG Xian－qing1，YANG Yan1，2，MA Hai－xia1，LI Lai－h(huán)ao1，HAO Shu－xian1，WEI Ya1
(1.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，National Research and Development Center for Aquatic Product Processing，Guangzhou 510300，China; 2.College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201300，China)

Trypsinase，papain，neutral protease and pepsin were added to hydrolyze bone powder of tilapia and compare the effect.The optimal hydrolysis conditions of bone powder were obtained by analyzing the soluble calcium content，degree of hydrolysis and recycle rate of nitrogen by L16(54)orthogonal array design.The results showed that pepsin hydrolysate showed the strongest effect，which optimal hydrolysis conditions were:pH2.0，solid－liquid ratio 1∶3，enzyme concentration(E/S)0.3%，time 5h and temperature 37℃.With the optimal conditions，the degree of hydrolysis and recycle rate of nitrogen reached 14.07%and 56.35%，respectively.The soluble calcium content was 23.68g/L.Trichloroacetic acid soluble nitrogen content reached 97.43%.The contents of Fe，Zn，Mg，P were 0.36，3.84，716.67mg/L，10.89g/L，respectively.

bone powder of tilapia;soluble calcium;pepsin;degree of hydrolysis

TS254.9

B

1002－0306(2011)12－0221－05

2011－08－24

楊賢慶(1963－)，男，研究員，研究方向:水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全。

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS－49);國(guó)家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2010GB2E000335);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009A020700004)。