張彩霞，閆鴻鵬，趙肅清，張 焜，周麗華

(廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東廣州510006)

雪卡毒素人工抗原合成及鑒定

張彩霞，閆鴻鵬，趙肅清*，張 焜，周麗華

(廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東廣州510006)

雪卡毒素是一種存在于珊瑚魚(yú)中的海洋毒素，極低劑量就會(huì)引起中毒。為了建立雪卡毒素的免疫分析方法，必須合成其人工抗原才能制備抗體。以雪卡毒素的結(jié)構(gòu)類似物莫能菌素為半抗原，采用琥珀酸酐法將其改造成莫能菌素－琥珀酰半酯(MON－HS)，再用混合酸酐法將其與大分子載體牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)，成功制備出了雪卡毒素人工抗原MON－HS－BSA和MON－HS－OVA。以MON－HS－BSA為免疫抗原免疫Balb/c小鼠，以MON－HS－OVA為包被抗原，用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法(Ci－ELISA)檢測(cè)到小鼠血清中產(chǎn)生了雪卡毒素的抗體，說(shuō)明已成功合成雪卡毒素人工抗原，該抗原可用于制備雪卡毒素單克隆抗體。

雪卡毒素，莫能菌素，人工抗原，Ci－ELISA

圖1 雪卡毒素結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

莫能菌素鈉鹽 廣州國(guó)奧生物;牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑 Sigma公司;HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、TMB武漢博士德公司;30%雙氧水、無(wú)水乙醇 天津百世;雪卡毒素 本實(shí)驗(yàn)室提取純化，另文發(fā)表;BalB/c小鼠 6～8周齡，體重18～22g，雌性，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

RT－2100C型酶標(biāo)儀 Rayto;KDC－40型低速離心機(jī) 科大創(chuàng)新中佳分公司;恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;LGJ－12型冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技公司;1mL、200μL、10μL移液槍 BioPette; pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;DYY－6C型電泳儀 北京六一儀器廠;TU－190 紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用公司。

圖2 莫能菌素結(jié)構(gòu)式

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雪卡毒素人工抗原合成

1.2.1.1 半抗原改造及純化 參考文獻(xiàn)［11－12］方法，將莫能菌素鈉鹽500mg溶于5mL無(wú)水吡啶中，60℃攪拌加熱，緩慢滴加721.5mg琥珀酸酐吡啶溶液，持續(xù)加熱攪拌反應(yīng)2d，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。待反應(yīng)完畢后滴加幾滴水終止反應(yīng)。反應(yīng)液真空干燥除去吡啶后溶于10mL二氯甲烷，用0.02mol/L HCl洗滌4次，然后用雙蒸水洗滌2次(2mL/次)，Na2SO4除去水分，過(guò)濾后真空干燥。產(chǎn)物溶于3mL二氯甲烷，過(guò)硅膠柱進(jìn)一步分離純化(二氯甲烷∶甲醇=9∶1梯度洗脫)，TLC監(jiān)測(cè)(展開(kāi)劑為二氯甲烷∶甲醇=9∶1)，莫能菌素Rf=0.54，莫能菌素－琥珀酰半酯Rf=0.41，收集Rf=0.41的點(diǎn)合并，真空干燥箱干燥即得半抗原改造產(chǎn)物。

1.2.1.2 雪卡毒素人工抗原合成及鑒定 混合液A:莫能菌素－琥珀酸酐(192.95mg，0.25mol)溶于2.5mL二氧六環(huán)中，冷卻到10℃，邊攪拌邊逐滴加入三丁胺60μL，氯甲酸異丁酯33μL，混合液于10℃持續(xù)攪拌30min。混合液B:BSA(340mg)或OVA(225mg)分別溶于22mL，0.1mol/L，pH9.5的碳酸鹽緩沖溶液中，然后緩慢加入22mL二氧六環(huán)，置于4℃。將A液逐滴加入到B液中，持續(xù)攪拌，反應(yīng)5h，混合物4℃透析，1～2d透析液為:0.02mol/L碳酸鹽緩沖溶液∶二氧六環(huán)=1∶1; 3～4d透析液:蒸餾水;透析后凍干，4℃保存。

1.2.1.3 SDS－PAGE鑒定偶聯(lián)結(jié)果 15%分離膠，5%濃縮膠，檢測(cè)人工免疫抗原與BSA，包被抗原與OVA在電泳圖中的位置差別，從而鑒定偶聯(lián)是否成功。

1.2.1.4 考馬斯亮藍(lán)法和香草醛法鑒定結(jié)合比 參考文獻(xiàn)方法［12－13］，分別以BSA和OVA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，繪制蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。以莫能菌素為標(biāo)準(zhǔn)藥物，繪制莫能菌素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出人工合成抗原的偶聯(lián)比。

1.2.2 多抗制備 6～8周齡，體重18～22g，雌性BalB/c小鼠4只，分別皮下及足墊注射100μg抗原與等體積弗氏完全佐劑的乳化物，2周后第二次腹腔及足墊注射100μg抗原與等體積弗氏不完全佐劑的乳化物，如此交替重復(fù)免疫，于第4次免疫10d后尾部采血，4℃靜置過(guò)夜，分離血清。

1.2.3 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法建立 用棋盤滴定法確定血清抗體最佳包被抗原濃度，最佳一抗，二抗?jié)舛?。雪卡毒素溶于甲醇，?0%甲醇溶液［14］稀釋到系列濃度1×103、1×102、1×101、1×100、1×10－1、1× 10－2、1×10－3、1×10－4ng/mL，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)出不同濃度藥物對(duì)血清抗體的抑制作用，繪制競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。抑制率(%)=(B－B0)/(BN－B0)× 100%，其中，B為檢測(cè)孔OD值，BN為陰性孔OD值，B0為空白孔OD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 半抗原改造

用琥珀酸酐法將莫能菌素末端羥基與琥珀酸酐偶聯(lián)，從而在莫能菌素中引入羧基作為與蛋白偶聯(lián)的活性位點(diǎn)，合成莫能菌素－琥珀酰半酯(MONHS)。通過(guò)硅膠柱層析作進(jìn)一步的純化處理將產(chǎn)物中的吡啶和剩余的琥珀酸酐除去得到較純的MONHS。用TLC監(jiān)測(cè)，如圖3所示，為純化后得到較純的半抗原改造產(chǎn)物。

圖3 莫能素－琥珀酰半酯純化前后薄層層析圖

2.2 SDS－PAGE鑒定偶聯(lián)是否成功

用SDS－PAGE得到BSA，BSA－MON，OVA，OVA－MON的電泳圖，從圖4中比較可以看出，第1泳道OVA的分子量小于第二泳道OVA－MON的分子量;第三泳道BSA的分子量小于第四泳道BSA－MON的分子量。由此推測(cè)，半抗原與OVA和BSA偶聯(lián)成功，并可根據(jù)分子量大小計(jì)算出偶聯(lián)率。

圖4 包被抗原和免疫抗原SDS－PAGE電泳圖

2.3 偶聯(lián)比的測(cè)定

由考馬斯亮藍(lán)法和香草醛法測(cè)定免疫原中蛋白質(zhì)和莫能菌素的含量，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出MON－BSA中BSA濃度為2.766mg/mL，相當(dāng)于4.12×10－5mmol/mL;莫能菌素濃度為0.534mg/mL，相當(dāng)于7.62×10－4mmol/mL; MON－OVA中OVA濃度為2.925mg/mL，相當(dāng)于6.50 ×10－5mmol/mL;莫能菌素濃度為0.38mg/mL，相當(dāng)于5.42×10－4mmol/mL，因此求出MON－BSA中BSA與MON的偶聯(lián)比約為1∶18.5。同理求得MON－OVA中，OVA與MON的偶聯(lián)比為1∶7。

2.4 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法建立

通過(guò)棋盤滴定，確定最佳包被抗原濃度為5μg/mL，一抗最佳工作濃度為1∶16000，二抗最佳濃度為1∶10000(如圖5所示)。根據(jù)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以雪卡毒素濃度的對(duì)數(shù)lgC為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制出競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線(見(jiàn)圖6)。從圖6中可以看出，在包被抗原濃度不變的情況下，隨著雪卡毒素濃度的增大，雪卡毒素與包被抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體的能力增大，抑制率增強(qiáng)，可以證明免疫小鼠血清中含有抗雪卡毒素抗體。

圖5 血清抗體棋盤滴定

圖6 雪卡毒素競(jìng)爭(zhēng)抑制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

3 結(jié)論

對(duì)雪卡毒素結(jié)構(gòu)類似物莫能菌素進(jìn)行修飾，用混合酸酐法與BSA偶聯(lián)純化后得到雪卡毒素人工抗原，經(jīng)SDS－PAGE法，免疫分析方法綜合鑒定，表明雪卡毒素人工抗原合成成功，可以用于制備雪卡毒素單克隆抗體。

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Synthesis and identification of artificial antigen of ciguatoxin

ZHANG Cai－xia，YAN Hong－peng，ZHAO Su－qing*，ZHANG Kun，ZHOU Li－h(huán)ua
(Department of Pharmacy Engineering，F(xiàn)aculty of Chemical Engineering and Light Industry，Guangdong University of Technology，Guangzhou 510006，China)

Ciguatoxin was a kind of marine toxin exists in coral fish.A trace residual might lead to ciguatera poisoning.In order to build an immunochromatography assay method，it was necessary to synthesize artificial antigen of ciguatoxin firstly.Monensin，an analogue of ciguatoxin，was reconstructed to succinyl monensin through the reaction between succinic anhydride and monensin，and then coupled to bovine serum albumin(BSA)and ovalbumin(OVA)by mixed acid anhydride method to synthesize the artificial antigen MON－HS－BSA and MONHS－OVA.The antibodies against ciguatoxin were raised in serum of MON－HS－BSA immunized BalB/c mice by indirect competitive ELISA.The above results showed that the artificial antigen of ciguatoxin was synthesized successfully and it could be used to develop monoclonal antibodies against ciguatoxin in the future.

ciguatoxin;monensin;artificial antigen;indirect competitive ELISA

Q939.91

A

1002－0306(2011)12－0203－03

雪卡毒素是最主要的一種引起人類中毒的珊瑚魚(yú)毒素，由小魚(yú)吃海藻，大魚(yú)吃小魚(yú)而富集。它是世界范圍內(nèi)最普遍的海洋毒素，約0.1ppb～100pg/mL的雪卡毒素便會(huì)引起中毒，全世界每年至少有50000人遭受雪卡毒素傷害［1－2］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)雪卡毒素的檢測(cè)方法進(jìn)行了大量研究，建立了小鼠生物法［3］、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)法［4］、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜［5－6］等。但是這些方法樣品前處理復(fù)雜，繁瑣費(fèi)時(shí)，所需儀器設(shè)備昂貴，不能現(xiàn)場(chǎng)操作。因此，建立一種簡(jiǎn)便易行的雪卡毒素的檢測(cè)方法具有重要意義。ELISA法具有靈敏快速，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)備受關(guān)注。雪卡毒素(結(jié)構(gòu)式如圖1所示)由13個(gè)醚環(huán)構(gòu)成，合成完整的雪卡毒素分子幾乎不可能，而提取純化產(chǎn)率非常低［7－8］。由于雪卡毒素純品的價(jià)格相當(dāng)昂貴，為1美元/ng，因此，國(guó)外報(bào)道了合成雪卡毒素的3～5個(gè)醚環(huán)用于雪卡毒素半抗原制備人工抗原和抗體［9］，而我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)莫能菌素(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2)具有與雪卡毒素相似的醚環(huán)結(jié)構(gòu)，對(duì)其改構(gòu)后作為半抗原合成雪卡毒素人工抗原應(yīng)當(dāng)為一種合理有效的方法，為此我們開(kāi)展這方面的研究探索。

2010－11－15 *通訊聯(lián)系人

張彩霞(1988－)，女，碩士研究生，研究方向:免疫化學(xué)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(20872020，20672023);廣東省自然科學(xué)基金(8251009001000005)。