何宏銀，熊向陽，*，楊水兵，劉成梅，吳 麗

(1.南昌大學醫(yī)學院，江西南昌330006; 2.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047)

葉酸-殼聚糖SIRNA納米復合物抗乙酰肝素酶的研究

何宏銀1，熊向陽1，*，楊水兵2，劉成梅2，吳 麗2

(1.南昌大學醫(yī)學院，江西南昌330006; 2.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047)

目的:探討葉酸－殼聚糖siRNA納米復合物輸送抗腫瘤細胞乙酰肝素酶的siRNA的效率和對乙酰肝素酶基因表達和腫瘤細胞侵襲力的影響。以期提高siRNA的輸送效率，實現安全有效的靶向性基因治療，并為研發(fā)抗腫瘤侵襲轉移藥物提供理論基礎。方法:制備FA－CS－siRNA納米復合物并測定其特征;分別以control組、FA－CS組、FA－CS－siRNA納米復合物組、CS－siRNA組和lipo2000－siRNA組轉染乳腺癌MCF－7細胞，RT－PCR和Western Blot檢測乙酰肝素酶表達情況;腫瘤侵襲實驗檢測MCF－7細胞侵襲轉移能力的變化。結果:紅外光譜確認葉酸已成功與殼聚糖偶聯;FA－CS－siRNA納米復合物形態(tài)為圓形，分布較均勻，平均粒徑為197.7nm;FA－CS－siRNA納米復合物組能有效地干擾MCF－7細胞中乙酰肝素酶的表達;腫瘤細胞侵襲實驗顯示lipo2000－siRNA組和FA－CS－siRNA納米復合物組能有效抑制MCF－7細胞的侵襲和轉移。結論:FA－CS－siRNA納米復合物能有效傳遞siRNA進入MCF－7細胞。

siRNA，葉酸，殼聚糖，納米復合物，乙酰肝素酶

乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是一種能夠裂解 細胞基底膜和細胞外基質中硫酸乙酰肝素側鏈的內切糖苷酶［1］，是可以破壞腫瘤轉移的屏障，從而促進腫瘤的侵襲與轉移。乙酰肝素酶幾乎在人類所有腫瘤中都有表達或高表達［2］，因此可作為抗腫瘤研究的藥物靶點。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA介導的，能高效、特異性地降解細胞內同源mRNA，從而阻斷目的基因表達的現象。由于RNAi具有高特異性的基因沉默功能，因此廣泛應用于抗腫瘤、病毒等疾病的研究。siRNA是RNAi的效應分子，由于siRNA在生物體內穩(wěn)定性差，易于被核酸酶降解［3］，大多數siRNA的研究都借助于傳遞載體，包括病毒載體和非病毒載體。但病毒載體由于其潛在的致突變性或致瘤性、免疫原性等缺點［4］，一定程度上限制了它們的應用。殼聚糖(Chitosan，CS)是從甲殼類生物的貝殼中提取出來的一種可生物降解的多糖，具有生物相容性、生物可降解性、幾乎無免疫原性和毒性等優(yōu)點，是一種較理想的基因傳遞載體［5］。葉酸(folic acid，FA)是一種小分子維生素，具有與葉酸受體具有高親和力、無免疫原性等特點［6］。葉酸受體高表達于各種人類腫瘤細胞表面［7］，而在正常組織細胞表面基本不表達，是一種理想的靶向配體。本實驗以偶聯了葉酸的殼聚糖為材料包裹有效siRNA片段，通過葉酸分子與腫瘤細胞表面葉酸受體結合，實現安全有效的靶向性基因治療，為研發(fā)siRNA藥物提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖(DD90.6%) 購自濟南海得貝海洋生物工程有限公司;葉酸、結晶紫 購自solarbio公司; 1－(3－二甲基氨丙基)－3－乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) 購于 Andybio公司;Lipofectamine 2000、TRIzol Reagent 購于Invitrogen公司;Matrigel Matrix 5ML DI、Cell Culture Inserts 購于 BD Biocoat; RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 購于Fermentas公司;兔抗人HPA抗體、鼠抗人actin抗體

購于santa cruz公司;MCF－7細胞 本實驗室保存;RT－PCR引物 由上海生物工程公司合成(hpa:上游5'－ACTATTTGAATGGACGCACTGC－3'，下游5'－CCAAAGAATACTTGCCTCATCAC－3'，長度267bp; β－actin:上游5'－CGGGAAATCGTGCGTGAC－3'，下游5'－TGGAAGGTGGACAGCGAGG－3'，長度443bp);乙酰肝素酶特異性的SiRNA片段(siRNA H638) 由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，sense: 5'－GCUCUGUAGAUGUGCUAUATT－3'， antisense: 5'－UAUAGCACAUCUACAGAGCTT－3';HRP標記的羊抗兔抗體、HRP標記的羊抗鼠抗體 購于北京中杉公司。

PTC－100/PTC－200型 PCR儀 美國 MJ Research公司;全自動凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司;Nicop380ZLS激光納米粒度測定儀 美國Santa barbara公司;透射電子顯微鏡H600 日立Hitachi公司;傅立葉紅外光譜儀NExuS670 美國ThermoNieolet公司;Labconco FreeZone 4.5 Liter真空冷凍干燥機 美國LABCONCO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葉酸－殼聚糖復合體的制備

1.2.1.1 葉酸－殼聚糖的制備 精確稱取200mg葉酸，溶解于無水DMSO，然后加入適量的EDC，室溫避光攪拌使葉酸得到充分的溶解(約lh)，即得到了紅棕色的葉酸活化酯的DMSO溶液。稱取60mg的殼聚糖，溶于乙酸－乙酸鈉緩沖液(pH4.7)中，磁力攪拌條件下緩慢加入葉酸活性酯的DMSO溶液，室溫下避光攪拌反應16h，然后逐滴滴加NaOH將其pH調至9.0。混合液先后在PBS(pH7.4)溶液和超純水中各透析3d。冷凍干燥后即得FA－CS，收集備用［8－9］。

1.2.1.2 葉酸標準曲線的制備 精確稱取10mg葉酸，用乙酸－乙酸鈉緩沖液(pH5.8)溶解并定容于100mL容量瓶中。然后分別準確吸取1、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mL葉酸溶液置于10mL的容量瓶中，再用乙酸－乙酸鈉緩沖液(pH5.8)定容至10mL刻度，濃度分別為10、15、20、25、30、40μg/mL。以乙酸－乙酸鈉緩沖液(pH5.8)為control調零，用紫外分光光度計在363nm處測定吸光度。以葉酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作標準曲線，得出標準曲線公式。

1.2.1.3 FA－CS偶聯比的計算 電子天平精確稱取2mg冷凍干燥后的FA－CS，用乙酸－乙酸鈉緩沖液(pH5.8)溶解并定容至10mL，然后用紫外分光光度計在波長363nm處測定其吸光度，結合葉酸標準曲線，計算出每毫克FA－CS中葉酸的含量，即偶聯比。1.2.1.4 紅外光譜驗證FA－CS結構 分別稱取2mg的FA、CS和FA－CS樣品于瑪瑙研缽中研磨成細粉末，加入適量干燥的溴化鉀(AR級)粉末并研磨混合均勻，然后將裝入模具內，把制備好的樣品放入樣品架，然后插入到儀器樣品室的固定位置上，在壓片機上壓制成片測試。根據被測化合物的紅外特性吸收譜帶的出現來確定－NH－CO－的存在，從而確定FA－CS的合成成功［10］。

1.2.2 載siRNA葉酸－殼聚糖納米復合物(FA－CS－siRNA)的制備

1.2.2.1 FA－CS－siRNA納米復合物的制備 稱取3mg CS溶于12mL 1%的乙酸－乙酸鈉緩沖溶液(pH5.5)中，將 CS溶液(pH5.5)置于 55℃水浴20min，精確吸取2mL的CS溶液，在磁力攪拌下逐滴加入到72μL siRNA(約19μg)溶液中，混和2min，即得CS－siRNA納米復合物混懸液［11］。同法制備的FA－CS－siRNA納米復合物混懸液。

1.2.2.2 FA－CS－siRNA納米復合物粒徑的測定和形態(tài)的觀察 吸取2mL FA－CS－siRNA納米復合物懸液，稀釋后，加入比色杯中，置于激光納米復合物度測定儀測定納米復合物的粒徑。取少量FA－CS－siRNA納米復合物懸液，用適量稀釋后，滴至鋪有碳膜的銅網上，靜置2min，用濾紙吸干混懸液，再滴加1%(W/V)磷鎢酸復染2min，于透射電子顯微鏡下觀察微粒形態(tài)并拍照。

1.2.2.3 包封率的測定 吸取2mL FA－CS－siRNA納米復合物懸液，在4℃低溫離心機16000×g離心30min。取上清液于紫外分光光度計在波長260nm處檢測其光密度值，以不含siRNA的FA－CS溶液為空白對照。已知OD260=1時，樣品中RNA濃度為40μg/mL，據此計算納米復合物中的siRNA含量。

包封率(%)=(siRNA的總質量－游離siRNA的質量)/加入siRNA的總質量×100%

1.2.3 轉染MCF－7細胞并檢測沉默效率

1.2.3.1 實驗分成5組，分別是:control組、FA－CS、 lipo－siRNA組、CS－siRNA納米復合物組和FA－CS－siRNA納米復合物組。以80nmol/L的siRNA濃度轉染MCF－7細胞，培養(yǎng)5.5h后，更換為完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。分別于48h和72h后，以RT－PCR和Western Blot檢測乙酰肝素酶的表達情況。

1.2.3.2 RT－PCR檢測乙酰肝素酶的mRNA表達收集轉染了48h的各組細胞，TRIzol法提取總RNA。然后以總RNA為模板合成第一鏈cDNA，并以此cDNA為模板進行PCR擴增。反應條件:94℃3min; 94℃30s，55℃30s，72℃30s，28次循環(huán);72℃10min。將PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠(含EB 0.5μg/mL)中電泳，并用凝膠分析軟件進行分析，以β－actin的表達量條帶灰度為對照，計算并比較各組目的基因的相對表達量。

1.2.3.3 Western Blot檢測乙酰肝素酶蛋白的表達收集轉染72h后的各組細胞，提取細胞總蛋白制備蛋白樣品。目的蛋白經聚丙烯電泳分離，然后將其轉移至PVDF膜上，孵育一抗和二抗后，以化學發(fā)光法顯色，并進行曝光，膠片經掃描或拍照后，用凝膠圖象分析軟件進行分析。以β－actin條帶為對照進行半定量分析。

1.2.4 腫瘤侵襲實驗 實驗分為3組，陰性對照組(NC)和FA－CS－SiRNA組和Lipo200－siRNA組。用無血清培養(yǎng)基將50mg/L的Matrigel以10∶1的比例稀釋。混勻后，向各培養(yǎng)小池加入100μL Matrigel稀釋液。然后置于37℃培養(yǎng)箱6h使其形成固態(tài)。接種前，向24板內加入600μL含15%血清的DMEM培養(yǎng)基，接著將培養(yǎng)小池安裝于24板內。然后把用siRNA H638轉染后繼續(xù)培養(yǎng)了24h的MCF－7細胞接種至培養(yǎng)小池內。接種后的細胞置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。24h后取出細胞，用棉簽擦去培養(yǎng)小池內的基質膠和細胞。然后用PBS輕輕潤洗兩遍，吸棄PBS，自然風干。加入0.1%結晶紫染色30min，PBS洗兩遍。顯微鏡下觀察，隨機選取6個視野進行拍照和計數。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 本實驗結果數據采用統(tǒng)計學軟件SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，實驗數據均以ˉX±S表示，多組間采用單因素ANOVA分析，多重比較采用q檢驗，以P＜0.05有統(tǒng)計學意義即有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 葉酸標準曲線的制備及FA－CS偶聯比的計算

由FA標準曲線方程得出在10～40μg/mL范圍內，FA濃度與FA吸光度(A)呈線性相關關系，R2= 0.9996，回歸方程為A=0.0072C+0.0036。通過FACS樣本溶液中FA紫外吸光度值平均值為0.15，并結合葉酸標準曲線方程，計算出每毫克FA－CS中葉酸的含量，即偶聯比為10.2%。

2.2 FA、CS和FA－CS紅外吸收光譜

葉酸與殼聚糖是否成功偶聯，可從其紅外光譜圖做出判斷。FA與CS的偶聯，是FA的羧基與CS的氨基之間形成了酰胺鍵。從圖1可知，FA－CS在紅外光譜圖中的1564.6cm－1和1658.6cm－1處有中強吸收峰，其所對應的正是酰胺鍵即－CO－NH－的吸收峰1563cm－1和1658cm－1［12］。因此表明 FA與CS已成功偶聯。

圖1 CS、FA和FA－CS的紅外吸收圖譜

2.3 FA－CS－siRNA納米復合物形態(tài)及粒徑的測定

由圖2可見，FA－CS－siRNA納米復合物形態(tài)為圓形，粒度及其分布比較均勻，測得其平均粒徑為197.7nm。

圖2 FA－CS－siRNA納米粒粒徑和形態(tài)

2.4 FA－CS－siRNA納米復合物包封率的測定

紫外分光光度計在波長260nm處檢測siRNA光密度值平均值為0.565。根據OD260=1時，樣品中RNA濃度為 40μg/mL，計算得納米復合物中的siRNA含量為2.26μg/mL。已知siRNA總的質量為19μg。通過公式計算得其包封率約為76.2%。

2.5 RT－PCR及Western Blot檢測乙酰肝素酶表達水平的變化

RT－PCR及 Western Blot的結果均顯示，以β－actin做為內參，FA－CS－siRNA納米復合物組、CS－siRNA納米復合物組和lipo2000－siRNA組都不同程度地下調了乙酰肝素酶的表達。lipo2000－siRNA組和FA－CS－siRNA納米復合物組對其抑制程度較明顯。通過統(tǒng)計分析，FA－CS組與control組相比無顯著性差異，而FA－CS－siRNA納米復合物組、CS－siRNA納米復合物組和lipo2000－siRNA組與control組相比均有顯著性差異(P＜0.05)(見圖3)。

圖3 不同實驗組對乙酰肝素酶mRNA及蛋白表達的影響情況

2.6 腫瘤細胞侵襲力的檢測

實驗結果顯示，與對照組(208±7.00)相比，FACS－SiRNA納米復合物組(128±3.61)和Lipo200－siRNA組(116±6.56)顯著性地抑制MCF－7細胞的侵襲轉移，其抑制率分別為38.5%和44.2%(見圖4)。

圖4 乙酰肝素酶特異性siRNA對MCF－7細胞侵襲轉移能力的影響

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，據資料統(tǒng)計，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7%～10%。惡性腫瘤最顯著的生物學特性就在于其具有很強的侵襲和轉移能力，這也是約90%以上的腫瘤患者死亡的原因。抑制乙酰肝素酶的表達能夠抑制腫瘤細胞的侵襲轉移。近年來，人們采用脂類、多聚體等材料傳遞特異性的抗腫瘤siRNA，在腫瘤細胞和異種移植瘤中進行了研究［13］。RNAi在體內應用的主要困難就是如何將siRNA有效地輸送至靶細胞。siRNA自身有兩個特性:一是siRNA是一種不穩(wěn)定的小RNA分子，它能迅速地被細胞內外的核酸酶降解;二是核酸包括siRNA是膜不通透性的，難于通過細胞膜，不大可能較好地被細胞攝取而保持其生物活性［14］。

殼聚糖是一種陽離子多糖，由于它本身固有的生物相容性和生物可降解性等特點，因而可應用于藥物和基因傳遞研究中。殼聚糖分子結構中有帶正電的氨基，因此通過靜電作用可與siRNA等帶負電的核酸形成穩(wěn)定的復合物［15］。CS－siRNA納米復合物的大小、Zeta電位、形態(tài)和穩(wěn)定性等理化性質和其介導的基因沉默效率與CS的分子量和脫乙酰度及CS/siRNA的N/P比等因素有關。殼聚糖分子結構中存在著大量的功能基團使其適合于各種化學修飾［16］。使用靶向配體修飾殼聚糖，不但能保持其原有理化性質和生物學性質，同時因引入了靶向配體，提高了其靶向性［17］。本研究采用葉酸作為靶向配體對CS進行修飾，葉酸與殼聚糖通過化學反應在FA的羧基與CS的氨基之間形成了酰胺鍵，從而使它們偶聯在一起。

RT－PCR及 Western Blot結果顯示，FA－CS－siRNA納米復合物組有效地下調了乙酰肝素酶的表達，效率接近于lipo2000－siRNA組。lipo2000作為一種陽離子脂質體，由于技術的成熟和用于轉染方面的高效性，已經被商業(yè)化生產推廣了，它的有效性和高效性是毋庸置疑的。同時，腫瘤細胞侵襲實驗也表明，FA－CS－siRNA納米復合物組對腫瘤細胞的侵襲能力產生了影響，使腫瘤細胞的侵襲能力下降。以殼聚糖作為納米材料傳遞siRNA，在納米復合物制備和轉染過程中均會受到各種因素的影響，從而也會最終影響實驗研究和應用的效果;如何進一步提高其傳遞效率，可能會成為今后的主要研究方向。

3 結論

通過制備葉酸活性酯與殼聚糖上的氨基反應，獲得葉酸偶聯殼聚糖，采用紅外光譜法鑒定驗證了葉酸與殼聚糖已經偶聯，成功地制備了FA－CS－siRNA納米復合物，通過激光納米復合物粒度儀測得其平均粒徑為197.7nm，透射電鏡顯示形態(tài)為圓形，分布較均勻。FA－CS－siRNA納米復合物能夠有效地傳遞siRNA進入MCF－7細胞，并能有效地干擾MCF－7細胞中乙酰肝素酶表達，其干擾效率高于CS－siRNA組，接近于lipo2000－siRNA組。

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Study on the resistance of folate－chitosan－siRNA nanocomposites on heparanase

HE Hong－yin1，XIONG Xiang－yang1，*，YANG Shui－bing2，LIU Cheng－mei2，WU Li2
(1.Medical School，Nanchang University，Nanchang 330006，China; 2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China)

Objective:To investigate the delivery efficiency of heparanase－specific siRNA which were loaded by folate－chitosan－siRNA nanocomposites and the effect of heparanase－specific siRNA on heparanase gene expression and tumor cell invasion and metastasis in vitro，so as to improve the efficiency of siRNA delivery and to achieve safe and effective targeting gene therapy and to provide a theoretical basis for the exploiting of the antitumor drug.Methods:Prepare the folate－chitosan－siRNA nanocomposites and determine its characteristics.The transfection assay was divided into 5 groups:control group，FA－CS group，FA－CS－siRNA nanocomposites group，CS－siRNA nanocomposites group and Lipo2000－siRNA group.Then the heparanase expression was detected by RT－PCR and Western Blot，tumor invasion assay suggested the change of MCF－7 cell invasion and metastasis. Results:The FA－CS was verified by the infrared spectroscopy.The FA－CS－siRNA nanoparticle was round－form，distribute evenly，and the particle size was 197.7nm.FA－CS－siRNA nanocomposite group could interfere with heparanase expression effectively in MCF－7 cells，tumor cell invasion assay showed that lipo2000－siRNA group and the FA－CS－siRNA nanocomposites group could inhibit the MCF－7 cell invasion and metastasis.Conclusion: FA－CS－siRNA nanocomposite could effectively transfer siRNA into MCF－7 cells.

siRNA;folic acid;chitosan;nanocomposites;heparanase

TS201.2

A

1002－0306(2011)12－0196－05

2011－08－25 *通訊聯系人

何宏銀(1985－)，男，在讀碩士研究生，研究方向:腫瘤的防治。

江西省科技支撐計劃重點項目(2007BS12503);江西省自然科學基金(0640053)。