郝 剛，樂(lè)國(guó)偉，施用暉，唐俊妮

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041; 2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122)

抗菌肽BUFORINⅡ衍生物的生物活性研究

郝 剛1，樂(lè)國(guó)偉2，施用暉2，唐俊妮1

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041; 2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122)

研究了抗菌肽BF2－A/B的抗菌活性及其他的生物活性。兩個(gè)肽均具有很強(qiáng)的廣譜抗菌活性，BF2－B對(duì)細(xì)菌的抑菌活性比BF2－A強(qiáng)，它們沒(méi)有體外溶血活性。BF2－A幾乎沒(méi)有細(xì)胞毒性，而B(niǎo)F2－B在100μg/mL時(shí)，能抑制大約20%的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。兩個(gè)肽均能結(jié)合脂多糖，中和內(nèi)毒素，BF2－B與脂多糖的親和結(jié)合力比BF2－A強(qiáng)。BF2－A/B經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，抗菌活力都略有下降，而經(jīng)蛋白酶K處理一段時(shí)間后，就完全喪失了抗菌活性。

抗菌肽，BuforinⅡ，衍生物，生物活性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胃蛋白酶 上海生物工程有限公司;胎牛血清、RPMI1640 華美生物工程有限公司;胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)Sigma公司;蛋白酶K Merck產(chǎn)品;顯色基質(zhì)鱟試劑盒 廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司。

HYG－A型恒溫調(diào)速搖床柜 江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;Multiskan MK3酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 美國(guó)Thermo公司;UV－2102 PCS紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)優(yōu)尼科有限公司;CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 衍生肽BF2－A/B抗菌活性的測(cè)定 按最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)測(cè)定法［6］檢測(cè)衍生肽BF2－A/B對(duì)大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等G+、G－菌及白色念珠菌、釀酒酵母等真菌的抗菌活性。

表1 抗菌肽BF2－A/B的最低抑菌濃度MIC(μg/mL)

1.2.2 抗菌肽對(duì)細(xì)菌的抑菌曲線 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌菌液加入到試管中，再加入抗菌肽溶液，使其終濃度分別為5μg/mL和10μg/mL，對(duì)照組加等量無(wú)菌水。37℃水浴搖床培養(yǎng)，每隔30min用分光光度計(jì)測(cè)630nm處的OD值。金黃色葡萄球菌也做同樣處理。

1.2.3 抗菌肽體外溶血實(shí)驗(yàn) 收集新鮮小鼠全血，肝素抗凝，4℃3000r/min離心10min取沉淀，生理鹽水洗滌并按8%(v/v)重懸。100μL的紅細(xì)胞懸液與100μL不同濃度的抗菌肽溶液混勻?；旌象w系放置于37℃恒溫箱中，孵育1h，取出并在4℃ 3000r/min離心10min，取上清液，使用酶標(biāo)儀測(cè)570nm處吸光值。以具有溶血活性的抗菌肽Melittin(蜂毒素)作為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)照組:1:0.1%TritionX－100 100μL; 2:15μL水加生理鹽水補(bǔ)齊至100μL。溶血百分比值按下式計(jì)算:溶血(%)=(抗菌肽組吸光值－對(duì)照組2吸光值)/(對(duì)照組1吸光值－對(duì)照組2吸光值)×100%。

1.2.4 抗菌肽抑制腫瘤細(xì)胞Hep－G2體外增殖的活性(MTT比色法) 將人肝癌細(xì)胞Hep－G2接種于含有10%滅活的胎牛血清，青霉素100U/mL和鏈霉素100U/mL的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃，5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，0.25%胰酶消化，用1640完全制備細(xì)胞懸液5×104CFU/mL。取100μL細(xì)胞懸液于96孔板中，培養(yǎng)24h。加入100μL經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾除菌的不同濃度的抗菌肽，對(duì)照組加100μL培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)24h。棄去舊液，加入100μL新培養(yǎng)液，同時(shí)每孔加入20μL，5g/L MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。4℃、1500r/min離心5min，棄去上清液，加入100μL二甲基亞砜，37℃放置10min，待晶體溶解完全后，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)OD值。以抗菌肽Magainin 2作為陽(yáng)性對(duì)照。細(xì)胞存活率(%)=抗菌肽組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.5 衍生肽結(jié)合脂多糖(LPS)中和內(nèi)毒素的活性方法按顯色基質(zhì)鱟試劑盒說(shuō)明書(shū)，略作修改，簡(jiǎn)述如下:在置于冰浴中的各試管中加入0.1mL的鱟試劑溶液，依次加入10μL 1EU/mL的內(nèi)毒素母液及10μL不同濃度的抗菌肽BF2－A/B，補(bǔ)加80μL內(nèi)毒素檢測(cè)用水，混勻并在37℃孵育45min。各管加入顯色基質(zhì)溶液0.1mL，混勻，再置于37℃孵育6min。取出置于冰浴中，各管均加入0.5mL反應(yīng)終止液(鹽酸+偶氮化試劑1)，使反應(yīng)終止并開(kāi)始染色。依次加入偶氮化溶液2、3號(hào)各0.5mL于試管中，混勻，然后靜置5min，用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)545nm處測(cè)吸光度。陽(yáng)性對(duì)照組:加入10μL 1EU/mL的內(nèi)毒素母液，再補(bǔ)加90μL檢測(cè)用水。內(nèi)毒素中和率(%)=(陽(yáng)性組吸光值－抗菌肽組吸光值)/陽(yáng)性組吸光值×100%。

1.2.6 衍生肽抵抗不同蛋白酶水解的能力 用濃度為1mg/mL的胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K于37℃下分別處理抗菌肽不同時(shí)間后，取100μL置于96孔培養(yǎng)板中，然后加入100μL的待測(cè)菌液，抗菌肽濃度為5倍MIC。對(duì)照組為未加酶處理抗菌肽100μL，37℃培養(yǎng)3h。利用Hultmark改進(jìn)法［7］測(cè)抗菌肽對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽BF2-A/B的抗菌活性檢測(cè)

衍生肽BF2－A/B的抗菌活性用最低抑菌濃度來(lái)表示，結(jié)果如表1所示。總體上來(lái)看，經(jīng)過(guò)重新設(shè)計(jì)過(guò)的抗菌肽BF2－B無(wú)論對(duì)G+菌還是G－菌的抗菌活性要比其母肽BF2－A更強(qiáng)。而且，這兩個(gè)衍生肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌活性普遍要比革蘭氏陰性菌強(qiáng)，BF2－B尤其明顯。但對(duì)真菌的抑菌活性，總體上BF2－B又不如BF2－A強(qiáng)，這可能與它們對(duì)抑制細(xì)菌和真菌活性的機(jī)理不同有關(guān)。

2.2 抗菌肽對(duì)細(xì)菌的抑菌曲線

我們選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為G－、G+菌的代表，考察抗菌肽BF2－A/B對(duì)細(xì)菌的抑制曲線，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)抗菌肽加入到菌懸液后，都能抑殺大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，但其抑菌活性卻不一樣。無(wú)論是高濃度(10μg/mL)還是低濃度(5μg/mL)，BF2－A所導(dǎo)致的細(xì)菌死亡均是一個(gè)非常緩慢的過(guò)程，而B(niǎo)F2－B的抑菌過(guò)程迅速劇烈，BF2－B明顯強(qiáng)于BF2－A，并且5μg/mL BF2－B的抑菌活性比10μg/mL的BF2－A還強(qiáng)。雖然濃度從5μg/mL增加至10μg/mL，但BF2－A的抑菌活性并沒(méi)有明顯的增強(qiáng)，而濃度的提高對(duì)BF2－B的抗菌活性的增強(qiáng)則有非常顯著的影響。這些現(xiàn)象說(shuō)明，抗菌肽BF2－B對(duì)細(xì)菌的殺傷活性可能與它的劑量有關(guān)，而B(niǎo)F2－A則不是一個(gè)明顯的濃度依賴性的抗菌肽。同時(shí)說(shuō)明，BF2－A/B兩者在抑殺細(xì)菌的機(jī)理上，可能會(huì)有所不同。對(duì)比大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌曲線，兩個(gè)肽對(duì)這兩種代表菌的抑菌特性沒(méi)有顯示出明顯的不同，說(shuō)明BF2－A/B對(duì)G+、G－菌的抑菌機(jī)理可能是一樣的。

圖1 抗菌肽BF2－A/B對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌曲線

2.3 抗菌肽體外溶血活性

隨后我們考察了抗菌肽BF2－A/B在不同濃度下，對(duì)小鼠紅血球的溶血率，見(jiàn)表2。即使在10倍MIC濃度下，BF2－A/B都沒(méi)有溶血活性，只有在80μg/mL的濃度下，BF2－B才顯示出輕微的溶血率。蜂毒素Melittin是一個(gè)分離自蜜蜂毒液的陽(yáng)離子抗菌肽，它是以破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的方式來(lái)抑菌的，具有溶血活性。從表2中可以看出在高于20μg/mL時(shí)，其就能導(dǎo)致完全的溶血。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明，BF2－A/B對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞幾乎沒(méi)有細(xì)胞毒性，很適合開(kāi)發(fā)成抗菌藥物。

表2 抗菌肽BF2－A/B體外溶血活性

2.4 抗菌肽抑腫瘤細(xì)胞活性

衍生肽BF2－A/B處理后的腫瘤細(xì)胞存活率用標(biāo)準(zhǔn)的MTT方法來(lái)檢測(cè)?？咕腗againin 2是一個(gè)具有抑腫瘤活性但沒(méi)有溶血活性的肽，如圖2所示，當(dāng)Magainin 2濃度高于20μg/mL后，細(xì)胞存活率急劇下降。在低于100μg/mL濃度時(shí)，BF2－A幾乎沒(méi)有抑腫瘤活性，BF2－B也只是在高于50μg/mL后，才顯示出了輕微的抑腫瘤活性，在100μg/mL時(shí)，可達(dá)到大約20%的抑制率。

2.5 衍生肽中和內(nèi)毒素的活性

革蘭氏陰性菌的細(xì)胞外膜的外單層上分布著大分子的醣脂類物質(zhì)——脂多糖。在殺傷細(xì)菌的過(guò)程中，抗菌肽必須要和這層外膜相互作用。陰離子的脂多糖是細(xì)胞外膜的外側(cè)唯一的脂質(zhì)種類，陽(yáng)離子抗菌肽與細(xì)菌最初的相互作用是經(jīng)過(guò)脂多糖來(lái)結(jié)合的。脂多糖是內(nèi)毒素的首要成分，因此與脂多糖的結(jié)合可以用內(nèi)毒素的中和作用來(lái)檢測(cè)。肽對(duì)內(nèi)毒素不同的中和能力代表了與脂多糖相對(duì)結(jié)合親和力。如表3所示，兩個(gè)肽都顯示出了對(duì)脂多糖相對(duì)不同的親和性。在相同濃度下，BF2－B內(nèi)毒素中和率比BF2－A高，則它和脂多糖的親和結(jié)合能力就比較強(qiáng)，這也許是由于它攜帶了比BF2－A更多的正電荷。隨著濃度不斷地提高，兩個(gè)肽與脂多糖的結(jié)合親和力也越強(qiáng)?？咕膶?duì)內(nèi)毒素的中和能力被認(rèn)為貢獻(xiàn)了部分的抗菌活性，因此，這解釋了擁有與脂多糖較高親和能力的BF2－B的抗菌活性之所以比BF2－A強(qiáng)的原因;同時(shí)這樣的結(jié)果也說(shuō)明靜電相互作用在殺菌過(guò)程中是相當(dāng)重要的。

圖2 抗菌肽BF2－A/B的抑腫瘤活性

表3 抗菌肽BF2－A/B與脂多糖的結(jié)合親和性

2.6 衍生肽抵抗不同蛋白酶水解的能力

2.6.1 對(duì)胰蛋白酶穩(wěn)定性 胰蛋白酶是專一性強(qiáng)的常用蛋白酶，其水解位點(diǎn)是Lys或Arg的羧基端肽鍵，抗菌肽BF2－A/B經(jīng)該酶處理20min后，抗菌活性立即下降，此后抗菌活性基本不變。造成這種現(xiàn)象的原因可能由于:兩個(gè)肽的分子中盡管含有Lys或Arg，可能在與細(xì)菌作用時(shí)，其空間構(gòu)象發(fā)生改變，有些肽的堿性氨基酸與細(xì)胞外壁結(jié)合，胰蛋白酶不易于作用其上，因此還體現(xiàn)出一定的活性;或者雖然被胰蛋白酶水解去除一兩個(gè)氨基酸，但剩下的片段仍然具有不完全的抗菌活性。

圖3 胰蛋白酶對(duì)抗菌肽抗菌活性影響

2.6.2 對(duì)胃蛋白酶穩(wěn)定性 胃蛋白酶的專一性不如胰蛋白酶，它斷裂Phe、Trp、Tyr等疏水氨基酸的羧基端肽鍵，兩個(gè)肽都含有Phe，隨著胃蛋白酶作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抗菌活性持續(xù)下降，但抗菌活性并沒(méi)有完全喪失，下降幅度不大，表明抗菌肽對(duì)胃蛋白酶具有一定的抵抗力。

2.6.3 對(duì)蛋白酶K的穩(wěn)定性 蛋白酶K屬于非專一性的水解酶，可水解任何蛋白質(zhì)的肽鍵，兩個(gè)抗菌肽隨著酶作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抗菌活性顯著下降，60min后，兩個(gè)肽已經(jīng)基本失去抗菌活性，說(shuō)明抗菌肽對(duì)蛋白酶K的作用不穩(wěn)定。

圖4 胃蛋白酶對(duì)抗菌肽抗菌活性影響

圖5 蛋白酶K對(duì)抗菌肽抗菌活性影響

3 結(jié)論

衍生肽BF2－A/B都有很強(qiáng)的廣譜抗菌活性，BF2－B對(duì)細(xì)菌的抑菌活性普遍強(qiáng)于BF2－A。BF2－B殺菌過(guò)程迅速劇烈，BF2－A則非常緩慢。濃度的提高對(duì)BF2－A的活性沒(méi)有明顯的影響，而B(niǎo)F2－B是個(gè)濃度依賴性的肽。兩個(gè)肽均沒(méi)有體外溶血活性，而且BF2－A幾乎沒(méi)有抑腫瘤活性，但BF2－B在 100μg/mL時(shí)，能抑制大約20%的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。BF2－A/B都能與脂多糖親和結(jié)合從而中和內(nèi)毒素，BF2－B親和結(jié)合脂多糖的能力強(qiáng)于BF2－A。BF2－A/B經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，抗菌活力都略有下降，而經(jīng)蛋白酶K處理一段時(shí)間后，就完全喪失了抗菌活性。

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Study on biological activity on the analogs of the antimicrobial peptide BuforinⅡ

HAO Gang1，LE Guo－wei2，SHI Yong－h(huán)ui2，TANG Jun－ni1
(1.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China; 2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The biological activities of antimicrobial peptides BF2－A/B had been studied.Both peptides showed powerful antimicrobial activities against a broad spectrum of microorganisms.The activity against bacteria of BF2－B was stronger than that of BF2－A.They didn’t display hemolytic activity.BF2－A was practically non－toxic，moreover，BF2－B exhibited about 20%of cytotoxicity at 100μg/mL.Both peptides could bind to lipopoysaccharide with relatively different affinities.BF2－B exhibited a higher binding affinity for LPS than BF2－A.After the treatment by pepsin and trypsin，the antimicrobial activities of BF2－A/B only decreased slightly.However，after the treatment by proteinase K for a while，BF2－A/B completely lost their activities.

antimicrobial peptide;BuforinⅡ;analog;biological activity

TS201.2+1

A

1002－0306(2011)12－0132－04

隨著上世紀(jì)七十年代瑞典科學(xué)家Boman等［1］在天蠶血淋巴中首次發(fā)現(xiàn)抗菌多肽，人們相繼在兩棲動(dòng)物、昆蟲(chóng)、魚(yú)類、哺乳動(dòng)物等各種生物中都發(fā)現(xiàn)了大量的抗菌肽?？咕牟粌H對(duì)細(xì)菌和真菌有廣譜抗性，而且還能有效抑殺病毒、寄生蟲(chóng)，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，因此在醫(yī)藥、食品工業(yè)、畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［2］?？咕腂uforinⅡ是韓國(guó)學(xué)者Park等人［3］從亞洲蟾蜍的胃組織中分離純化的有21個(gè)殘基的抗菌肽。Park等人在研究BuforinⅡ的構(gòu)效關(guān)系時(shí)，在其N－端截去了4個(gè)冗余殘基后產(chǎn)生了一個(gè)衍生肽，它的抑菌活性比BuforinⅡ還要強(qiáng)［4］。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中，我們將此衍生肽命名為BF2－A (RAGLQFPVGRVHRLLRK)，并在其結(jié)構(gòu)特征基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)并化學(xué)合成了一個(gè)新的衍生肽，命名為BF2－B (RAGLQFPLGRLLRRLLRRLLR)［5］。本文研究了這兩個(gè)衍生肽的抗菌活性和抑菌曲線，體外溶血活性，體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，結(jié)合脂多糖的活性，以及抵抗各種蛋白酶水解的能力。

2010－09－10

郝剛(1978－)男，博士，主要從事抗菌肽設(shè)計(jì)與抑菌機(jī)理的研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31071515);西南民族大學(xué)人才引進(jìn)項(xiàng)目(2010RC04)。