王保忠

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，腎小球系膜細(xì)胞(MsC)功能的研究對闡明DN發(fā)病機(jī)制具有重要意義。近年研究表明轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)在DN發(fā)病機(jī)制中起重要作用。肝細(xì)胞生長因子(HGF)能有效抑制與慢性腎臟疾病及慢性腎功能衰竭密切相關(guān)的腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展過程。本研究以大鼠腎小球系膜細(xì)胞(RMC)為靶細(xì)胞，用高糖誘導(dǎo)造成體外培養(yǎng)的RMC功能紊亂，觀察RMC的增殖情況、TGF-β1的分泌變化以及 HGF干預(yù)作用，以闡明HGF對糖尿患者腎臟可能具有的保護(hù)作用，為DN的防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 大鼠腎小球系膜細(xì)胞(RMC)的培養(yǎng)與處理 RMC常規(guī)復(fù)蘇后移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)2～3 d，用2.5 g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代。RMC由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。

1.2 MTT法測細(xì)胞增殖 將RMC接種于96孔板，按以下分組給藥:①正常對照組(用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，葡萄糖終濃度5.5 mmol/L)，②高糖組(DMEM培養(yǎng)液中加入D-葡萄糖，葡萄糖終濃度25.0 mmol/L)，③高糖+HGF組(25.0 mmol/L葡萄糖，50 ng/ml HGF)，加入相應(yīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)不同時間(12，24，48，96 h)，每組設(shè)6個復(fù)孔。反應(yīng)結(jié)束后每孔加入25 μlMTT(5 mg/ml)溶液，繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入100 μl二甲基亞楓(DMSO)，振蕩30 min后于酶標(biāo)儀490 nm處測光吸收(OD)值。OD值越大，表明細(xì)胞增殖越旺盛。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)測細(xì)胞上清液中TGF-β1水平 (1)TGF-β1分泌檢測分組:將RMC接種于96孔培養(yǎng)板中，分為3組:①正常對照組(葡萄糖濃度5.5mmol/L);②高糖組(葡萄糖濃度25.0mmol/L)，甘露醇對照組 (20.0mmol/L甘露醇，使其滲透壓與高糖組相同)。分別于培養(yǎng)的12、24、48、96 h收集細(xì)胞，用雙抗體夾心法(ABC-ELISA)檢測TGF-β1分泌量。每組均設(shè)6個復(fù)孔。另外將RMC分為:①正常對照組(葡萄糖濃度5.5mmol/L)，②高糖組(葡萄糖濃度25.0mmol/L)③高糖+HGF組(葡萄糖濃度25.0mmol/L，HGF濃度分別為25、50、100、200ng/ml)。分別培養(yǎng)48 h后，用雙抗體夾心法(ABC-ELISA)測定此時TGF-β1分泌情況。每組實驗設(shè)6個復(fù)孔。(2)按照TGF-β1/ELISA試劑盒(由上海生物工程公司提供)說明書進(jìn)行操作，最終于酶標(biāo)儀450nm處測(OD)值。大鼠TGF-β1的濃度與OD值成正比。根據(jù)TGF-β1標(biāo)準(zhǔn)品A值曲線y=ymax×x^n/(k^n+x^n)，換算所測上清液中TGF-β1的含量。

2 結(jié)果

2.1 高糖和HGF對大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響 12 h時間點(diǎn)各組間細(xì)胞增殖均無顯著性差異。24 h時間點(diǎn)，高糖組較正常對照組相比促進(jìn)細(xì)胞增殖(P＜0.05)，高糖+HGF組較高糖組相比，可以抑制細(xì)胞增殖(P＜0.05)。48，72和96 h時間點(diǎn)，高糖組較正常對照組相比細(xì)胞增殖受抑(P＜0.05)。高糖+HGF組較高糖組相比促進(jìn)細(xì)胞增殖(P＜0.05)。而且呈時間依賴性，(見表1)。

2.2 高糖對大鼠腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1分泌的結(jié)果 高糖組TGF-β1分泌量從24 h開始升高，持續(xù)至96 h達(dá)到高峰。甘露醇組同樣出現(xiàn)TGF-β1分泌，作用24 h后同對照組相比存在差異(P＜0.05)。但同高糖組相比，甘露醇組的表達(dá)量又遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于高糖組(P＜0.05)。在96 h，甘露醇組與對照組相比沒有差異(P＞0.05)。說明甘露醇組并沒有促進(jìn)TGF-β1分泌，(見表2)。

2.3 高糖和HGF對大鼠腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1分泌的結(jié)果 高糖組中TGF-β1分泌量較高，HGF組與高糖組相比，TGF-β1分泌量明顯下降，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，且呈劑量依賴性，(見表3)。

表1 高糖與HGF作用下腎小球系膜細(xì)胞的增殖(OD值)(n=6)

表2 高糖作用下腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1的分泌量(n=6 ng/ml)

表3 高糖TG與F-βHGF作用下腎小球系膜細(xì)胞1的分泌量(n=6)

3 討論

DN是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥之一，其主要的病理變化為腎小球肥大，ECM產(chǎn)生增多。MsC是腎小球內(nèi)產(chǎn)生ECM的主要固有細(xì)胞，在DN發(fā)病過程中不僅是被動受害者，而且也是直接參與者，通過其自身代謝和功能改變直接影響DN進(jìn)程。細(xì)胞因子在DN的發(fā)病中起著重要的作用。TGF-β1是唯一對ECM形成具有廣泛調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子。HGF主要由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。腎臟是HGF表達(dá)最高的臟器。HGF能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種功能如細(xì)胞的生存，增殖，遷移以及分化。

有研究證實，采用抗TGF-β1抗體抑制TGF-β1的合成可以緩解腎臟纖維化的程度［1］。進(jìn)一步說明TGF-β1在腎臟纖維化中的重要性。本實驗也同樣證實，高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞分泌TGF-β1，于高糖作24 h開始合成增加，并且隨著高糖持續(xù)作用，TGF-β1呈現(xiàn)持續(xù)性高表達(dá)。同時我們對滲透壓因素進(jìn)行測定，結(jié)果證實，高糖誘導(dǎo)細(xì)胞的改變可能部分是由于滲透壓因素所致，然而高糖誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)TGF-β1，并不完全依賴滲透壓介導(dǎo)。說明高糖本身就可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生損傷。因此，本研究在體外培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞，將高糖作為一個重要因素進(jìn)行誘導(dǎo)刺激，部分模擬了體內(nèi)糖尿病環(huán)境。

近年來研究表明，減少ECM的積聚，拮抗細(xì)胞因子的不良作用，抑制MsC的增殖活化已成為防治腎小球硬化、延緩腎小球疾病進(jìn)展中的重要環(huán)節(jié)［2］。在正常組織中，TGF-β1和HGF處于一種互逆平衡狀態(tài)。在病理狀態(tài)下，若HGF占優(yōu)勢則利于損傷修復(fù);若TGF-β1占優(yōu)勢則組織出現(xiàn)纖維化改變［3］。Cruzado等［4］發(fā)現(xiàn)HGF基因治療降低了進(jìn)展期 DN的蛋白尿，緩解了系膜增多和腎小球硬化。與其能遏止系膜區(qū) TGF-β1和結(jié)締組織因(connective tissue growth factor，CTGF)的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。我們研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)早期，細(xì)胞并沒有發(fā)生TGF-β1高表達(dá)。高糖作用晚期，TGF-β1表達(dá)開始增加。加入HGF可以降低TGF-β1的分泌。局部HGF水平降低以及TGF-β1表達(dá)升高，可能共同參與了腎臟纖維化過程［5，6］。本研究證實 HGF可以直接抑制 TGF-β1的分泌，并且存在劑量依賴性抑制作用，隨著HGF劑量的增加，其抑制TGF-β1表達(dá)的作用也更顯著。另外，有其他相關(guān)研究證實，HGF還可以通過抑制纖溶酶原激活劑抑制劑-1(PAI-1)表達(dá)［7］使ECM合成減少，來預(yù)防ECM沉積。從上述結(jié)果可以看出HGF和TGF-β1生物活性是相反的。

綜上所述，高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1出現(xiàn)穩(wěn)定高表達(dá)，而給予外源性的HGF后，系膜細(xì)胞TGF-β1的分泌減少，而且呈時間依賴性。我們將在以后的研究中進(jìn)一步闡明HGF在介導(dǎo)DN發(fā)病中的具體機(jī)制，為DN防治提供新途徑。

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