祝儒剛

(遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧省食品生物加工工程技術(shù)研究中心，遼寧 沈陽 110036)

熒光染料E MA在實時熒光P C R定量檢測海產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌活細胞中的應(yīng)用

祝儒剛

(遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧省食品生物加工工程技術(shù)研究中心，遼寧 沈陽 110036)

將熒光染料——疊氮溴乙錠(ethidium bromide monoazide，EMA)與實時熒光-聚合酶鏈式反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)相結(jié)合，對其在RT-PCR定量檢測海產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌活細胞中的應(yīng)用進行研究。純培養(yǎng)條件下，在2.2×102～2.2×107CFU范圍內(nèi)細胞數(shù)的常用對數(shù)值與Ct值之間呈嚴格的負相關(guān)性，并且不添加EMA時的檢測靈敏度(22CFU)略大于添加EMA(2.2×102CFU)時的檢測靈敏度；人工污染牡蠣樣品，利用RT-PCR和EMA RT-PCR以及平板計數(shù)法分別進行副溶血弧菌定量檢測，結(jié)果表明EMA RT-PCR更接近于平板計數(shù)的結(jié)果，單純RT-PCR定量的結(jié)果偏大；在采集的45份海產(chǎn)品樣品中，不經(jīng)富集培養(yǎng)，利用EMA RT-PCR方法僅有一份牡蠣樣品呈陽性，牡蠣樣品污染程度為114CFU/g。該方法能夠快速、靈敏、準確地進行海產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌活細胞的定量檢測，具有很好的應(yīng)用價值。

疊氮溴乙錠(EMA)；實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)；海產(chǎn)品；活細胞；副溶血弧菌檢測

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是水產(chǎn)品中引起食物中毒的重要病原菌之一，在海產(chǎn)品中的攜帶率高達4 5.7%，其中牡蠣、毛蚶、泥螺、扇貝、龍蝦、蟹、章魚、蛤、鱈是副溶血性弧菌的主要侵染對象。目前，副溶血弧菌引起食物中毒的發(fā)生規(guī)模以及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢，已成為我國首要的食源性致病菌[1-3]。

近年來，一些基因水平的檢測方法，如聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法和實時熒光PCR(real-time PCR，RT-PCR)方法，由于在檢測病原菌方面快速、高靈敏度和高特異性等優(yōu)點，已經(jīng)顯示出長遠的發(fā)展前景。然而，在食品檢測方面，死菌DNA長期存在使基因水平的檢測方法高估了樣品中活菌的水平，有時甚至出現(xiàn)檢測的假陽性結(jié)果。熒光染料疊氮溴乙錠(ethidium bromide monoazide，EMA)能選擇性抑制死細胞DNA的PCR擴增，而對活細胞DNA的PCR擴增幾乎沒有影響。因此，EMA與RT-PCR技術(shù)相結(jié)合，能更加準確地檢測出樣品中活菌細胞的存在[4-9]。

目前，關(guān)于EMA與實時RT-PCR相結(jié)合定量檢測食品中致病菌活細胞的報道非常少，僅有創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌[10-12]。已有的報道也只是對EMA應(yīng)用于RTPCR的條件進行摸索，以及對EMA區(qū)分鑒別死活細胞的能力進行證實。本實驗在證實EMA可區(qū)分鑒別死活細胞的基礎(chǔ)上，著重研究其在RT-PCR定量檢測海產(chǎn)品中副溶血弧菌活細胞中的應(yīng)用，具有普遍應(yīng)用意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

扇貝、牡蠣、毛蚶樣品(各15份，每種海產(chǎn)品中8份來自海鮮批發(fā)市場、7份來自零售早市)；標準菌株、副溶血弧菌ATCC17802 本實驗室保存。

EMA 美國Sigma公司；LightCyclerOR480 SYBR GreenⅠ(cat. no.04707516001)羅氏熒光染料試劑盒 德國Roche Diagnostics公司；EZ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒 生工生物工程(上海)有限公司；胰胨肉湯(蛋白胨2%、NaCl 4%、0.01%的結(jié)晶紫溶液0.5%、pH9.0)、T1N3(1%蛋白胨、3% NaCl、2%瓊脂)瓊脂。

LightCycler 480實時熒光定量PCR儀 德國Roche Diagnostics公司；Stomacher 400型高效自動均質(zhì)器 英國Seward公司；752N紫外-可見分光光度計 西安明克斯檢測設(shè)備有限公司；鹵鎢燈(500W)。

1.2 細菌培養(yǎng)及活細胞熱致死時間確定

副溶血弧菌標準菌株ATCC 17802經(jīng)活化后轉(zhuǎn)接胰胨肉湯液體培養(yǎng)基，37℃、150r/min條件下過夜培養(yǎng)。收集菌體，經(jīng)0.85%滅菌生理鹽水洗滌兩次后，重懸于生理鹽水中。取定量菌懸液梯度稀釋，測定每個梯度的OD600nm并涂T1N3瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)48h后測定活菌數(shù)。以活菌數(shù)(x軸)和OD600nm值(y軸)做標準曲線，并且在本實驗中，均以此標準曲線調(diào)整菌液濃度[12]。3次獨立實驗，每次獨立實驗3次重復(fù)[13-15]。

取上述經(jīng)洗滌的菌懸液，調(diào)整其濃度為4×108CFU/ mL，分別取0.5mL于1.5mL離心管中，95℃水浴加熱，每隔30s取樣涂平板，37℃過夜培養(yǎng)并計數(shù)，此實驗重復(fù)3次取平均數(shù)。

1.3 EMA抑制熱致死副溶血弧菌細胞DNA RT-PCR擴增能力測定

經(jīng)0.85%滅菌生理鹽水洗滌的菌懸液，調(diào)整濃度后分別取0.5mL轉(zhuǎn)移至完全相同的5個離心管，每管內(nèi)活細胞數(shù)分別達到2×107、2×106、2×105、2×104、2×103CFU。95℃水浴加熱10min活細胞致死處理后，冷卻至室溫。另一組實驗，同樣準備5個完全一樣的離心管，每個離心管裝0.5mL菌懸液，活細胞數(shù)分別達到2×107、2×106、2×105、2×104、2×103CFU，不經(jīng)過水浴加熱活細胞致死處理。0.5mL滅菌生理鹽水而不含副溶血弧菌細胞的離心管作為陰性對照[16-17]。

向兩組實驗菌懸液中分別加入0.1mg/mL的EMA，使EMA終質(zhì)量濃度均達到1.0μg/mL。將菌懸液在黑暗處室溫放置5min，然后將離心管開蓋放置冰上，在距離燈管16cm處曝光20min。曝光后的混合菌懸液在10000r/min離心5min，收集菌體。倒掉上清液后將菌體重懸在0.5mL生理鹽水中，10000r/min再次離心5min，收集菌體，倒掉上清液，再次重懸于0.5mL生理鹽水中，裂解法提取DNA后用于RT-PCR[18-19]。

1.4 DNA模板制備[20]

用TZ裂解液(2.0% Triton X-100、2.5mg/mL的疊氮化鈉、0.1mol/L Tris-HCl緩沖液、pH8.0)提取模板DNA。經(jīng)EMA處理曝光后的菌懸液與等體積的2×TZ裂解液混勻，沸水浴10min后冷卻至室溫，10000r/min離心10min去掉菌體碎片沉淀，取上清液直接用作RT-PCR模板。

1.5 標準曲線的制作

取過夜培養(yǎng)的副溶血弧菌(ATCC 17802)菌懸液，菌體用滅菌生理鹽水洗滌兩次，調(diào)整菌懸液濃度約為4× 108CFU/mL。10倍梯度稀釋，得到菌濃度范圍4×107～4CFU/mL。

完全一樣的兩組實驗，向每組8個完全相同的離心管內(nèi)分別加入0.5mL菌懸液，每管細胞數(shù)分別為2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2× 101、2CFU。其中一組分別加入0.1mg/mL EMA，使EMA終質(zhì)量濃度均達到1.0μg/mL，然后如上進行曝光處理；另一組不添加EMA。0.5mL滅菌生理鹽水而不含副溶血弧菌細胞的離心管作為陰性對照。3次獨立實驗，每次獨立實驗3次重復(fù)。兩組實驗離心收集菌體后，用柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒抽提DNA，溶于20μL滅菌水中備用[21-23]。

每個稀釋度精確的活菌數(shù)通過取其中一個稀釋度的菌懸液涂T1N3瓊脂平板后，37℃培養(yǎng)48h計數(shù)獲得。

1.6 人工污染牡蠣組織中致病性副溶血弧菌細胞的RTPCR和EMA RT-PCR定量檢測

調(diào)整菌懸液濃度約為4×108CFU/mL，10倍梯度稀釋，得到菌濃度范圍4×108～4×103CFU/mL。

牡蠣樣品來自當?shù)睾．a(chǎn)品零售市場，在無菌均質(zhì)袋內(nèi)，無菌操作剪碎5g樣品于44mL滅菌胰胨肉湯液體培養(yǎng)基，利用高效自動均質(zhì)器均質(zhì)，無菌操作每個濃度水平取1mL分別接種，混勻。

吸取每個樣品10mL，800r/min離心10min，除去牡蠣細胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，10000r/min離心10min收集菌體，將菌體重懸于1mL滅菌生理鹽水中。一管用于平板計數(shù)，另一管分成兩個0.5mL，其中一個0.5mL經(jīng)EMA處理后用柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒抽提DNA用于RT-PCR定量，另一個0.5mL菌懸液不經(jīng)EMA處理直接抽提DNA用于RT-PCR定量[16]。

定量結(jié)果的表現(xiàn)形式為lg(CFU/g)(以牡蠣組織質(zhì)量計)。將平板計數(shù)的結(jié)果與RT-PCR和EMA RT-PCR定量結(jié)果相比較。為確保牡蠣樣品不含trh陽性副溶血弧菌，取1g樣品加入50mL胰胨肉湯培養(yǎng)基中，37℃、150r/min過夜培養(yǎng)后，取菌液做RT-PCR鑒定。

1.7 海產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌活細胞的定量檢測

最常見且最易被副溶血弧菌污染的扇貝、牡蠣、毛蚶樣品用專用的無菌采集袋采集，跟預(yù)先準備好的冰袋一起迅速送回分析實驗室，并在24h內(nèi)做分析處理。樣品經(jīng)去殼和除去雜質(zhì)處理后，無菌操作每份樣品取5g內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至45mL胰胨肉湯培養(yǎng)基中，在均質(zhì)袋內(nèi)用高效自動均質(zhì)器均質(zhì)1min。吸取每個樣品10mL，800r/ min離心10min，除去細胞碎片，上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，10000r/min離心10min收集菌體。將菌體重懸于0.5mL無菌水中，添加EMA，使其終質(zhì)量濃度達到1.0μg/mL。將菌懸液在黑暗處室溫放置5min，然后將離心管開蓋放置冰上，在距離燈管16cm處曝光20min。曝光后的混合菌懸液10000r/min離心5min，收集菌體。倒掉上清液后將菌體重懸在0.5mL的無菌水中，10000r/ min再次離心5min，收集菌體，棄去上清液，再次重懸在50μL無菌水中[12]。利用柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒抽提DNA，溶于20μL滅菌水中備用。

1.8 引物及RT-PCR擴增

實驗采用實時熒光定量PCR儀。病原性副溶血弧菌致病基因trh檢測引物上游(P1)為：5′-TTGCTTTCAG TTTGCTATTGGCT-3′；下游引物(P2)為：5′-GCTAC TTTCTAGCATTTT CTCTGC-3′，擴增片段長度為300bp。20μL的擴增體系包括：10μL熒光染料混合液，5μL模板D N A，上下游引物各1μL(10μmol/L)、3μL PCR級無菌水。RT-PCR反應(yīng)體系：94℃預(yù)變性10min，35個循環(huán)，每個循環(huán)94℃ 20s，55℃ 20s，72℃30s[12]。每個RT-PCR反應(yīng)重復(fù)3次，得到平均Ct值和標準背離值。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗，P＜0.05表示具有差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血弧菌的熱致死時間

95℃水浴處理副溶血弧菌菌懸液(OD600nm為0.7，4×108CFU/mL)[12]，每隔30s取樣涂平板，每個樣品設(shè)3個重復(fù)，37℃過夜培養(yǎng)后觀察計數(shù)(圖1)。結(jié)果表明，隨著熱處理時間的增加，其平板菌落數(shù)逐漸減少，當熱處理時間延長到9min時，副溶血弧菌已失活，平板上沒有菌落生長，平板計數(shù)為零。因此，為了確保所有副溶血弧菌完全被殺死，得到結(jié)果：將濃度為4× 108CFU/mL的副溶血弧菌菌懸液在95℃水浴處理10min，所有副溶血弧菌細胞都已經(jīng)殺死，平板計數(shù)為零。

圖1 不同加熱時間處理后的副溶血弧菌活細胞數(shù)Fig.1 Viable cell counts of Vibrio parahaemolyticus during thermal treatment

2.2 EMA抑制熱致死副溶血弧菌細胞DNA RT-PCR擴增

經(jīng)EMA處理，當活細胞數(shù)由2×107減少到2×103時，Ct值從18.52±0.52線性增大到27.49±0.41；同樣經(jīng)EMA處理的熱致死細胞，當細胞數(shù)由2×107CFU/g減少到2×103CFU/g時，對應(yīng)RT-PCR的Ct值從28.8±0.41 變化至30.21±0.39，此時陰性對照(無細菌細胞)的Ct值為30.5±0.70(圖2)。這表明，對熱致死細胞來說，EMA完全有效地抑制了其DNA的RT-PCR擴增，在R T-PCR擴增體系中，幾乎不存在可擴增的DNA，因此其Ct值與陰性對照的Ct值無顯著差異(P＞0.05)；而EMA對活細胞DNA的RT-PCR擴增幾乎沒有影響，隨著細胞數(shù)的減少，Ct值逐漸增大，各Ct值與陰性對照均存在顯著差異(P＜0.05)。

圖2 EMA抑制熱致死細胞DNA RT-PCR擴增能力Fig.2 Inhibitory effect of EMA on RT-PCR amplification of DNA from thermally inactivated Vibrio parahaemolyticus cells

2.3 定量標準曲線

表1 添加和不添加EMA樣品的Ct值與菌落數(shù)關(guān)系Table 1 Relationship between CFU and Ct value of samples with and without EMA treatment

圖3 添加和不添加EMA情況下細胞常用對數(shù)值與Ct值的標準曲線Fig.3 Standard curves between Log CFU and Ct with and without the addition of EMA

理論上，基于已知的細胞數(shù)量和對應(yīng)Ct值所獲得的標準曲線可以通過RT-PCR對不同來源樣品中的細胞數(shù)進行定量。本實驗結(jié)果表明，對于RT-PCR(22×107～2.2× 107CFU范圍內(nèi))和EMA RT-PCR(2.2×102～2.2×107CFU范圍內(nèi))，Ct值與細胞對數(shù)之間具有非常好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)分別為0.9883和0.9987。相同條件下，RTPCR的檢測靈敏度高于EMA RT-PCR的靈敏度，分別為22CFU和2.2×102CFU。并且，相同細胞濃度下，EMA RT-PCR的Ct值大于RT-PCR約1～2個循環(huán)(表1、圖3)。陰性對照沒有檢測到副溶血弧菌細胞存在。本研究的隨后實驗當中，對于經(jīng)EMA或不經(jīng)EMA處理的樣品，均用此標準曲線來對樣品中的細菌數(shù)進行定量。

2.4 人工污染牡蠣組織中致病性副溶血弧菌RT-PCR和EMA RT-PCR定量檢測與平板計數(shù)比較

分別用RT-PCR、EMA RT-PCR和平板計數(shù)法對6個稀釋梯度的人工污染牡蠣組織中的總致病性副溶血弧菌進行定量。RT-PCR和EMA RT-PCR的定量Ct值通過圖3的標準曲線計算出lg(CFU/g)，結(jié)果如表2所示?？傮w來說，RT-PCR和EMA RT-PCR的定量結(jié)果與平板計數(shù)的結(jié)果均非常接近，其中EMA RT-PCR的定量結(jié)果更接近于平板計數(shù)的結(jié)果，略為偏低；而RT-PCR的定量結(jié)果偏離平板計數(shù)的結(jié)果稍大一些，大于EMA RT-PCR和平板計數(shù)的結(jié)果(P＜0.05)。由于檢測靈敏度的關(guān)系，EMA RT-PCR沒有檢測出4×103CFU/mL污染梯度樣品中的副溶血弧菌。這表明，EMA RT-PCR技術(shù)可以代替平板計數(shù)的方法定量檢測海產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌活細胞，可以大大縮短定量時間。

表2 RT-PCR、EMA RT-PCR和平板計數(shù)法測定人工污染牡蠣中細菌總數(shù)的比較Table 2 Comparison of total bacterial counts in artificially contaminated oyster determined by RT-PCR, EMA RT-PCR and plate count methods

2.5 實際海產(chǎn)品樣品中致病性副溶血弧菌活細胞檢測

利用EMA RT-PCR技術(shù)對實際樣品進行定量檢測。結(jié)果表明，15份牡蠣樣品中，一份樣品呈致病性副溶血弧菌陽性，樣品采自零售早市，含菌量為114CFU/g，其余未檢出致病性副溶血弧菌的樣品經(jīng)6h富集培養(yǎng)后，又有一份零售早市樣品呈陽性，富集后的菌濃度為2.8× 103CFU/mL。富集前，15份扇貝和15份毛蚶均為致病性副溶血弧菌陰性；經(jīng)6h富集培養(yǎng)后，兩份毛蚶和一份扇貝檢測出致病性副溶血弧菌陽性，一份毛蚶來自海鮮批發(fā)市場、一份來自零售早市，富集后的菌濃度分別為3.7×103、2.5×103CFU/mL，陽性扇貝樣品也采自零售早市，富集后的菌濃度為2.9×103CFU/mL。

3 討 論

EMA能滲透到細胞壁或細胞膜不完整的死細胞體內(nèi)并插入DNA共價結(jié)合，隨后基于DNA的PCR檢測方法就不能擴增死細胞DNA；而活細胞的完整細胞壁、活細胞膜能夠阻止EMA滲透到菌體內(nèi)與DNA共價結(jié)合，因而其PCR擴增不受影響。EMA的這種性質(zhì)為PCR方法檢測區(qū)分海產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌死活細胞提供了可靠的方法依據(jù)。傳統(tǒng)的平板計數(shù)法能定量檢測活細胞，但是所需時間較長，而單獨的RT-PCR也只能定量檢測總的細胞數(shù)，而將EMA與RT-PCR結(jié)合則能夠準確檢測出存活于海產(chǎn)品中的致病性副溶血弧菌，并且定量檢測可在4h內(nèi)完成，大大縮短了定量的時間[24]。

添加和不添加EMA情況下Ct值與細胞數(shù)常用對數(shù)值之間的標準曲線表明，Ct值與細胞數(shù)常用對數(shù)值之間存在嚴格的負相關(guān)性，添加EMA和不添加EMA時的相關(guān)系數(shù)分別達到0.9987和0.9883。并且添加EMA時的檢測靈敏度低于不添加EMA的靈敏度，兩者分別為2.2× 102CFU和22CFU，這表明EMA的添加會對檢測的靈敏度有一些影響，這可能是由于高濃度的EMA也會對少量活細胞DNA的擴增有影響所致。這一點在對比RTPCR和EMA RT-PCR方法對人工污染牡蠣樣品中致病性副溶血弧菌的定量檢測時也有所體現(xiàn)，相同的人工污染副溶血弧菌濃度條件下，EMA RT-PCR定量的結(jié)果最小，平板計數(shù)的結(jié)果居中，普通EMA RT-PCR的結(jié)果最大(P＜0.05)[25-27]。

從采集的45份海產(chǎn)品樣品的檢測結(jié)果可以看出，零售早市采集的樣品污染致病性副溶血弧菌的幾率高于從各大海鮮批發(fā)市場采集的樣品，這跟海產(chǎn)品所處的環(huán)境以及新鮮程度有很大關(guān)系。

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Application of Ethidium Bromide Monoazide for Quantification of Pathogenic Viable Cells ofVibrio parahaemolyticusin Seafood Using Real-time Polymerase Chain Reaction

ZHU Ru-gang
(Engineering Technology Research Center for Food Biology Processing of Liaoning Province, College of Light Industry, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

The pathogenic viable cells ofVibrio parahaemolyticusin seafood were detected using real-time polymerase chain reaction combined with ethidium bromide monoazide (EMA) dye. For pure culture, there was a negative correlation between the log number of cells and the associated Ct value in the range of 2.2 × 102to 2.2 × 107CFU, and the detection sensitivity of single RT-PCR (22 CFU) was slightly higher than that of EMA RT-PCR(2.2×102CFU). For artificially contaminated oyster samples, similar results were obtained from EMA RT-PCR and plate count method, and slightly lower results from single RT-PCR. Without enrichment, only one positive sample was detected in forty-five seafood samples by EMA RT-PCR with a viableVibrio parahaemolyticuscell of 114 CFU/g. In conclusion, EMA RT-PCR could provide a rapid, sensitive and accurate way for the quantitative detection ofVibrio parahaemolyticusin seafood.

ethidium bromide monoazide (EMA)；real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)；seafood；viable cells；Vibrio parahaemolyticusdetection

TS201.6

A

1002-6630(2011)20-0206-05

2010-12-02

遼寧大學(xué)青年科學(xué)基金項目(2009LDQN21)

祝儒剛(1980—)，男，講師，博士研究生，研究方向為食品微生物與分子生物學(xué)。E-mail：zrg_luck@163.com