涂 世，徐麗嫚，陳 靜，劉 睿*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢市蜂產(chǎn)品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070)

油菜蜂蜜中揮發(fā)性成分指紋圖譜的建立

涂 世，徐麗嫚，陳 靜，劉 睿*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢市蜂產(chǎn)品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070)

分析油菜單花蜜中的揮發(fā)性成分，建立油菜單花蜜揮發(fā)性成分的指紋圖譜。采用超聲波輔助萃取法提取49種不同產(chǎn)地的油菜單花蜜中的揮發(fā)性物質(zhì)，并利用氣相-氫火焰化離子檢測(cè)(gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)技術(shù)分析，對(duì)氣相分析結(jié)果進(jìn)行聚類分析和相似度分析。結(jié)果表明：49種油菜蜜分為5類，能明顯區(qū)分未經(jīng)加工的原料油菜蜜和市售油菜蜜；原料油菜蜜和市售油菜蜜的揮發(fā)性成分存在明顯差異；推斷苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼可能作為油菜蜜植物源標(biāo)記物。

油菜蜜；超聲波輔助萃??；氣相色譜-質(zhì)譜法；指紋圖譜

我國(guó)是蜂蜜出口第一大國(guó)，但是由于摻假造假等問(wèn)題頻發(fā)，嚴(yán)重影響我國(guó)蜂蜜在國(guó)際上的聲譽(yù)，導(dǎo)致我國(guó)蜂蜜交易價(jià)值相對(duì)較低。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)蜂蜜質(zhì)量也是良莠不齊，摻假造假現(xiàn)象嚴(yán)重挫傷了消費(fèi)者的購(gòu)買積極性，致使國(guó)內(nèi)消費(fèi)市場(chǎng)增長(zhǎng)緩慢。歐盟2001/110/EC關(guān)于蜂蜜的指令鼓勵(lì)蜂蜜按照植物源和地理源對(duì)蜂蜜進(jìn)行標(biāo)注以保障產(chǎn)品質(zhì)量[1]。阿根廷蜂業(yè)協(xié)會(huì)利用國(guó)際物品編碼協(xié)會(huì)的全球統(tǒng)一標(biāo)識(shí)系統(tǒng)進(jìn)行蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全追溯，蜂產(chǎn)品產(chǎn)量居世界第二的阿根廷在產(chǎn)值上卻是世界第一，與其嚴(yán)格控制蜂蜜質(zhì)量安全有著密切的關(guān)系[2]。我國(guó)鼓勵(lì)全面開展蜂產(chǎn)品質(zhì)量可溯源技術(shù)體系的研究，需要對(duì)單花蜜的植物源和地理源進(jìn)行標(biāo)記，建立一套可信的檢測(cè)系統(tǒng)[3]。單花蜜具有天然的特性和功效，在市場(chǎng)上受消費(fèi)者歡迎，可以增加其商業(yè)價(jià)值。例如，橙花蜜和洋槐蜜在世界范圍內(nèi)的銷售價(jià)格比百花蜜高[4]。歐美等國(guó)家已經(jīng)開展了一些單花蜜的揮發(fā)性指紋圖譜研究[5-11]，我國(guó)蜜源眾多、地域廣泛，開展單花蜜揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜研究尚在起步階段。

蜂蜜的特性、風(fēng)味、顏色主要取決于花的類型或地理位置。每種單花蜜都會(huì)有自己特定的揮發(fā)性物質(zhì)的指紋圖譜。蜂蜜中揮發(fā)性物質(zhì)眾多，目前已經(jīng)鑒定出來(lái)的有400多種[12]。關(guān)于蜂蜜揮發(fā)性物質(zhì)在歐美等地區(qū)已有多年研究，國(guó)外學(xué)者初步確定了歐洲產(chǎn)栗樹、桉樹、石楠花、酸橙、百里香等植物的標(biāo)記性物質(zhì)[5,9,13-16]。李成斌等[17]對(duì)8種蜂蜜揮發(fā)性成分進(jìn)行研究，找出了它們的共有成分。孫麗陽(yáng)[18]采用固相微萃取及同時(shí)蒸餾萃取法對(duì)蜂蜜的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取，采用GC-MS方法進(jìn)行分離、鑒定了蜂蜜中37種揮發(fā)性物質(zhì)。目前用于分析蜂蜜揮發(fā)性成分的方法很多，其中超聲波輔助萃取(ultrasonic solvent extraction，USE)具有萃取效率高、萃取時(shí)間短、重現(xiàn)性好、適于熱敏性物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)[19-20]，國(guó)外一些研究[21-25]也證明USE方法萃取蜂蜜揮發(fā)性物質(zhì)效果好。蜂蜜蜜源的典型分析方法，如花粉分析、感官分析，并不能有效對(duì)蜂蜜的來(lái)源進(jìn)行歸類，而且，花粉和感官分析需要訓(xùn)練有素的人員，并且比較耗時(shí)，主觀性強(qiáng)[4]。油菜蜜是我國(guó)產(chǎn)量最大的單花蜜，也是出口量最大的單花蜜，為探索和建立檢測(cè)蜂蜜植物源和地理源的方法，本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)分析油菜單花蜜的揮發(fā)性成分，建立單花蜜的揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜，期望為蜂蜜質(zhì)量控制和蜂蜜產(chǎn)品全程跟蹤和快速溯源提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表1 油菜蜂蜜樣品產(chǎn)地及時(shí)間Table 1 Geographical origins and harvest time of rape honey samples

蜂蜜樣品：其產(chǎn)地和采集時(shí)間見表1。1～43、45～48號(hào)原料油菜蜜根據(jù)質(zhì)量溯源管理體系從峰農(nóng)購(gòu)得，未經(jīng)任何加工；44號(hào)原料油菜蜜直接從蜂農(nóng)購(gòu)得；49號(hào)原料油菜蜜從超市購(gòu)得，原料儲(chǔ)存在－18℃的冰柜中。

無(wú)水乙醚(分析純)；正戊烷(分析純)；無(wú)水硫酸鎂(分析純)；油酸乙酯(純度98%)。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N/5975B-GC/MSD氣質(zhì)聯(lián)用儀、6890N氣相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；KQ-100DE型超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲波輔助萃取提取油菜蜂蜜揮發(fā)性成分方法

本研究參考Alissandrakis等[20]的研究方法，對(duì)影響超聲波輔助萃取的蜂蜜質(zhì)量、溶劑體積、萃取時(shí)間和加水體積4個(gè)主要因素進(jìn)行優(yōu)化。固定溶劑體積30mL、萃取時(shí)間30min、加水體積20mL，蜂蜜質(zhì)量選取20、30、40、50、60g五個(gè)梯度；固定蜂蜜質(zhì)量40g，萃取時(shí)間30min、加水體積20mL，溶劑體積選取10、20、30、40、50mL五個(gè)梯度；固定蜂蜜質(zhì)量40g、溶劑體積30mL、加水體積20mL，萃取時(shí)間選取10、20、30、40、50min五個(gè)梯度；固定蜂蜜質(zhì)量40g、溶劑體積30mL、萃取時(shí)間30min，加水體積選取10、20、30、40、50mL五個(gè)梯度。通過(guò)對(duì)比以上不同單因素條件下GC分析的總峰面積和總峰個(gè)數(shù)，得到USE的最優(yōu)條件為蜂蜜質(zhì)量30g、溶劑體積30mL、超聲時(shí)間30mlL、加水體積40mL。

250mL碘量瓶中加入30g油菜蜂蜜、40mL純凈水、1.5g無(wú)水硫酸鎂、30mL溶劑正戊烷:無(wú)水乙醚1:2(V/V)，超聲頻率40kHz、水溫(25±3)℃、超聲萃取30min。有機(jī)層用分液漏斗分離，水層回加至碘量瓶，碘量瓶中加入一組相同溶劑30mL、萃取30min。共進(jìn)行3次同樣的超聲萃取?；旌嫌袡C(jī)層，加入2g無(wú)水硫酸鎂干燥，上層澄清有機(jī)層用0.45μm有機(jī)相過(guò)濾器過(guò)濾，揮干至1mL，用1.5mL安捷倫小進(jìn)樣瓶密封，－18℃冷凍保存，待分析。

1.3.2 對(duì)照品溶液制備

準(zhǔn)確量取0.1mL油酸乙酯，置100mL容量瓶中，用溶劑正戊烷:無(wú)水乙醚1:2(V/V)稀釋至刻度，搖勻備用。

1.3.3 氣相色譜條件

HP-5毛細(xì)管柱(30m×320μm，0.25μm)；進(jìn)樣口溫度250℃，不分流進(jìn)樣；FID檢測(cè)器溫度300℃，載氣高純氮?dú)?，流?.2mL/min；初始溫度36℃，保持5min，以4℃/min上升至180℃保持2min，以5℃/min上升至220℃保持2min，以10℃/min上升至260℃，保持5min。

1.3.4 氣相色譜質(zhì)譜條件

氣相色譜條件：HP-5MS毛細(xì)管柱(30m×250μm，0.25μm)；進(jìn)樣口溫度250℃，不分流進(jìn)樣；載氣為氦氣，流速1.2mL/min；程序升溫同1.3.3節(jié)。

質(zhì)譜條件：溶劑延遲5min；接口溫度280℃；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；離子化方式：EI；電子能量70eV；質(zhì)量范圍35～350u/s。

1.3.5 方法學(xué)考察

精密度實(shí)驗(yàn)：取同一供試蜂蜜樣品，相同GC條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD小于2.52%，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于0.24%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取同一蜂蜜樣品，按照1.3.1節(jié)方法平行制備6份供試樣品溶液，相同GC條件分析，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD小于4.56%，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于0.17%，表明實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取同一供試樣品，分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣，相同GC條件分析，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD小于2.83%，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于0.08%，表明供試樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定，達(dá)到指紋圖譜分析要求。

1.3.6 結(jié)果分析與數(shù)據(jù)處理

GC-MS分析結(jié)果運(yùn)用計(jì)算機(jī)譜庫(kù)(NIST/WILEY)進(jìn)行檢索分析，部分物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，確認(rèn)揮發(fā)性化合物的化學(xué)成分?；衔锵鄬?duì)含量確定采用面積歸一法。49種樣品的GC分析結(jié)果，根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間和峰面積選取共有峰，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜蜂蜜GC指紋圖的建立

圖1 42號(hào)油菜蜜樣品的氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram of No.42 rape honey

49個(gè)蜂蜜樣品利用GC分析，通過(guò)比較49批樣品的色譜圖和相對(duì)保留時(shí)間，發(fā)現(xiàn)17個(gè)峰為大多數(shù)樣品共有，保留時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，因此確定這17個(gè)峰為共有指紋峰[26]。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局(2000)在《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》中指出[27]：指紋圖譜的建立必須設(shè)立參照峰，應(yīng)選擇指紋圖譜中峰面積較大，相對(duì)穩(wěn)定的色譜峰作為參照峰。對(duì)比得到保留時(shí)間為48.305min的12號(hào)峰符合此條件，選為參照峰。通過(guò)GC-MS分析以及樣品溶液和對(duì)照品溶液GC保留時(shí)間的比對(duì)[28]，確定12號(hào)峰為油酸乙酯。典型樣品氣相色譜圖見圖1。

2.2 聚類分析結(jié)果

以參照色譜峰的保留時(shí)間和峰面積作為1，分別計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。利用SPSS軟件，采用組間聯(lián)接聚類法，計(jì)算準(zhǔn)則為平方歐氏距離，對(duì)49個(gè)樣品進(jìn)行聚類分析，成功將樣品分為5大類，結(jié)果見表2和圖2。

表2 聚類分析結(jié)果Table 2 Results of cluster analysis

圖2 油菜蜜聚類分析結(jié)果Fig.2 GC chromatogram of rape honey sample

根據(jù)聚類分析結(jié)果可以看出，49種油菜蜂蜜樣品被分為5類，G103湖北浠水和G048湖北仙桃樣品分為一類，產(chǎn)于2010年6月的青海樣品分為一類，產(chǎn)于2010年4月的荊州樣品分為一類， 市售江蘇揚(yáng)州樣品分為一類，其余樣品分為一大類。從表2可以看出，49種蜂蜜樣品中有44種集中于第1類，達(dá)到了總數(shù)的89.8%，說(shuō)明單花蜜可以通過(guò)揮發(fā)性物質(zhì)達(dá)到歸類辨別的目的。其中5、28、40、44號(hào)樣品差異于第1類，可能與蜜源地的氣候、采集時(shí)間、采集過(guò)程、盛裝容器等因素相關(guān)。49號(hào)市售蜂蜜明顯不同于其他蜂蜜，初步推斷其為假蜂蜜。為詳細(xì)分析油菜蜂蜜中的揮發(fā)性物質(zhì)和鑒別市售蜂蜜，進(jìn)一步對(duì)樣品采用GC-MS分析。

2.3 相似度分析

參考聚類分析結(jié)果，選取第1類樣品采用平均矢量法建立共有模式[28-29]，得到標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜信息Table 3 Standard fingerprint data

以標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜為對(duì)照，計(jì)算各樣品的相關(guān)系數(shù)，聚類分析第1類樣品中相關(guān)系數(shù)大于0.90的樣品有30個(gè)，占總樣品數(shù)的61.22%，大于0.8的樣品有36個(gè)，占總樣品數(shù)的73.47%，其他4類樣品的匹配度均小于0.42，其中49號(hào)樣品匹配度為0.11。結(jié)果表明，相似度分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

2.4 GC-MS鑒定

表4 GC-MS鑒定結(jié)果Table 4 GC-MS identification results

續(xù)表4

續(xù)表4

通過(guò)GC分析、SPSS聚類分析和相似度分析情況，選取5、34、40、42號(hào)油菜蜜和49號(hào)市售油菜蜜的GCMS結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

從表4可以看出，49號(hào)市售油菜蜜和原料油菜蜜存在明顯差異，49號(hào)樣品總離子流圖的總峰少、峰值都很低，揮發(fā)性物質(zhì)較少，該分析結(jié)果與氣相色譜的分類結(jié)果一致，初步推斷該市售蜜為摻假或造假蜜。分析其他4種樣品可以看出，5號(hào)樣品主要含有油酸乙酯(20.026%)、二十五烷(11.207%)、2,6,10,14-四甲基-十六烷(7.179%)、苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼(6.775%)，34號(hào)樣品主要含有油酸乙酯(18.980%)、苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼(9.529%)、苯甲酸(7.240%)、棕櫚酸乙酯(3.704%)，40號(hào)樣品主要含有二十七烷(21.317%)、二十五烷(7.582%)、油酸乙酯(3.882%)、苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼(2.784%)，42號(hào)樣品主要含有二十五烷(9.843%)、油酸乙酯(4.312%)、苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼(3.962%)、仲丁基醚(2.789%)。5號(hào)油菜蜜含有較多的2,6,10,14-四甲基-十六烷(7.179%)，40號(hào)油菜蜜中二十七烷(21.317%)含量最多，這也可能是這兩種油菜蜜差異于第1大類油菜蜜的主要原因，也證明了GC和GC-MS分析結(jié)果的一致性。以上4種油菜蜜存在一些含量較高的共有組分：油酸乙酯、苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼、棕櫚酸乙酯、順-9-二十三碳烯、二十五烷、二十七烷，這也證明蜜源是決定蜂蜜揮發(fā)性物質(zhì)組成的主要因素之一[30]。苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼在4種油菜蜜中含量較高，綜合其他一些原料蜜的分析結(jié)果可以得出，苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼含量在1.18%～16.37%之間，并且該物質(zhì)在市售油菜蜜中沒有被檢出，因此其可能為油菜蜜的植物源標(biāo)記物之一。Radovic等[11]報(bào)道過(guò)二甲基二硫和二甲基丙醇可以作為歐洲地區(qū)油菜蜜的植物源標(biāo)記物。Kakonienè等[12]研究發(fā)現(xiàn)油菜蜜中普遍都含有一定量的苯乙醛，本研究發(fā)現(xiàn)34、42號(hào)兩種油菜蜜中含有苯乙醛。本研究結(jié)果與他們的結(jié)果不同可能在于地理源不同和萃取方法的差異，這也說(shuō)明了地理源對(duì)蜂蜜揮發(fā)性物質(zhì)影響的重要性。4種樣品中含有許多烴類物質(zhì)，可能主要與采取超聲波輔助萃取的方法有關(guān)，Jerkovi等[23]指出USE方法提取的主要物質(zhì)是揮發(fā)性和低分子質(zhì)量的半揮發(fā)性物質(zhì)。

3 結(jié) 論

本研究利用GC和GC-MS分析了超聲波輔助萃取的49種油菜蜜中的揮發(fā)性物質(zhì)，成功將49種油菜蜜分為5大類，并且第1大類占87.76%；市售油菜蜜與其他油菜蜜樣品相比其揮發(fā)性成分明顯不同，自成一類，結(jié)合GC-MS分析結(jié)果，可以推斷市售油菜蜜可能為摻假或造假蜜。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼可能作為油菜蜜植物源標(biāo)記物，這還需要對(duì)比不同植物源蜂蜜進(jìn)行確證。本研究與歐洲發(fā)現(xiàn)的油菜蜜標(biāo)記物有所不同，但是沒有發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)不同地區(qū)油菜蜜地域之間的明顯差異。

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Fingerprinting of Volatile Composition of Rape Honey

TU Shi，XU Li-man，CHEN Jing，LIU Rui* (Wuhan Research Center on Quality Control Engineering of Bee Products, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

In order to label the botanical and geographical origin of unioral rape honey and discriminate adulterated rape honey, the volatile components in 49 rape honey samples from different geographical origins were analyzed by ultrasonic-assisted extraction, gas chromatography with flame ionization detector (GC-FID) and gas chromatography-mass spectrometry (GCMS) and fingerprinted. The results indicated that 49 samples investigated could be assigned into 5 groups, with an effective discrimination between raw and commercial rape honeys. Both rape honeys exhibited an obvious difference in their volatile components. We deduce that benzoic acid-4-hydroxy-3,5-dimethoxy-hydrazide has the potential to be used as a marker of botanical origin of rape honey.

rape honey；ultrasonic-assisted solvent extraction (USE)；gas chromatography-mass spectrometry (GCMS)；fingerprint

S896.1

A

1002-6630(2011)20-0136-06

2011-06-29

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2010PY015)；武漢市蜂產(chǎn)品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目(200920137007)

涂世(1987—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榉洚a(chǎn)品加工及質(zhì)量控制。E-mail：ts88532@126.com

*通信作者：劉睿(1969—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)榉洚a(chǎn)品加工及質(zhì)量控制。E-mail：liurui@mail.hzau.edu.cn