吳燕燕，宮曉靜,2，李來好，楊賢慶

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所，國家水產品加工技術研發(fā)中心，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306)

風味蛋白酶水解合浦珠母貝肉制備抗菌肽人工神經網絡法優(yōu)化工藝

吳燕燕1，宮曉靜1,2，李來好1，楊賢慶1

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所，國家水產品加工技術研發(fā)中心，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306)

利用具有自學習特點的人工神經網絡可實現對酶解過程的模擬仿真，研究從合浦珠母貝肉中制備抗菌肽的最佳工藝條件。采用3層(5-9-3)人工神經網絡法對風味蛋白酶水解合浦珠母貝肉的工藝過程進行模擬和優(yōu)化，并通過管碟抑菌法對產物的抑菌性質進行分析。結果表明：pH7.0、水解溫度55℃、酶添加量1.6%、水解時間4h、料液比7:5，制備得到肽A，抑制鼠傷寒沙門氏菌最強，抑菌圈直徑14.20mm，平均肽鏈長度2.6；pH7.0、水解溫度55℃、酶添加量1.7%、水解時間4h、料液比3:2，制備得到肽B，抑制痢疾志賀氏菌最強，抑菌圈直徑23.42mm，平均肽鏈長度2.8；pH6.5、水解溫度60℃、酶添加量2.5%、水解時間4h、料液比7:5，制備得到肽C，對單核細胞增生李斯特菌的抑制效果最強，抑菌圈直徑16.60mm，平均肽鏈長度2.5。3種抗菌肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌也具有較強的抑菌效果，抑菌率為74.3%～80.8%。本研究利用人工神經網絡優(yōu)化制備的貝肉抗菌肽克服了純度低、提取率低等缺點，為合浦珠母貝肉抗菌肽的開發(fā)利用提供技術支撐。

合浦珠母貝肉；抗菌肽；制備；人工神經網絡優(yōu)化法

由于當前食品工業(yè)上所采用的防腐保鮮劑多為化學合成，從更安全和健康的角度出發(fā)，亟需尋找天然高效的食品防腐保鮮劑?？咕挠捎诰哂袕V譜抗菌的特點，從天然產物中獲取天然抗菌肽應用于食品防腐保鮮是當前的研究熱點，合浦珠母貝(Pinctada fucata)是我國生產海水珍珠主要養(yǎng)殖貝類，隨著海水珍珠養(yǎng)殖產量的不斷增大，采珠后產生的大量珍珠貝肉急需進行高值化加工利用。由于珍珠貝類本身缺乏類似高等脊椎動物那樣的特異免疫系統(tǒng)，其免疫主要依賴于豐富的體液防御系統(tǒng)中的各類免疫因子，其非特異性免疫系統(tǒng)很發(fā)達，而抗菌肽是其非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，且其生長過程生產珍珠的特異性，因此蘊藏著豐富的抗菌肽。由于海洋環(huán)境的復雜性和多樣性，海洋無脊椎動物抗菌肽具有比陸生生物抗菌肽抗菌活性更強、更耐熱、更耐鹽等特性，因而其在食品保鮮、貯藏及加工上的應用具有更廣闊的前景。

控制酶解過程制備抗菌肽屬于非線性和非穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)，傳統(tǒng)的正交試驗分析方法對因素水平和交互作用的要求有一定的限制，不可避免地要損失一些信息，不能真正獲得多因素連續(xù)區(qū)域中的最優(yōu)工藝方案。而具有高度的非線性、能夠進行復雜的邏輯操作和非線性關系實現的人工神經網絡優(yōu)化法則因其獨特的并行性、容錯性、自學習性及強大的運算、識別、判斷能力適合對此過程的建模及仿真。目前人工神經網絡已用于包括干燥、焙烤、擠壓、發(fā)酵、采后保藏、食品流變學及熱處理等食品工業(yè)領域[1]。本實驗以合浦珠母貝肉為原料，以抑制細菌生長為指標，設計了3層人工神經網絡對酶解過程進行模擬和仿真，利用24組試驗結果為訓練樣本，充分挖掘試驗信息，從而獲得制備合浦珠母貝肉抗菌肽的最優(yōu)酶解工藝條件，為合浦珠母貝肉的高值化利用提供新的技術。而從珍珠貝肉中制備的海洋天然抗菌肽也將為食品工業(yè)提供抑菌效果更佳的天然防腐保鮮劑，具有較大的應用價值和社會效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

合浦珠母貝肉：購于海南珍珠貝養(yǎng)殖場，－20℃冷凍備用。

風味蛋白酶(20萬U/g，食品級) 丹麥Novo公司；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

供試病原菌：鼠傷寒沙門氏菌(S a l m o n e l l a typhimurium)、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、單核細胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach) 廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2 儀器與設備

KjeltecTM2300全自動凱氏定氮儀 丹麥Foss公司；3K30型高速冷凍離心機 德國Sigma公司；BS124S型電子天平、普及型pH計 德國Sartorius公司；DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠；DK-S24型恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器廠有限公司；全自動菌落分析儀 杭州迅數科技有限公司；Akku-drive電子滴定儀 德國赫施曼公司。

1.3 方法

1.3.1 合浦珠母貝肉水解液制備

新鮮貝肉預處理→組織搗碎→酶解→滅酶→離心→超濾→貝肉水解液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌種活化

在無菌條件下，將菌種接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的試管斜面上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

1.3.3 菌懸液配制

用接種環(huán)從活化后的菌種斜面上刮少量菌，在100mL無菌生理鹽水中稀釋，振搖均勻，即為濃度1；然后從濃度1的試管中準確吸取1mL，加入到裝有9mL無菌生理鹽水的試管里混勻，即為濃度2；同濃度2法得到濃度3，備用。

1.3.4 管碟法測抑菌圈直徑[2]

培養(yǎng)基應預先滅菌并冷卻至40～50℃，從濃度3的試管里準確吸取0.2mL菌懸液，對號放入已編好號的無菌培養(yǎng)皿中(每種菌做3個重復)，將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中(約10～15mL)，迅速輕輕搖勻，水平位置靜置30min，使培養(yǎng)基冷凝，制成帶菌平板，每個平板上放3個牛津杯(內徑6mm、外徑8mm、高10mm的不銹鋼杯)，每管加入貝肉酶解液0.2mL，以蒸餾水作為對照(CK)，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，用全自動菌落分析儀測其抑菌圈直徑。

1.3.5 水解度(degree of hydrolysis，DH)及平均肽鏈長度(peptide chain length，PCL)的測定

蛋白氮含量采用凱氏定氮法[3]；氨基氮含量采用甲醛滴定法[4]。

式中：N1為水解液中氨基氮含量；N2為原料中粗蛋白氮含量。

1.3.6 單因素試驗

1.3.6.1 料液比對抑菌圈直徑的影響

將貝肉在pH7.0、水浴溫度55℃條件下，調節(jié)不同的料液比(g/mL)，即3:1、3:2、3:3、3:4、3:5、3:6，以酶添加量為2.0%加酶后水解相同3h，測定各組水解液的抑菌圈直徑。

1.3.6.2 水解時間對抑菌圈直徑的影響

其他條件同1.3.6.1節(jié)，在料液比3:2條件下，調節(jié)不同的水解時間，即2、3、4、5、6、7 h處理貝肉，測定各組水解液的抑菌圈直徑。

1.3.6.3 酶添加量對抑菌圈直徑的影響

其他條件同1.3.6.1節(jié)，在料液比3:2條件下，調節(jié)不同的酶添加量，即1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、2.8%、3.2%的比例加酶后水解相同3h，測定各組水解液的抑菌圈直徑。

1.3.6.4 pH值對抑菌圈直徑的影響

其他條件同1.3.6.1節(jié)，在料液比3:2的條件下，調節(jié)不同的pH值，即pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5條件下保溫30min，加酶后將貝肉水解相同3h，測定各組水解液的抑菌圈直徑。

1.3.6.5 水解溫度對抑菌圈直徑的影響

其他條件同1.3.6.1節(jié)，在料液比3:2條件下，調節(jié)不同的水浴溫度，即40、45、50、55、60、65℃的水溫水解相同3h，測定各組水解液的抑菌圈直徑。

1.3.7 抗菌肽制備條件的優(yōu)化試驗

利用Matlab軟件以人工神經網絡工具箱進行編程，選用5個輸入神經元、隱含層含9個神經元和3個輸出神經元的人工神經網絡，進行試驗設計，優(yōu)化風味蛋白酶水解合浦珠母貝肉工藝。設定pH值、水解溫度、酶添加量、水解時間、料液比5個酶解工藝參數，并以貝肉水解液分別對鼠傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、單核細胞增生李斯特菌的抑菌圈效果作為評價指標，進行制備條件的優(yōu)化試驗。

1.3.8 數據處理

采用Matlab2009a和Microsoft Excel軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對抑菌圈直徑的影響

圖1 料液比對抑菌圈直徑的影響Fig.1 Effect of ratio of material to liquid on inhibitory zone diameters against three bacterial species

由圖1可見，料液比對產物的抑菌活性影響顯著，在料液比3:2～3:5范圍內，抑菌活性較強，當料液比為3:3時，水解液的抑菌活性最高，對鼠傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、單核細胞增生李斯特菌的抑菌圈直徑分別為11.03、14.32、12.89mm。說明水在一定程度上能疏松貝肉漿液的致密組織，增大酶與底物的接觸面積，對提取起到良好的效果，但水用量過高，底物濃度降低，對酶與底物的反應速度有較大影響，單位時間內貝肉抗菌肽的提取率隨之降低，因此應當選擇合適的料液比。

2.1.2 水解時間對抑菌圈直徑的影響

圖2 水解時間對抑菌圈直徑的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on inhibitory zone diameters against three bacterial species

由圖2可見，隨著水解時間的延長，產物的抑菌活性先增加后減少，在水解時間3～6h范圍內，產物對3種菌的抑菌活性較強。而水解時間大于6h，酶解產物進一步降解形成其他類型的短肽和氨基酸，就得不到具有抑菌特性肽，所以需要在3～6h水解時間中進一步篩選出最佳的的水解時間，既能節(jié)約能源，也能得到抑菌活性較高的貝肉抗菌肽提取物。

圖3 酶添加量對抑菌圈直徑的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on inhibitory zone diameters against three bacterial species

2.1.3 酶添加量對抑菌圈直徑的影響由圖3可見，酶添加量對產物的抑菌活性影響較顯著，當底物濃度不變，增加酶添加量，則催化反應速

度增大，單位時間所生成的產物增加，因此單位時間

內產物的抑菌活性增強，當酶添加量為1.6%～2.4%范圍內，得到的肽對鼠傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、單核細胞增生李斯特菌的抑菌效果最強，而酶的添加量大于2.4%后，產物的抑菌活性基本趨于穩(wěn)定。

2.1.4 pH值對抑菌圈直徑的影響

圖4 pH值對抑菌圈直徑的影響Fig.4 Effect of pH on inhibitory zone diameters against three bacterial species

由圖4可見，酶解過程pH值對產物的抑菌活性有影響，在pH6.5～8.0范圍內時，表現較強的抑菌活性。pH值對產物的抑菌活性的影響程度主要取決于其對風味蛋白酶酶活的影響程度，在pH6.5～8.0范圍內，風味蛋白酶的酶活最高，因此其酶解產物的抑菌活性也最強。

2.1.5 水解溫度對抑菌圈直徑的影響

由圖5可見，隨著水解溫度的增大，產物的抑菌活性先增加后降低，當溫度在45～60℃范圍內，表現較強的抑菌活性。當溫度在55℃，水解產物對鼠傷寒沙門氏菌、和單核細胞增生李斯特菌的抑制作用最強，抑菌圈直徑分別為11.89mm、12.98mm；當溫度在50℃時，水解產物對痢疾志賀氏菌的抑制作用最強，抑菌圈直徑為12.88mm。

圖5 水解溫度對抑菌圈直徑的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on inhibitory zone diameters against three bacterial species

2.2 抗菌肽制備條件優(yōu)化

2.2.1 人工神經網絡試驗結果分析與優(yōu)化

圖6 鼠傷寒沙門氏菌(A)、痢疾志賀氏菌(B)和單核細胞增生李斯特菌(C)的抑菌圈直徑的誤差Fig.6 Errors between ANN predictions and experimental results of inhibitory zone diameters against three bacterial species

根據單因素試驗的初步結果，利用Matlab軟件以人工神經網絡工具箱為依據，進行人工神經網絡設計，優(yōu)化風味蛋白酶水解合浦珠母貝肉工藝，各試驗組的編碼與取值見表1，人工神經網絡的訓練樣本為24個，采用快速反向傳播算法，設定目標訓練均方差為10-5，學習速率為0.03，完成訓練擬合步數＜500步，組成訓練集對人工神經網絡進行訓練，使之誤差達到滿意的程度。人工神經網絡的預測結果與試驗結果的比較見表2，產物的實際抑菌效果與人工神經網絡的預測抑菌效果的差異見網絡圖6。

表1 人工神經網絡學習樣本輸入與輸出Table 1 Input and output data for ANN training samples

表2 人工神經網絡的預測結果與實測結果比較Table 2 Comparasion between ANN predictions and experimental results

由表2及圖6可知，經過訓練的人工神經網絡具有較好的預測能力，預測結果與實際結果的誤差都在± 10%以內，說明該網絡擬合度良好，可用此網絡來優(yōu)化風味蛋白酶對合浦珠母貝肉的整個酶解過程。

經該人工神經網絡預測：當pH7.0、水解溫度55℃、酶添加量1.6%、水解時間4h、料液比7:5，酶解液(肽A)對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性最高，最大抑菌圈直徑為15.27mm；當pH7.0、水解溫度55℃、酶添加量1.7%、水解時間4h、料液比3:2，酶解液(肽B)對痢疾志賀氏菌的抑菌活性最高，最大抑菌圈直徑為23.53mm；當pH6.5、水解溫度60℃、酶添加量2.5%、水解時間4h、料液比7:5，酶解液(肽C)對單核細胞增生李斯特菌的抑菌活性最高，最大抑菌圈直徑為16.37mm。

2.2.2 驗證實驗

表3 最佳工藝條件下制備的抗菌肽抑菌性分析Table 3 Antimicrobial activities of three peptide products obtained under optimzed hydrolysis condiitons

按以上人工神經網絡所得預測值，即在最優(yōu)水解參數條件下進行3個平行試驗，結果見表3，實驗驗證肽A對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌圈直徑為14.20mm；肽B對痢疾志賀氏菌的抑菌圈直徑為23.42mm；肽C對單核細胞增生李斯特菌的抑菌圈直徑為16.60mm，試驗所得實際結果與人工神經網絡的預測結果的誤差均在±10%以內，證明人工神經網絡法具有較好的預測性，對風味蛋白酶酶解制備合浦珠母貝肉抗菌肽的工藝條件具有指導意義。

將利用人工神經網絡優(yōu)化貝肉酶解工藝得到的3種抗菌肽應用于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌試驗，結果見表3，3種抗菌肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有較強的抑菌效果，其抑菌率大小與其對鼠傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、單核細胞增生李斯特菌的抑菌率大小基本相似，為74.3%～80.8%。綜上可證明，合浦珠母貝肉抗菌肽具有抑菌活性高、抗菌廣等特點，同時，利用人工神經網絡優(yōu)化制備的貝肉抗菌肽克服了純度低、提取率低等缺點，為創(chuàng)造可觀的合浦珠母貝肉抗菌肽的開發(fā)奠定基礎。

3 討 論

抗菌肽類防腐劑由于其安全無毒害、甚至對人體有保健作用而受到人們的廣泛關注[7-8]?？咕某哂锌咕饔猛猓€具有抗病毒、抗腫瘤和抗癌活性，抗菌肽不易導致耐藥性，并且對生物體本身無害，符合人類食品安全的要求，因此使得抗菌肽的研究意義越來越重要[9-11]。在抗菌肽研究中，許多學者都用正交試驗優(yōu)化制備抗菌肽，宋宏霞等[12]用正交試驗優(yōu)化制備紫貽貝抗菌肽，金莉莉等[13]用正交試驗優(yōu)化制備林蛙皮抗菌肽，用正交試驗優(yōu)化制備的抗菌肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等致病菌的抑菌圈直徑都在10～15mm范圍內，抑菌性相對不明顯。本實驗應用人工神經網絡優(yōu)化制備抗菌肽，由于其推廣、概括能力較強，克服了正交試驗只能在已定的水平、一定的實驗范圍內優(yōu)化的缺陷，因此，可以大大提高實驗準確性。另外，人工神經網絡優(yōu)化法具有更高度的非線性和更強大的運算能力，能準確的運算和統(tǒng)計大量的數據，因此可以大大增加試驗結果的精確性[14-15]。

通過單因素試驗發(fā)現料液比和酶添加量對試驗結果影響顯著，而水解時間、pH值、水解溫度對試驗結果影響不顯著，說明酶與底物的充分接觸和酶濃度是整個酶解過程的關鍵參數。由于風味蛋白酶是粉末，直接與貝肉漿液混合達不到良好的酶解效果，而料水混合的過程是將貝肉漿液稀釋的過程，加酶后，酶很快溶于稀釋液中，增大了酶與底物的接觸面積，使酶與底物很好的結合，達到理想的酶解效果。另外，在酶促反應中，當底物濃度大大超過酶濃度，使酶被底物飽和時，反應速度與酶濃度成正比關系，酶濃度越高，反應速度越快，酶解效果越好，當酶底比達到最佳濃度時，酶解效果達到最佳，并隨酶濃度的增加而保持平衡。

在單因素試驗基礎上，應用人工神經網絡優(yōu)化制備合浦珠母貝肉抗菌肽，根據管碟抑菌法測定結果表明，其對鼠傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、單核細胞增生李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等細菌具有較強的抑菌效果，大腸桿菌的抑菌圈直徑20.9mm、對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑18.3mm，相比宋宏霞等[12]正交優(yōu)化后的紫貽貝抗菌肽對大腸桿菌的抑菌圈直徑9.8mm、對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑12.5mm，及王輝等[16]正交優(yōu)化后的牙鲆抗菌肽對大腸桿菌的抑菌圈直徑14mm、對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑12mm，本方法更高效，更精確，更經濟。

本研究利用人工神經網絡優(yōu)化得到風味蛋白酶水解合浦珠母貝肉制備抗菌肽的最佳工藝條件：pH7.0、水解溫度55℃、酶添加量1.6%、水解時間4h、料液比7:5，制備得到肽A，平均肽鏈長度為2.6，抑制鼠傷寒沙門氏菌能力最強；pH7.0、水解溫度55℃、酶添加量1.7%、水解時間4h、料液比3:2，制備得到肽B，平均肽鏈長度為2.8，抑制痢疾志賀氏菌能力最強；pH6.5、水解溫度60℃、酶添加量2.5%、水解時間4h、料液比7:5，制備得到肽C，平均肽鏈長度為2.5，對單核細胞增生李斯特菌的抑制效果最強。抑菌試驗證明3種抗菌肽對鼠傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、單核細胞增生李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等細菌均具有較強的抑菌效果，抑菌率為70.2%～83.9%，其中，肽B的抑菌活性最高，其對5種細菌的抑菌率達到75%以上，并且對痢疾志賀氏菌的抑制效果最強，抑菌率達到83.9%。該研究為合浦珠母貝肉抗菌肽的開發(fā)利用奠定基礎，并且為今后肽B的抗菌譜試驗、分離純化及結構分析等研究提供了可靠的依據。

[1]TORRECILLA J S, OTERO L, SANZ P D. A neural network approach for thermal/pressure food processing[J]. J Food Engineering, 2004, 62(1): 89-95.

[2]劉翠娟, 段琦梅, 安德榮. 抗真菌拮抗放線菌的篩選及搖床發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 微生物學雜志, 2004, 24(4): 12-14.

[3]GUEBEL D V, NUDEL B C, GIULIETTI A M. A simple and rapid micro-Kjeldahl method for total nitrogen analysis[J]. Biotechnology Techniques, 1991, 6(5): 427-430.

[4]PRABAKARAN G, HOTI S L. Influence of amino nitrogen in the culture medium enhances the production ofδ-endotoxin and biomass ofBacillus thuringiensisvar.israelensisfor the large-scale production of the mosquito control agent[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2008, 35(9): 961-965.

[5]NIELSEN P M, PETERSEN D, DARNBMANN C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis[J]. J Food Sci, 2001, 66(5): 642-646.

[6]ALDER-NISSEN J. Enzymic hydrolysis of food protein[M]. London: Elsevier Applied Science, 1986.

[7]趙紅艷, 慕玉. 抗菌肽在食品防腐劑中的研究應用[J]. 衛(wèi)生研究, 2009, 48(4): 502-504.

[8]布冠好, 李宏基, 楊國宇, 等. 抗菌肽的作用特點及應用前景[J]. 動物醫(yī)學進展, 2005, 26(3): 26-28.

[9]劉尊英, 董士遠, 曾名勇, 等. 海洋生物抗菌肽研究進展及其在生物防治中的應用前景[J]. 食品科學, 2007, 28(6): 367-370.

[10]JONES R W, PRUSKY D. Expression of an antifungal peptide in Saccharomyces: a new approach for biological control of the postharvest disease caused byColletotrichum coccodes[J]. Phytopathology, 2002, 92(1): 33-37.

[11]BROWN K L, HANCOCK R E W. Cationic host defense (antimicrobial) peptides[J]. Current Opinion in Immunology, 2006, 18(1): 24-30.

[12]宋宏霞, 曾名勇. 紫貽貝抗菌肽的研究[D]. 青島: 中國海洋大學, 2007.

[13]金莉莉, 丁忠福, 王秋雨. 中國林蛙皮抗菌肽提取條件的優(yōu)化研究[J]. 食品科學, 2008, 29(10): 223-227.

[14]王文杰, 葉世偉. 人工智能原理與應用[M]. 北京: 人民郵電出版社, 2004.

[15]許延發(fā), 張敏. 改進的BP算法在多目標識別中的應用[J]. 光學精密工程, 2003, 11(5): 513-515.

[16]王輝, 安利國, 楊桂文. 牙鲆不同組織抗菌肽的提取及部分性質檢測[J]. 水產科學, 2007, 26(2): 87-90.

Process Optimization for Preparation of Antimicrobial Peptides fromPinctada fucataMuscle by Flavourzyme Hydrolysis Using Artificial Production Neural Network

WU Yan-yan1，GONG Xiao-jing1,2，LI Lai-hao1，YANG Xian-qing1
(1. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, National Research and Development Center for Aquatic Product Processing, Guangzhou 510300, China；
2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

In this paper, artificial neural network (ANN), which can simulate an enzymatic hydrolysis process based on selflearning, was applied to study the optimum conditions for enzymatic preparation of antibacterial peptides fromPinctada fucatamuscle with flavourzyme. The hydrolysis ofPinctada fucatamuscle by flavourzyme was simulated and optimized using a threehierarchy ANN structure. The antimicrobial activity ofPinctada fucatamuscle hydrolysates was tested by cylinder-plate method. The results demonstrated that the peptide A was obtained after 4 h of hydrolysis under the conditions of pH 7.0, 55 ℃, 7:5 material/liquid ratio and 1.6% enzyme/substrate ratio, which showed the strongest antibacterial activity againstSalmonella typhimuriumwith an inhibition zone diameter of 14.20 mm and an average peptide chain length of 2.6. Four-hour hydrolysis under the conditions of pH 7.0, 55 ℃, 3:2 material/liquid ratio and 1.7% enzyme/substrate ratio generated the peptide B, which had the strongest antibacterial activity againstShigella dysenteriaewith an inhibition zone diameter of 23.42 mm and an average peptide chain length of 2.8. The peptide C was obtained under the conditions of pH 6.5, 60 ℃, 7:5 material/liquid ratio, 2.5% enzyme/ substrate ratio and 4 h hydrolysis, which displayed the strongest antibacterial activity againstL.monocytogeneswith an inhibition zone diameter of 16.60 mm and an average peptide chain length of 2.5. The three peptides also had strong antibacterial activity againstEscherichia coliandStaphyloccocus aureuswith an inhibitory rate ranged of 74.3%－80.8%. The applicationof ANN for optimizing antibacterial peptides preparation fromPinctada fucatamuscle overcomes many shortcomings such as low purity and low extraction efficiency and can therefore provide technical supports for the development and exploitation of antibacterial peptides derived fromPinctada fucatamuscle.

Pinctada fucatamuscle；antimicrobial peptides；production；artificial neural network optimization

2011-06-22

海南省重點科技項目(070121；ZDXM20100005)

吳燕燕(1969—)，女，研究員，博士，主要從事水產品加工與質量安全研究。E-mail：wuyy1028@yahoo.com.cn

TS254.1

A

1002-6630(2011)20-0063-06