陳 龍，李文峰，令 博，明 建,2,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

金耳、銀耳、木耳多酚提取及其抗氧化活性

陳 龍1，李文峰1，令 博1，明 建1,2,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

以金耳、銀耳、木耳為原料，分別用80%丙酮、80%甲醇、乙酸乙酯、石油醚對3種食用菌多酚類物質(zhì)進(jìn)行提取。通過高效液相色譜法和體外清除自由基方法(DPPH法、O2－·清除能力和·OH清除能力)，對3種食用菌多酚類物質(zhì)的主要組成及體外抗氧化能力進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明，80%丙酮提取效果最好，3種食用菌中槲皮素含量相當(dāng)，金耳和銀耳中蘆丁和表兒茶素含量較高，木耳中兒茶素和綠原酸含量較高；體外抗氧化結(jié)果顯示3種食用菌提取液具有較強的自由基清除能力和Fe3+還原能力，其中對DPPH·與O2－·的清除能力較強，對·OH的清除能力較弱。

金耳；銀耳；木耳；多酚；抗氧化

金耳(Tremella aurantialba)、銀耳(Tremella fucitormis)、木耳(Auricularia aurricula)在分類學(xué)上都隸屬于擔(dān)子菌綱銀耳目，其中金耳和銀耳屬銀耳科，木耳屬木耳科。研究顯示3種食用菌都富含蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維、維生素，鈣、磷、鐵、硒等微量元素和生物活性物質(zhì)[1-2]，是營養(yǎng)豐富、味道鮮美的滋補食品。傳統(tǒng)中藥和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明：金耳具有化痰止咳、定喘調(diào)氣、抗菌消炎的作用，能提高機(jī)體免疫力[3]；銀耳具有養(yǎng)胃生津、強心健腦、降血脂、防止動脈硬化、抑制腫瘤的功效[4]；木耳也具有活血潤燥、抗突變、降血壓等保健功能[5]。

隨著近幾年人們對食品質(zhì)量安全問題的日益重視，從天然植物資源中尋找高效的自由基清除劑已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，天然抗氧化劑取代合成類抗氧化劑已成為一種必然趨勢[6-7]。多酚類物質(zhì)作為一大類廣泛存在于植物體內(nèi)的復(fù)雜多元酚類化合物，具有較強的供氫和清除體內(nèi)有害自由基的作用，作為功能性食品添加劑可被廣泛用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域[8]。目前有關(guān)金耳、銀耳和木耳功能性成分的研究主要集中于多糖類物質(zhì)方面[9-11]，而有關(guān)食用菌酚類物質(zhì)及其抗氧化活性的研究報道還很少。本實驗擬用80%丙酮、80%甲醇、乙酸乙酯、石油醚四種溶劑分別對3種食用菌酚類物質(zhì)進(jìn)行提取，通過高效液相色譜法和體外清除自由基方法對其主要組成及抗氧化能力進(jìn)行研究，以便為金耳、銀耳、木耳的深層次開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金耳(Tremella aurantialba)：干制袋裝金耳，昆明食用菌研究所；銀耳(Tremella fucitormis)：干制250g袋裝銀耳，四川省通江縣巴山野生食品有限公司；木耳(Auricularia aurricula)：干制250g袋裝木耳，四川省通江縣巴山野生食品有限公司。

兒茶素、綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、蘆丁、槲皮素 上海融禾醫(yī)院科技有限公司；Folin-Ciocalteu試劑(F9252)、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司；甲醇(色譜級)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-A110型粉碎機(jī) 九陽股份有限公司；SPDM20A型高效液相色譜儀、UV-2450型紫外分光光度計日本島津公司；XHF-D型高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；VDRTEX-5型旋渦混合器 其林貝爾儀器制造有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司，RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 材料預(yù)處理

將干制的金耳、銀耳、木耳樣品分別用粉碎機(jī)打碎，過60目篩后密封儲存于陰涼干燥處備用。

1.3.2 食用菌多酚提取液的制備

參考Cheung等[12]方法，略有改動，準(zhǔn)確稱取3種食用菌各5.000g于250mL小燒杯中，分別以50mL 80%丙酮、80%甲醇、石油醚及乙酸乙酯為提取溶劑，用索氏抽提器不斷回流提取3h，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將提取液在45℃濃縮至約20mL，用25mL棕色容量瓶定容并儲存于－18℃以備后續(xù)測定。

1.3.3 總酚測定

1.3.3.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取25mg沒食子酸，加入到25mL去離子水中，得到1mg/mL 的沒食子酸溶液。吸取5mL 1mg/mL 的沒食子酸溶液，定容至50mL容量瓶中，即得0.1mg/mL的沒食子酸溶液，然后配成0、20、100、150、200、300、400、500、600μg/mL的沒食子酸標(biāo)液。取1mL各種濃度樣品于1.5mL離心管中，12000×g離心15min。取適量的試管，加200μL樣品，800μL去離子水，200 μL福林-酚試劑，讓樣品充分混合，避光保存6min，再加入2mL 7% Na2CO3溶液和1.6mL去離子水，黑暗中靜置90min，最后用可見分光光度計于760nm出測定吸光度。以酚類物質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，求得線性方程：A＝0.0036x－0.0459(R2＝0.996)。

圖1 沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

1.3.3.2 多酚含量測定

采用福林-酚比色法[13]。根據(jù)線性方程計算出3種食用菌提取液中總酚含量。

1.3.4 食用菌多酚的組成成分分析[14]

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)及樣品溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、蘆丁和槲皮苷各10.0mg，用甲醇溶解并分別定容在10mL棕色容量瓶中，配制成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。標(biāo)準(zhǔn)貯備液置于4℃冰箱中保存，使用時稀釋成所需要濃度。

樣品的制備：取提取好的食用菌多酚1mL，用有機(jī)膜過濾，甲醇定容至10mL，備用。

1.3.4.2 色譜條件

圖2 多酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of mixed polyphenol standards

色譜柱為Thermo C18柱(250mm×4.6mm，5μm)。流動相條件：A泵為色譜甲醇；B泵為0.05%磷酸溶液。采用梯度洗脫，洗脫程序為0～10min，B由5%增加到50%；10～11min，B為60%；11～15min，B為60%；15～16min，B為70%；16～19min，B為70%；19～20min，B為80%；20～25min，B為100%。柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL，流速1.0mL/min，檢測波長280nm。

1.3.5 食用菌多酚提取液抗氧化活性研究

1.3.5.1 樣品還原能力的測定[15]

準(zhǔn)確吸取1mL供試液于試管中，加入2.5mL 0.2mol/L pH6.6的PBS溶液、1mL 1%的鐵氰化鉀溶液混勻于50℃水浴20min后流水冷卻，加入5mL 10%的TCA溶液混勻靜置10min，最后加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1%的FeCl3溶液，混勻靜置10min，以蒸餾水為空白在700nm處測光密度，光密度越大說明樣品還原能力越強。

1.3.5.2 樣品對DPPH自由基清除率的測定[16-17]

精確量取48mL0.1mg/mL DPPH溶液并定容在100mL容量瓶中，所得DPPH濃度為2×10-4mo1/L，在0～4℃避光保存?zhèn)溆谩Ｈ?mL待測液及2mL DPPH溶液加入試管中，搖勻，避光放置30min，以溶劑為參比，于517nm測其吸光度Ac，并計算清除率。

清除率(G)/%＝[1－(Ai－Aj)/Ac]×100

式中：Ac為2mL溶劑加2mL DPPH溶液的吸光度；Ai為2mL待測液加2mL DPPH溶液的吸光度；Aj為2mL待測液加2mL溶劑的吸光度。

1.3.5.3 樣品對O2－· 清除率的測定[17]

向pH8.2、5.6mL 50mmol/L Tris-HCl 緩沖液中分別加入0.2mL不同濃度的實驗樣品提取液、BHT和VC溶液，于25℃保溫10min，然后加入0.2mL、25℃預(yù)溫的60mmol/L鄰苯三酚，靜置反應(yīng)4min后，加10mol/L鹽酸兩滴終止反應(yīng)，在320nm處測其吸光度A0，空白實驗以等量蒸餾水代替樣品溶液，測定其吸光度Ax。用5.6mL Tris-HCl緩沖液、0.2mL 0mmol/L HCl及0.2mL抗氧化劑溶液調(diào)零點，以扣除試樣本身顏色的影響。按下式計算清除率。

清除率(S)/%＝[(Ax－A0)/Ax]×100

式中：Ax為空白實驗，以等量蒸餾水代替抗氧化劑溶液測定的吸光度；A0為加入樣品以及其他各氧化劑溶液測定的吸光度。

1.3.5.4 樣品對·OH清除率的測定[17]

取6mmol/L的FeSO42mL于試管中，加入6mmol/L水楊酸2mL，再滴加6mmol/L H2O22mL，搖勻后在510nm波長處測定其吸光度Ax。在上述反應(yīng)體系中分別加入1mL樣品液，再加蒸餾水6mL，搖勻，放置6min，在510nm波長處測定其吸光度A0，用6mmol/L FeSO42mL和6mmol/L H2O22mL和蒸餾水2mL配成溶液調(diào)零點，以扣除試樣本身顏色的影響，并計算清除率。

清除率(S)/%＝[(Ax－A0)/Ax]×100

式中：Ax為空白對照吸光度；A0為加入受試物后吸光度。

1.3.5.5 數(shù)據(jù)處理

以上所有試驗均平行測定3次，試驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種食用菌提取液中酚類物質(zhì)的含量和組成測定

圖3 不同提取劑對3種食用菌多酚提取效果的影響Fig.3 Effect of solvents on polyphenol extraction from three edible mushrooms

2.1.1 食用菌提取液中總酚含量的測定多酚類物質(zhì)是發(fā)揮抗氧化作用的重要成分之一，試驗通過福林酚法測定了提取液中酚類物質(zhì)的含量，結(jié)果顯示，80%丙酮和甲醇兩種溶劑較石油醚和乙酸乙酯更適于金耳、銀耳、木耳3種食用菌中酚類物質(zhì)的提取，其中80%丙酮的提取效果最好。說明多酚類物質(zhì)是一種極性化合物，在極性有機(jī)溶劑中有較大的溶解性[18]。

2.1.2 食用菌提取液中多酚類物質(zhì)組成的測定

圖4 3種食用菌多酚的高效液相色譜測定Fig.4 Polyphenol contents of different solvent extracts from three edible mushrooms

如圖4所示，在選定的幾種酚類物質(zhì)標(biāo)樣中，3種食用菌酚類物質(zhì)主要以兒茶素、綠原酸、表兒茶素、蘆丁、槲皮素為主，不同溶劑提取液中酚類物質(zhì)的種類和含量略有不同。3種食用菌中槲皮素含量大致相當(dāng)，其中金耳和銀耳中蘆丁和表兒茶素含量較高，而木耳中含有較多的兒茶素和綠原酸， 整體來看80%甲醇對沒食子酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、蘆丁和槲皮素7種酚類物質(zhì)的提取效果略好于80%丙酮，但就總酚提取率的角度來講卻是80%丙酮更好，根據(jù)文獻(xiàn)[19-20]可知，多酚是一大類物質(zhì)的總稱，提取液中還可能含有除本試驗所選標(biāo)樣之外的其他酚類物質(zhì)，如香豆素、香草酸等，因此提取液中總酚含量與其多酚物質(zhì)組成之間并無直接的相關(guān)性。

2.2 提取液抗氧化活性的測定

2.2.1 提取液的還原力

通過還原力測定可以檢測樣品是否為良好的電子供體，還原力強的樣品能夠提供更多的電子，還原能力越強，抗氧化性越強。由圖5可知，食用菌提取液的還原力大小為80%丙酮＞80%甲醇＞石油醚＞乙酸乙酯?？傮w來看，木耳多酚提取液還原力最強，銀耳多酚提取液還原力最弱。

圖5 不同溶劑提取3種食用菌多酚的還原力Fig.5 Effect of solvents on polyphenol reducing power from three edible mushrooms

2.2.2 提取液對DPPH自由基的清除能力

圖6 3種食用菌多酚與VC、BHT、茶多酚清除DPPH自由基能力對比情況Fig.6 Comparison of DPPH radical scavenging capacity of differentsolvent extracts from three edible mushrooms, VC, BHT, and tea polyphenols

DPPH自由基在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，呈紫色，在517nm處有強吸收，當(dāng)有自由基清除劑存在時，DPPH自由基的游離電子被配對，使其顏色變淺，最大吸收波長處吸光度變小，且這種顏色的變化程度與配對電子數(shù)成化學(xué)計量關(guān)系，因此可通過測定最大吸收處吸光度的變化來評價自由基清除劑的清除能力。由圖6可知，3種食用菌多酚提取液均具有較好的DPPH自由基清除能力，其中金耳提取液的清除能力最強，木耳次之，銀耳最弱，與對照組相比，其DPPH自由基清除能力較VC與茶多酚弱，但遠(yuǎn)大于BHT的清除能力。根據(jù)賈貴東等[21]研究，不同溶劑多酚提取液中酚類物質(zhì)組成、含量及自由基清除能力均存在一定差異，所以食用菌多酚提取液DPPH自由基清除能力與其總酚濃度并不成正比。

2.2.3 提取液對O2－·的清除能力

在鄰苯三酚的自氧化過程中會有O2－·產(chǎn)生，此自由基既是鄰苯三酚氧化的中間產(chǎn)物，又能加速鄰苯三酚的自氧化進(jìn)程，因此通過測定待測物質(zhì)對鄰苯三酚自氧化的抑制作用，可以判定其對O2－·的清除能力。由圖7可知，3種食用菌多酚提取液對O2－·均具有較好的清除作用，其中金耳的清除能力最大，銀耳次之，木耳最小。

圖7 3種食用菌多酚與VC、BHT、茶多酚清除O—2·能力對比情況Fig.7 Comparison of superoxide anion radical scavenge capacity of different solvent extracts from three edible mushrooms, VC, BHT, and tea polyphenols

2.2.4 多酚對·OH的清除能力

圖8 3種食用菌多酚與VC、BHT、茶多酚清除·OH能力對比情況Fig.8 Comparison of hydroxyl radical scavenge capacity of different solvent extracts from three edible mushrooms, VC, BHT, and tea polyphenols

根據(jù)Fronton反應(yīng)原理生成的·OH進(jìn)攻水楊酸分子的苯環(huán)，產(chǎn)生2,3-二羥基苯甲酸，通過分光光度法測定其含量，以此來衡量待測物質(zhì)清除·OH的能力。由圖8可知，3種食用菌對·OH的清除能力均較弱，80%甲醇提取液清除能力略大于80%丙酮，其中木耳提取液對·OH清除能力較強，金耳與銀耳相當(dāng)，與陽性對照樣品相比3種食用菌的清除能力均較弱，這可能與·O H的清除機(jī)制有關(guān)。

3 結(jié) 論

3.1 在80%丙酮、80%甲醇、石油醚和乙酸乙酯4種溶劑中，80%丙酮和80%甲醇兩種溶劑較石油醚和乙酸乙酯更適于金耳、銀耳、木耳3種食用菌酚類物質(zhì)的提取，其中以80%丙酮溶液提取效果最佳。

3.2 通過液相色譜分析可知，3種食用菌中主要含有兒茶素、綠原酸、表兒茶素、蘆丁、槲皮素5種酚類物質(zhì)，不同溶劑所得提取液中的酚類物質(zhì)的種類和含量略有不同。金耳和銀耳中含有較多的蘆丁和表兒茶素，兒茶素和綠原酸含量較少。木耳中含有較高的兒茶素和綠原酸，且3種食用菌中槲皮素的含量相當(dāng)。

3.3 金耳、銀耳、木耳3種食用菌酚類物質(zhì)提取液中，木耳多酚提取液還原力最強，金耳次之，銀耳最弱，三者對DPPH自由基、O2－·、·OH均具有較好的清除能力，其中對DPPH自由基與O2－·的清除能力較強，對·OH的清除能力較弱。與3種陽性對照樣品相比它們的自由基清除能力普遍低于VC和茶多酚，但高于BHT，這可能與BHT為脂溶性抗氧化劑有關(guān)。金耳、銀耳、木耳3種食用菌多酚提取液均具有較好的抗氧化能力。

[1]周玲. 藥食兩宜金耳與膳食[J]. 食用菌, 2002, 24(5): 38.

[2]周才瓊, 周玉林. 食品營養(yǎng)學(xué)[M]. 北京: 中國計量出版社, 2006, 343.

[3]徐錦堂. 中國藥用真菌學(xué)[M]. 北京: 北京醫(yī)科大學(xué)與中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社, 1997: 436-447.

[4]楊萍, 張震. 銀耳的功能性及發(fā)展前景[J]. 食品研究與開發(fā), 2009, 30(7): 179-180.

[5]谷絨, 萬國福, 車振明. 木耳多糖的研究進(jìn)展[J]. 食品研究與開發(fā), 2006, 27(6): 167-169.

[6]SUN Jian, YAO Jinyan, HUANG Shaoxi, et al. Antioxidant activity of polyphenol and anthocyanin extracts from fruits ofKadsura coccinea(Lem.) A.C. Smith[J]. Food Chemistry, 2009, 117(2): 276-281.

[7]許鋼. 紅薯中黃酮提取及抗氧化研究[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2007, 26(4): 22-27.

[8]郭新竹, 寧正祥. 天然酚類化合物及其保健作用[J]. 食品工業(yè), 2002 (3): 28-29.

[9]高觀世, 侯波, 吳素蕊, 等. 金耳多糖化學(xué)與生物活性研究進(jìn)展及對研究的思考[J]. 中國食用菌, 2007, 26(4): 8-10.

[10]鄧云霞, 瞿偉菁. 金耳胞外多糖體外抗氧化作用研究[J]. 食用菌學(xué)報, 2007, 14(3): 47-49.

[11]李雪華, 龍盛京. 木耳多糖的提取與抗活性氧的研究[J]. 食品科學(xué), 2001, 22(3): 26-29.

[12]CHEUNG L M, CHEUNG P C K, OOI V E C. Antioxidant activity and total phenolics of edible mushroom extracts[J]. Food Chemistry, 2003, 81(2): 249-255.

[13]李巨秀, 李利霞, 曾王旻, 等. 燕麥多酚化合物提取工藝及抗氧化活性的研究[J]. 中國食品學(xué)報, 2010, 10(5): 14-21.

[14]BARROS L, DUE?AS M, FERREIRA I C F R, et al. Phenolic acids determination by HPLC-DAD-ESI/MS in sixteen different Portuguese wild mushrooms species[J]. Food and Chemical Toxicology, 2009, 47 (6): 1076-1079.

[15]JAYAPRAKASHA G K, SINGH R P, SAKARIAH K K. Antioxidant activity of grape seed (Vitis vinifera) extracts on peroxidation modelsin vitro[J]. Food Chemistry, 2001, 73(3): 285-290.

[16]牛鵬飛, 仇農(nóng)學(xué), 杜寅. 蘋果渣中不同極性多酚的分離及體外抗氧化活性研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2008, 4(3): 238-242.

[17]徐銀峰, 于春光, 王斌, 等. 海帶抗氧化多酚的制備及活性研究[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2010, 29(1): 44-48.

[18]陳根洪. 藤茶總多酚的提取及其抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(6): 127-130.

[19]張梅梅, 鄭維發(fā), 趙艷霞, 等. 正交實驗法優(yōu)化樺褐孔菌多酚類物質(zhì)的提取工藝研究[J]. 菌物學(xué)報, 2010, 29(5): 760-766.

[20]沈恒勝, 陳君琛, 湯葆莎, 等. 栽培料纖維轉(zhuǎn)化與食用菌酚類抗氧化營養(yǎng)的關(guān)系[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2007, 22(4): 337-340.

[21]賈貴東, 楊建雄, 王莉. 蘆丁與綠原酸協(xié)同抗氧化活性研究[J]. 陜西師范大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2010, 38(5): 37-38.

Extraction and Antioxidant Activity of Polyphenols fromTremella aurantialba,Tremella fucitormisandAuricularia aurricula

CHEN Long1，LI Wen-feng1，LING Bo1，MING Jian1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；
2. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400715, China)

The polyphenols inTremella aurantialba,Tremella fucitormisandAuricularia aurriculawere extracted with 80% acetone, 80% methanol, ethyl acetate and petroleum ether, respectively, and their major components and antioxidant activity were determined using high performance liquid chromatography (HPLC) andin vitroDPPH, hydroxyl and superoxide anion radical scavenging assays, respectively. The results revealed that 80% acetone showed the highest extraction efficiency of ployphenols.Tremella aurantialba,Tremella fucitormisandAuricularia aurriculahad similar quercetin content. The contents of rutin and epicatechin were higher inTremella aurantialbaandTremella fucitormisthan those inAuricularia aurricula.Auricularia aurriculacontained relatively more chlorogenic acid. All investigated extracts from the three edible mushroom species had a strong ability to scavenge free radicals, especially DPPH and superoxide anion radicals and reduce Fe3+.

Tremella aurantialba；Tremella fucitormis；Auricularia aurricula；polyphenol；antioxidant activity

TS201.2

A

1002-6630(2011)20-0052-05

2011-06-23

重慶市科技攻關(guān)項目(CSTC 2011AC1010)；西南大學(xué)博士基金項目(SWU109005)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項(XDJK2009C044)

陳龍(1988—)，男，碩士研究生，研究方向為食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)。E-mail：chanloong2007@163.com

*通信作者：明建(1972—)，男，副教授，博士，研究方向為食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)。E-mail：mingjian1972@163.com