楊宏偉，陳小燕，張 影，王友升*，李麗萍

(北京工商大學食品學院 北京市食品風味化學重點實驗室，食品添加劑與配料北京高等學校工程研究中心，北京 100048)

油桃采后衰老與病害發(fā)生中品質(zhì)與活性氧代謝相關(guān)性分析

楊宏偉，陳小燕，張 影，王友升*，李麗萍

(北京工商大學食品學院 北京市食品風味化學重點實驗室，食品添加劑與配料北京高等學校工程研究中心，北京 100048)

探討油桃果實在采后衰老與病害發(fā)生中近果核和近表皮處的品質(zhì)與活性氧代謝的相關(guān)性。結(jié)果顯示油桃采后衰老與病害發(fā)生中膜完整性、過氧化物酶(p er o x id as e，P O D)活性呈下降趨勢，岀汁率、脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)活性、H2O2含量呈升高趨勢，過氧化氫酶(catalase，CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)比活力呈先升高后下降的趨勢。偏最小二乘回歸分析結(jié)果表明：膜完整性與岀汁率、H2O2、LOX呈負相關(guān)，與POD、APX呈正相關(guān)。通徑分析得出APX、POD、PPO對H2O2含量變化有強的負直接作用，其作用由強到弱為APX＞POD＞LOX。為進一步探討相關(guān)酶在采后油桃果實抵抗病原菌侵染過程中所起的作用提供理論依據(jù)。

油桃；衰老；病害；主成分分析；偏最小二乘回歸；通徑分析

油桃屬于呼吸躍變型果實，采后極易遭受病原菌的侵害而腐爛變質(zhì)，嚴重影響油桃的貯運與銷售[1]。當遭遇病原菌侵害時，果蔬體內(nèi)的氧化還原體系的平衡被打破，隨即產(chǎn)生大量的活性氧，過量活性氧的產(chǎn)生會使果蔬體內(nèi)代謝失調(diào)。褐腐病菌(Monilinia fructicola)是導致核果類果實采后病害的重要病原菌[2]，但對油桃采后抵制褐腐菌侵害的研究未見相關(guān)報道。有研究表明黃瓜果實不同部位的脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)活性[3]、溫州蜜柑果實不同部位活性氧含量[4]、蘋果不同部位的H2O2含量[5]及芒果果實不同部位的抗氧化能力[6]有所不同，但對于油桃果實采后衰老和病害發(fā)生過程中不同部位活性氧代謝的變化研究國內(nèi)未見報道。

利用不同統(tǒng)計方法解析果實品質(zhì)與特征指標的關(guān)系，國內(nèi)外已有相關(guān)報道。Wang等[7]利用單因素方差分析法(one-way ANOVA)研究甜櫻桃果實與羅倫隱球酵母、褐腐病菌不同溫度下的互作效應。陳小燕等[8]運用主成分分析法(principal component analysis，PCA)分析了1-MCP對桃果實低溫貯藏期間揮發(fā)性物質(zhì)的影響。Zheng等[9]利用偏最小二乘法回歸(partial least squares regression，PLSR)預測了巴氏菠蘿汁貯藏期間抗壞血酸、總酚和抗氧化能力的保留指數(shù)。滕建文等[10]運用通徑分析(path coefficient analysis)解析了菠蘿濃縮汁非酶褐變的原因。目前，未見關(guān)于比較多變量分析的不同方法解析果實采后品質(zhì)變化與活性氧代謝相關(guān)性的研究。本研究綜合運用不同分析方法研究油桃果實采后衰老與褐腐病害發(fā)生中近表皮和近果核的品質(zhì)及活性氧代謝相關(guān)酶的變化規(guī)律及其相關(guān)性，為進一步探討相關(guān)酶在采后油桃果實抵抗病原菌侵染過程中所起的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油桃品種為“麗春”，果實購買于北京市增光路美廉美水果市場上，挑選無病蟲害、成熟度一致、大小均一的果實為試驗材料，當天運至實驗室；實驗采用病原菌為桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)，將病原菌在相應寄主激活后，接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，在28℃培養(yǎng)7～14d后待用。

丙酮、磷酸緩沖液(磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉)、硫酸鈦、濃氨水、抗壞血酸、過氧化氫、硫酸、亞麻油酸鈉、鄰苯二酚溶液、愈創(chuàng)木酚溶液、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、水楊酸、無水乙醇均為分析純 北京北化精細化學品有限責任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Eppendorf 5810R型離心機、UV-2450型分光光度計、TP120電導率儀。

1.3 方法

1.3.1 材料處理

設(shè)計兩組處理：衰老組，不接種病原菌；病害組，接種褐腐菌。每個果實接菌量為30μL，菌懸液透光度(T)相對于培養(yǎng)液均為75%。所有處理均置于25℃，相對濕度95%條件貯藏。每隔2d，病害組果實在距離病害發(fā)病部位5mol/L處取樣，衰老組在相對應的位置分別取樣，測定過氧化物酶(peroxidase，POD)、脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)比活力和H2O2含量，直到大部分油桃果實腐爛時(貯藏6d)停止取樣。

1.3.2 膜完整性和出汁率的測定

膜完整性測定：參考Wang等[11]方法，從10個果實中分別取直徑10mol/L，厚度3mol/L的果肉圓片，置于布氏漏斗上，用去離子水沖洗傷口表面后，吸干，置于30mL去離子水中，3h后測定電導率(C1)，隨后將果肉在95℃煮沸15min并冷卻至室溫，測定電導率(C0)。

出汁率測定：參考王貴禧等[12]的方法，分別從10個果實取直徑10mol/L，厚度3mol/L的果肉圓片，裝入墊有吸水紙的離心管中，3000r/min離心多長時間，以果肉圓片離心后的質(zhì)量損失率作為出汁率。

式中：m0為離心前果肉的質(zhì)量；m1為離心后果肉的質(zhì)量。

1.3.3 活性氧及相關(guān)酶的測定

用取樣器在果實感染部位或傷口外大約2mm處的近果核處和近表皮處分別取樣，置于提取液中，冰浴均質(zhì)，4℃、10000r/min離心60min，取上清液立即測定。其中，H2O2含量的提取液為丙酮；LOX、CAT、APX、POD和PPO的提取液為磷酸緩沖液(100mol/L，pH7.8)＋0.25g PVPP。

H2O2含量測定參照Brennan等[13]的方法；CAT比活力測定參照Wan g等[7]的方法；APX比活力測定按Nakano等[14]的方法；LOX、POD和PPO的比活力測定參照Wang等[15]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，鄧肯氏多重差異比較或t檢驗，當P＜0.05時，表示差異顯著。采用Unscrambler X 10.1統(tǒng)計分析軟件進行主成分分析和偏最小二乘回歸分析，采用DPS(v.8.01)軟件進行通徑分析。數(shù)據(jù)在進行各個分析前均先做標準化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對各指標影響的顯著性分析

由表1可知，油桃果實膜完整性近表皮處顯著高于近果核處，貯藏前4d膜完整性隨時間延長而顯著下降，近表皮處較近果核處下降顯著，病害組較衰老組下降顯著；果實岀汁率貯藏前2d顯著上升，4d時衰老組變化不顯著，而病害組繼續(xù)顯著上升，前4d近表皮處均較近果核處上升顯著；果實H2O2含量近表皮處2d時均顯著上升，4d時變化不顯著，近果核處，病害組前4 d顯著上升，衰老組2d無顯著變化，4d時顯著上升；果實CAT比活力前4d均為先上升后下降，近表皮處較近果核處上升和下降變化更為顯著，且近表皮處病害組較衰老組變化顯著；果實APX比活力2d時均顯著上升，4d時均顯著下降，4d時病害組較衰老組下降更為顯著；果實POD比活力近果核處顯著高于近表皮處，衰老組前4d均顯著下降，病害組2d時均顯著下降，4d時近表皮處有升高趨勢但變化不顯著、近果核處繼續(xù)顯著下降；果實PPO比活力近果核處顯著高于近表皮處，衰老組前4d均有上升趨勢但變化不顯著；而病害組2d時顯著上升，4d時顯著下降，且近表皮處較近果核處上升和下降變化顯著；果實LOX比活力前2d均無顯著變化，4d時均顯著上升，且近果核處病害組較衰老組上升顯著。

由以上分析可知，油桃果實PPO、CAT、膜完整性、岀汁率在近表皮處較近果核處的升高和下降的變化更為顯著。病害的發(fā)生增大了CAT上升和下降的變化幅度，加速了APX、膜完整性的下降，誘導了岀汁率含量、近果核處LOX 、PPO和POD比活力的升高。

2.2 主成分分析

通過主成分分析得到前3個主成分(PC1、PC2、PC3)的累計貢獻率為83%，因此設(shè)定這3個主成分即能夠代表整體數(shù)據(jù)的信息特征。圖1是各個理化指標在不同貯藏時間、不同處理下的載荷和得分散點的PCA雙標圖。油桃果實不同處理的樣本按照貯藏時間在PCA雙標圖上被分成了4組，同一貯藏時間的不同處理的樣本集中在一起，不同貯藏時間的樣本分散在不同區(qū)域，這表明油桃果實理化特性與活性氧代謝相關(guān)酶活受貯藏時間的影響顯著。

圖1A中的PC1、PC2分別解釋了變量的38%、27%。H2O2和岀汁率在PC1的負坐標處有較高的載荷，POD和膜完整性在PC1的正坐標處有較高的載荷。APX、LOX分別在PC2的正坐標和負坐標處有較高的載荷。由于H2O2、岀汁率、POD和膜完整性在PC1的高載荷量，PC1較好地區(qū)分了0d和4d時的樣本差異。由于APX和LOX在PC2的高載荷量，PC2較好地區(qū)分了4d和6d時的樣本差異。此外，POD和膜完整性區(qū)分了0d時近果核處和近表皮處的差異，H2O2、岀汁率和LOX區(qū)分了4d時的不同處理間的差異。POD靠近0d近果核處，膜完整性靠近0d近表皮處，說明POD的含量在0d時近果核處高于近表皮處，膜完整性在0d時近表皮處高于近果核處。圖1B中的PC3解釋了變量的18%，CAT和PPO在PC3上有較高的載荷，其較好地區(qū)分了2d時不同處理間的差異。CAT、PPO在2d時靠近病害組、遠離對照組，尤其是近表皮處，說明病害的發(fā)生加速了CAT、PPO比活力的升高，其中近表皮處更為顯著。

表1 油桃果實貯藏期間理化指標與活性氧代謝相關(guān)酶的變化Table 1 Changes of quality and enzyme activities related to active oxygen species metabolism in nectarine during postharvest storage

圖1 油桃果實主成分的因子載荷和得分雙標圖Fig.1 PCA biplots of factor loadings and scores for nectarine

2.3 偏最小二乘回歸分析

圖2 基于主成分1與主成分2的PLSR回歸模型的相關(guān)載荷圖Fig.2 Correlation loading plot based on PLSR models for principal components 1 and 2

由主成分分析得到膜完整性和H2O2為各生理生化指標的關(guān)鍵指標，為了分析其他指標對膜完整性和H2O2的影響，本實驗選取膜完整性、H2O2含量為Y變量，其他指標為X變量，建立PLSR模型，通過交叉驗證法(cross-validation)得到顯著性變量[16](圖2)。由圖2可知，該模型中62%的X變量解釋了60%的Y變量。其中，H2O2含量與出汁率呈顯著正相關(guān)，與膜完整性、POD呈顯著負相關(guān)，由此可見H2O2在果實體內(nèi)的變化主要受POD影響，并由品質(zhì)指標岀汁率和膜完整性體現(xiàn)出來。膜完整性與岀汁率、H2O2、LOX負相關(guān)性顯著，與POD、APX呈正相關(guān)，說明膜完整性的變化主要受H2O2和LOX影響，并由岀汁率體現(xiàn)出來。PPO與CAT靠近原點，與過氧化氫含量和膜完整性有微弱的相關(guān)性。

2.4 通徑分析

由于H2O2為活性氧代謝的中心組分，也是聯(lián)系果實的品質(zhì)指標(岀汁率、膜完整性)和活性氧代謝相關(guān)酶(CAT、APX、POD、PPO、LOX)的橋梁，因而以H2O2為因變量(y)、其他指標為自變量(x)進行通徑分析，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，APX、POD、LOX對H2O2有顯著的負直接作用，PPO對H2O2有顯著的正直接作用。膜完整性、PPO都通過APX對H2O2有較大的負間接作用，CAT、POD、LOX都通過APX對H2O2有較大的正間接作用。膜完整性通過POD對H2O2有較大的負間接作用，岀汁率、APX都通過POD對H2O2有較大的正間接作用。各個因變量及他們之間的相互作用對H2O2的相關(guān)系數(shù)R為0.879150，決定系數(shù)R2為0.772904?？梢姡@些因變量對H2O2具有很強的決定作用。

表2 以H2O2 為因變量的通徑分析結(jié)果Table 2 Path analysis results using H2O2 content as dependent variable

3 討 論

本實驗結(jié)果表明，雖然主成分分析法得出了各理化指標間的關(guān)鍵指標為H2O2、膜完整性、POD、岀汁率，但沒能很好的反應出各指標間的相關(guān)性。而偏最小二乘分析顯示品質(zhì)指標膜完整性與岀汁率、LOX負相關(guān)性顯著，與POD、APX呈正相關(guān)。膜完整性變化時，岀汁率、LOX、POD和APX的變化趨勢在單因素方差分析中有體現(xiàn)，均與以上分析一致。Maalekuu等[17]證實辣椒果實體內(nèi)的LOX可引起膜質(zhì)的過氧化；Azevedo等[18]研究也表明木瓜果實在采后成熟過程中伴隨著果實的軟化，膜完整性急劇下降。

已有研究表明，接種褐腐菌的桃果實CAT、POD活性升高[19]。而甜櫻桃褐腐病的發(fā)生受到抑制的主要原因是褐腐病菌刺激拮抗菌的生長并誘導果實ROS代謝相關(guān)酶活性升高[7]。偏最小二乘分析結(jié)果表明H2O2與膜完整性、POD呈顯著負相關(guān)，與岀汁率呈顯著正相關(guān)。通徑分析印證了這一點，其結(jié)果顯示膜完整性對H2O2有負間接作用(間接通徑系數(shù)為－0.2898)，POD有負直接作用(直接通徑系數(shù)為-1.0452)，岀汁率有正間接作用(間接通徑系數(shù)為0.8248)。H2O2變化時，膜完整性、POD和岀汁率的變化趨勢在單因素方差分析中有體現(xiàn)，均與以上分析一致。

研究表明，果蔬衰老和遭遇病原菌侵害時都會伴隨著活性氧的大量增加[20]。APX、POD、CAT是關(guān)鍵的清除活性氧的酶類抗氧化劑[21]。而偏最小二乘分析只得出PPO和CAT與過氧化氫含量有微弱的相關(guān)性。通徑分析則能得出PPO對H2O2有正直接作用(直接通徑系數(shù)為0.2337)，CAT對H2O2有正間接作用(間接通徑系數(shù)為0.1189)，APX(直接通徑系數(shù)為－1.1102)、LOX(直接通徑系數(shù)為－0.7381)對H2O2有顯著的負直接作用，并通過各指標間的互作對其有一定的間接作用。但由于通徑分析中，本實驗選取的因變量對H2O2的總決定系數(shù)為0.772904；偏最小二乘回歸分析中，只有62%的X變量解釋了Y變量，且只被解釋了60%。這些都說明還有影響自變量的因素未列入分析中，比如超氧化物歧化酶(SOD)等對H2O2的影響，超氧陰離子自由基、羥自由基、單線態(tài)氧等其他活性氧對膜完整性的影響，有待進一步研究。

[1] 馮立娟, 苑兆和, 尹燕雷, 等. 白肉甜油桃‘北極星’貯藏過程中果實品質(zhì)的變化研究[J]. 山東林業(yè)科技, 2009, 39(1): 14-16.

[2] ZHOU Ting, SCHNEIDER K E, LI Xiuzhen. Development of biocontrol agents from food microbial isolates for controlling post-harvestpeach brown rot caused byMonilinia fructicola[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 126(1/2): 180-185.

[3] 趙宇瑛, 楊靜, 陳金鳳, 等. 黃瓜果實不同部位的耐冷性差異[J]. 園藝學報, 2009, 36(7): 1060-1064.

[4] 鄒英寧, 魯蕾. 溫州蜜柑果實不同部位抗氧化性能的比較[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學, 2010, 38(10): 169-170.

[5] LU Shengming, SONG Jun, CAMPBELL-PALMERL. A modified chemiluminescence method for hydrogen peroxide determination in applefruit tissues[J]. Scientia Horticulturae, 2009, 120(3): 336-341.

[6] BAKAR M F A, MOHANMED M, RAHMAT A, et al. Phytochemicals and antioxidant activityof different parts of bambangan(Mangifera pajang)and tarap (Artocarpus odoratissimus)[J]. Food Chemistry, 2009, 113(2): 479-483.

[7] WANG Yousheng, TIAN Shiping. Interaction betweenCryptococus laurentii,Monilinia fructicolaand sweet cherry fruit at differenttemperatures[J]. Agricultural Sciences in China, 2008, 7(1): 48-57.

[8] 陳小燕, 王友升, 李麗萍, 等. 1-MCP對桃果實低溫貯藏期間揮發(fā)性物質(zhì)的影響: 主成分分析法[J]. 北京工商大學學報, 2010, 28(3): 48-54.

[9] ZHENG Hong, LU Hongfei. Use of kinetic, Weibull and PLSR models to predict the retention of ascorbic acid, total phenols and antioxidantactivity during storage of pasteurized pineapple juice[J]. LWTFood Science and Technology, 2011, 44(5): 1273-1281.

[10] 滕建文, 李欣, 夏寧, 等. 貯藏過程中菠蘿濃縮汁非酶褐變原因解析[J]. 食品科學, 2008, 29(12): 701-704.

[11] WANG Yousheng, TIAN Shiping, XU Yong. Effects of high oxygen concentration on pro- and anti-oxidant enzymes in peach fruits during postharvest periods[J]. Food Chemistry, 2005, 91(1): 99-104.

[12] 王貴禧, 王友升, 梁麗松. 不同貯藏溫度模式下大久保桃果實冷害及其品質(zhì)劣變研究[J]. 林業(yè)科學研究, 2005, 18(2): 114-119.

[13] BRENNAN T, FRENKEL C. Involvement of hydrogen peroxide in the regulation of senescence in pear[J]. Plant Physiology, 1977, 59(3): 411-416.

[14] NAKANO Y, ASADA K. Purification of ascorbate peroxidase in spinach chloroplasts, its inactivation in ascorbate-depleted medium and reactivation by monodehydroascorbate radical[J]. Plant Cell Physiology, 1987,28(1): 131-134.

[15] WANG Yousheng, TIAN Shiping, XU Yong, et al. Changes in the activities of pro- and anti-oxidant enzymes in peach fruit inoculated withCryptococcus laurentiior Penicillium expansumat 0 or 20℃[J].Postharvest Biology and Technology, 2004, 34(1): 21-28.

[16] SHETTY N, GISLUMR. Quantification of fructan concentration in grasses using NIR spectroscopyand PLSR[J]. Field Crops Research, 2011, 120(1): 31-37.

[17] MAALEKUUK, ELKIND Y, LEIKIN-FRENKEL A, et al. The relationship between water loss, lipid content, membrane integrity and LOX activity in ripe pepper fruit after storage[J]. Postharvest Biology and Technology, 2006, 42(3): 248-255.

[18] AZEVEDO I G, OLIVEIRA J G, da SILVA M G, et al. P-type H+-ATPases activity, membrane integrity, and apoplastic pH during papaya fruit ripening[J]. Postharvest Biology and Technology, 2008, 48(2):242-247.

[19] XU Xiangbin, QIN Guozheng, TIAN Shiping. Effect of microbial biocontrol agents on alleviating oxidative damage of peach fruit subjected to fungal pathogen[J]. International Journal of Food Microbiology,2008, 126(1/2): 153-158.

[20] KAN Juan, WANG Hongmei, JIN Changhai. Changes of reactive oxygen species and related enzymes in mitochondrial respiration during storage of harvested peach fruits[J]. Agricultural Sciences in China, 2011,10(1): 149-158.

[21] GILL S S, TUTEJA N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2010, 48(12): 909-930.

Analysis of the Relationship between Quality and Active Oxygen Species Metabolism in Nectarine during Postharvest Ripening and Pathogenesis

YANG Hong-wei，CHEN Xiao-yan，ZHANG Ying，WANG You-sheng*，LI Li-ping
(Beijing Key Laboratory of Food Flavour Chemistry, Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

The relationship between fruit quality and active oxygen species metabolism near the epidermis and core of nectarine during postharvest ripening and pathogensis caused by artificial infection withMonilinia fructicolawas analyzed. The results indicated that membrane integrity and peroxidase (POD) activities declined, juice rate, lipoxygenase (LOX) activities and H2O2 content increased, while the activities of catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX) and polyphenol oxidase(PPO)increased firstly and then decreased during postharvest ripening and pathogenesis. Partial least squares regression (PLSR)results identified that membrane integrity was significantly negatively correlated with juice rate, H2O2 content or LOX activity but significantly positively correlated with POD activity or APX activity. Pathway coefficient analysis results showed that the activities of APX, POD, LOX and PPO had a negative effect on the content of H2O2, and the order of the effects was APX＞POD＞LOX.

nectarine；senescence；diseases；principal component analysis；partial least squares regression；path coefficient analysis

TS201

A

1002-6630(2011)20-0244-05

2011-06-14

北京市屬高等學校人才強教計劃資助項目(PHR20110882)；國家自然科學基金青年項目(30901009)

楊宏偉(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：yanghongwei200620190@126.com

*通信作者：王友升(1976—)，男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：wangys@th.btbu.edu.cn