魏偉群，沈 娟，唐楚穎，陸 豫，余 勃,*

(1.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330031；2.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心，江蘇 南京 210036；3.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，南昌市生物化工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

益生酪酸菌的固態(tài)培養(yǎng)

魏偉群1，沈 娟2，唐楚穎1，陸 豫3，余 勃3,*

(1.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330031；2.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心，江蘇 南京 210036；3.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，南昌市生物化工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

以活菌數(shù)為考察指標(biāo)，研究酪酸菌在3種不同固態(tài)基質(zhì)(豆粕、麩皮、玉米粉)中的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示：豆粕作為基質(zhì)時(shí)酪酸菌生長(zhǎng)最佳，最高活菌數(shù)可達(dá)47×106CFU/g，麩皮次之，達(dá)39×106CFU/g，玉米粉最差，僅為34×106CFU/g。在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)酪酸菌固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。首先通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)對(duì)酪酸菌培養(yǎng)基成分進(jìn)行篩選，從10個(gè)因素中篩選到了4個(gè)主要影響因素，即硫酸銨、麥芽糖、硫酸鎂和含水量。然后采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出硫酸銨、麥芽糖、硫酸鎂的添加量分別為1.5%、0.8%、0.02%，含水量為55%時(shí)培養(yǎng)效果最佳，酪酸菌活菌數(shù)最高可達(dá)到約76×106CFU/g。同樣采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響酪酸菌固體發(fā)酵的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24h、溫度30℃、接種量14mL/100g時(shí)，酪酸菌培養(yǎng)效果最佳，活菌數(shù)達(dá)到約11×107CFU/g。

酪酸菌；固態(tài)發(fā)酵；響應(yīng)面法

益生菌(probiotics)是指改善宿主微生態(tài)平衡而發(fā)揮有益作用，達(dá)到提高宿主健康水平和健康狀態(tài)的活菌制劑及其代謝產(chǎn)物[1]。動(dòng)物和人體內(nèi)有益的微生物主要有：乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌等[2]。其中，作為益生菌的一種，酪酸菌在臨床和保健方面的顯著功效使其成為益生菌研究中的熱點(diǎn)之一。

酪酸菌又名丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，是一種厭氧的革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，廣泛存在于人和動(dòng)物體的腸道中，能有效抑制腸道致病菌的繁殖[3]，調(diào)整腸道微生態(tài)平衡，同時(shí)也減少氨類(lèi)、胺類(lèi)等有害物質(zhì)的產(chǎn)生。此外酪酸菌還具有增強(qiáng)免疫、預(yù)防腫瘤發(fā)生、產(chǎn)生人體必需維生素等重要功能[4-6]，其在臨床、保健、和營(yíng)養(yǎng)食品方面的應(yīng)用都已非常廣泛。

雖然目前對(duì)酪酸菌在作用機(jī)制、培養(yǎng)條件和應(yīng)用等方面的研究已非常廣泛，但常規(guī)培養(yǎng)用的幾乎都是液體培養(yǎng)法[7]。而與液態(tài)培養(yǎng)相比較，固態(tài)培養(yǎng)具有成本低、設(shè)備投資少、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[8-10]。而在本實(shí)驗(yàn)中，液體培養(yǎng)其生長(zhǎng)量總是很低，由于腸道菌所生存的環(huán)境本身為固態(tài)或半固態(tài)環(huán)境，固態(tài)環(huán)境和液態(tài)環(huán)境下培養(yǎng)的微生物有許多生物學(xué)特性是不同的，因此更有必要對(duì)酪酸菌的固態(tài)培養(yǎng)進(jìn)行研究。

鑒于上述原因，本實(shí)驗(yàn)擬利用價(jià)格低廉的農(nóng)副產(chǎn)品為原料，研究酪酸菌固態(tài)培養(yǎng)的工藝條件。首先對(duì)固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選和優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上，對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，采用響應(yīng)面分析的方法對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在找出酪酸菌固態(tài)培養(yǎng)最佳的工藝參數(shù)，建立一種酪酸菌的固態(tài)培養(yǎng)方法[11-15]。這種方法的建立，將更加有利于酪酸菌的大規(guī)模培養(yǎng)、保藏和運(yùn)輸，還能顯著降低酪酸菌制劑的制備成本，為酪酸菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)和大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

菌種：酪酸菌(Clostridium butylicum，CICC 20036)，購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

酪酸菌液體種子培養(yǎng)基：各物質(zhì)按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)為胰蛋白胨2%、牛肉膏1%、酵母膏0.6%、葡萄糖0.4%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.04%、氯化鈣0.02%。固體發(fā)酵培養(yǎng)基：固體基質(zhì)豆粕60%，含水量40%，各生長(zhǎng)限制因素按試驗(yàn)設(shè)計(jì)溶解在水里添加到固體培養(yǎng)基中。

1.2 方法

1.2.1 酪酸菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)

從酪酸菌斜面中挑取一環(huán)接種于種子培養(yǎng)液中，靜置培養(yǎng)48h后接種到含固體培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度35℃，培養(yǎng)時(shí)間24h。按體積分?jǐn)?shù)5%接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，35℃靜置培養(yǎng)。以上操作均在無(wú)菌操作條件下進(jìn)行。

1.2.2 活菌數(shù)測(cè)定

固體發(fā)酵培養(yǎng)基中活菌數(shù)測(cè)定：取發(fā)酵好的固體培養(yǎng)基5g，加入裝有100mL無(wú)菌水的錐形瓶?jī)?nèi)，150r/min洗脫30min，洗脫后過(guò)濾制備得菌懸液，取30mL離心得菌體細(xì)胞，再加入無(wú)菌水振蕩均勻最后定容到10mL，于620nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值，換算成活菌數(shù)[16]。本實(shí)驗(yàn)條件下最終活菌數(shù)計(jì)算公式為：y=135.54×106x－9.91×106，其中，y為平均每克豆粕上測(cè)定活菌數(shù)/(CFU/g)，x為測(cè)得OD值。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 酪酸菌固態(tài)培養(yǎng)的生長(zhǎng)限制因素篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為考察酪酸菌生長(zhǎng)限制因素對(duì)酪酸菌固體培養(yǎng)的影響，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)眾多因素進(jìn)行研究，選取的各因素(變量)見(jiàn)表1。本階段試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及模型建立皆由JMP軟件(version 4.0.5，SAS Institute Inc.)輔助完成。

表1 培養(yǎng)基Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Factors, levels and their codes in Plackett-Burman design for optimizing fermentation medium

1.3.2 酪酸菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于第一階段試驗(yàn)結(jié)果，該階段采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，對(duì)酪酸菌固態(tài)培養(yǎng)的重要生長(zhǎng)限制因素進(jìn)行研究和探索，以獲得最佳培養(yǎng)基組成。實(shí)驗(yàn)輔助軟件為Design Expert (version 6.0.5, Stat-Ease Inc., Minneapolis, M N.USA)。同時(shí)通過(guò)這一軟件對(duì)回歸方程的解析以及響應(yīng)曲面的分析獲得最佳變量水平，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 培養(yǎng)基Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 2 Factors, levels and their codes in Box-Behnken design for optimizing fermentation medium

1.3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)得到的結(jié)果，結(jié)合相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，采用Box-Behnken試驗(yàn)對(duì)影響酪酸菌固態(tài)發(fā)酵的幾個(gè)重要因素(發(fā)酵時(shí)間、溫度、接種量)進(jìn)行研究和探索，旨在得到最佳工藝參數(shù)，實(shí)驗(yàn)輔助軟件為Design Expert (version 6.0.5, Stat-Ease Inc., Minneapolis, M N . U S A)。各個(gè)因素和水平見(jiàn)表3。

表3 發(fā)酵條件Box-Behnken試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)及編碼Table 3 Factors, levels and their codes in Box-Behnken design for optimizing fermentation conditions

2 結(jié)果與分析

2.1 酪酸菌固態(tài)培養(yǎng)的生長(zhǎng)限制因素Plackett-Burman篩選試驗(yàn)

利用JMP軟件對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果(表4)進(jìn)行方差分析，得出各因素的t值和可信度水平。選擇可信度大于95%以上的因素作為重要因素。

表4 培養(yǎng)基Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及其預(yù)測(cè)值Table 4 Actual and predicted values of viable cell number in Plackett-Burman design for optimizing fermentation medium

從t檢驗(yàn)結(jié)果可知，硫酸銨對(duì)酪酸菌生長(zhǎng)影響最顯著(P＝0.0099)，麥芽糖(P＝0.0138)，葡萄糖(P＝0.0170)，硫酸鎂(P＝0.0395)，硫酸亞鐵(P＝0.0148)和含水量(P＝0.0402)在95%的概率水平上差異顯著，而其他因素則在95%的概率水平上差異均不顯著。硫酸銨、葡萄糖、麥芽糖、硫酸鎂和含水量都是正影響，硫酸亞鐵是負(fù)影響。

酪酸菌是異養(yǎng)型微生物，它們需要糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、礦物元素等。培養(yǎng)基的組成和配比是否恰當(dāng)直接影響酪酸菌的生長(zhǎng)繁殖。

在培養(yǎng)基組成中，發(fā)酵基質(zhì)豆粕能提供充足的氮源，但由于其大分子質(zhì)量不能迅速被酪酸菌利用，而無(wú)機(jī)氮源硫酸銨作為一種速效蛋白能很好的被酪酸菌利用，保證酪酸菌前期的生長(zhǎng)，在碳源選擇上，葡萄糖和蔗糖也都能被酪酸菌利用，蔗糖的影響效果要更顯著，無(wú)機(jī)鹽鎂離子和起始含水量對(duì)酪酸菌的生長(zhǎng)也起著重要作用。本著節(jié)約成本的考慮，因此，在下一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，將重點(diǎn)考察硫酸銨、麥芽糖、硫酸鎂的濃度和含水量范圍。

2.2 酪酸菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化

在對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果分析的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)酪酸菌固態(tài)培養(yǎng)基中的重要生長(zhǎng)限制因素進(jìn)行了29組試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 培養(yǎng)基Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Actual and predicted values of viable cell number in Box-Behnken design for optimizing fermentation medium

通過(guò)Design Expert軟件對(duì)表5實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得酪酸菌活菌數(shù)(y)對(duì)自變量(x1硫酸銨、x2麥芽糖、x3硫酸鎂和x4含水量)的二次多項(xiàng)回歸方程：

該方程的方差分析表明該模型極顯著(P＜0.0001)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.7079＞0.1)。預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性(R2=0.9610)，該模型校正系數(shù)(R2Adj= 0.9220)表明模型與實(shí)際情況擬合較好。

經(jīng)過(guò)上述優(yōu)化后，得到酪酸菌固態(tài)培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基組成為：硫酸銨1.5%、麥芽糖0.8%、硫酸鎂0.02%、含水量55%，為驗(yàn)證模型(1)的準(zhǔn)確性，采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行3批培養(yǎng)發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到結(jié)果分別為76.7×106、75.49×106、75.68×106CFU/g，平均值為75.96×106CFU/g，與預(yù)測(cè)值75.99×106CFU/g相差0.4%，再次證明了實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間的高度相關(guān)性，也說(shuō)明此預(yù)測(cè)模型在本實(shí)驗(yàn)的研究范圍之內(nèi)是有效的、合理的。同優(yōu)化前的預(yù)實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵工藝相比，酪酸菌活菌數(shù)提高了391.33%，說(shuō)明采用Box-Behnken法確實(shí)達(dá)到了優(yōu)化的效果。

2.3 酪酸菌固態(tài)發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化

采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響酪酸菌生長(zhǎng)的工藝條件關(guān)鍵因素進(jìn)行了17組試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 發(fā)酵條件Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Actual and predicted values of viable cell number in Box-Behnken design for optimizing fermentation conditions

通過(guò)Design Expert軟件對(duì)表6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得酪酸菌固態(tài)培養(yǎng)活菌數(shù)(y)對(duì)自變量(x1發(fā)酵時(shí)間、x2發(fā)酵溫度、x3接種量)的二次多項(xiàng)回歸方程：

y＝8.09－0.22x1－0.14x2－0.19x3＋1.45x12＋0.74x22－0.84x32＋0.10x1x2＋0.17x2x3(2)

該方程的方差分析表明，該二次多項(xiàng)式模型極顯著(P＜0.0001)，失擬項(xiàng)不顯著(P＝0.6953＞0.1)，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性(R2=0.9831)。其校正決定系數(shù)(R2Adj=0.9614)表明此模型擬合較好。

經(jīng)過(guò)上述優(yōu)化后得出酪酸菌固態(tài)培養(yǎng)的最佳條件為發(fā)酵時(shí)間24h、溫度30℃、接種量14mL/100g時(shí)，酪酸菌活菌數(shù)達(dá)到最大值10.78×107CFU/g。為了驗(yàn)證這一模型預(yù)測(cè)的可靠性，對(duì)此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，3批此條件下發(fā)酵培養(yǎng)的酪酸菌活菌數(shù)分別為：10.79×107、10.68×107、10.96×107CFU/g，平均值為10.81×107CFU/g。實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值相差1%，再次證明了實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間的高度相關(guān)性，也說(shuō)明此預(yù)測(cè)模型在本實(shí)驗(yàn)的研究范圍之內(nèi)是有效的、合理的。

3 結(jié) 論

在微生物發(fā)酵優(yōu)化研究中，響應(yīng)曲面法已被廣泛應(yīng)用，并被證明是一種良好的優(yōu)化方法[17]。本研究通過(guò)響應(yīng)曲面法對(duì)影響酪酸菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成和工藝條件進(jìn)行了研究，得出了其最佳培養(yǎng)基為：以豆粕為基質(zhì)，硫酸銨、麥芽糖、硫酸鎂的添加量分別為1.5%、0.8%、0.02%，含水量范圍55%；最佳發(fā)酵條件為：時(shí)間24h、溫度30℃、接種量14mL/100g。在此條件下，酪酸菌的生長(zhǎng)效果最好，活菌數(shù)可達(dá)10.81×107CFU/g。該研究思路和優(yōu)化方法將為酪酸菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)和大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供有益參考。

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Solid-state Cultivation of Clostridium butyricum

WEI Wei-qun1，SHEN Juan2，TANG Chu-ying1，LU Yu3，YU Bo3,*
(1. College of Environmental and Chemical Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China；
2. Jiangsu Center for Inspection and Testing for Quality of Agricultural Products, Nanjing 210036, China；
3. Institute of Sino-German Joint Research, Nanchang Key Laboratory of Biochemical Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Response surface methodology (RSM) was used to explore medium composition and solid-state fermentation conditions for Clostridium butyricum. The amount of viable cells was used as the evaluation index. Four factors including (NH4)2SO4, MgSO4, maltose and water content as the major affecting factors of medium composition were screened from 10 factors by Plackett-Burman design. The results showed that the maximum number of viable cells of Clostridium butyricum could reach up to 76× 106CFU/g when the medium was composed of 1.5% (NH4)2SO4, 0.02% MgSO4, 0.8% maltose and 55% water content. Similarly, the fermentation conditions of Clostridium butyricum were optimized by Box-Behnken design combined with RSM. Fermentation time of 24 h, fermentation temperature of 30 ℃ and inoculation amount of 14 mL/100 g were optimum. Under these conditions, the maximum number of viable cells could reach up to 11×107CFU/g.

Clostridium butyricum；solid-state fermentation；response surface methodology

Q939.97

A

1002-6630(2011)07-0251-04

2010-09-20

魏偉群(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘?。E-mail：qunweiwei@163.com

*通信作者：余勃(1978—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。E-mail：yubo131@yahoo.com.cn