謝麗源，譚 偉，郭 勇，賈定洪，彭衛(wèi)紅，甘炳成*

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川 成都 610066)

響應(yīng)面法優(yōu)化桑黃產(chǎn)胞內(nèi)多糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基

謝麗源，譚 偉，郭 勇，賈定洪，彭衛(wèi)紅，甘炳成*

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川 成都 610066)

利用響應(yīng)面分析法對桑黃菌絲體生物量及產(chǎn)胞內(nèi)多糖的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，研究碳源、氮源、無機(jī)鹽對桑黃菌絲生物量、胞內(nèi)多糖含量及產(chǎn)量的影響。在單因素篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Benhnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法對碳源、氮源和無機(jī)鹽水平進(jìn)行分析。結(jié)果表明，桑黃產(chǎn)胞內(nèi)多糖的液體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組合為：玉米粉3.9%、麩皮2.2%、KH2PO4 0.20%、MgSO4 0.10%，在此條件下的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量可達(dá)233.107mg/L。

桑黃；液體發(fā)酵；培養(yǎng)基；胞內(nèi)多糖；響應(yīng)面分析法

桑黃是擔(dān)子菌亞門(B asid iomy cota)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)、針層孔菌屬(Phellinus)的真菌，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、消炎、增強(qiáng)免疫等藥理活性[1]。由于受自身生理狀態(tài)的特殊性和復(fù)雜性以及外部環(huán)境的制約，桑黃在自然界中形成子實(shí)體稀少，而且形成可用子實(shí)體需要多年，因此，通過野生環(huán)境獲得桑黃子實(shí)體已不能滿足需要。桑黃人工栽培技術(shù)開始應(yīng)運(yùn)而生，但是目前我國桑黃栽培的技術(shù)還不是很成熟，加之桑黃培養(yǎng)條件較為苛刻，生長周期長，這些因素使桑黃的開發(fā)和利用受到限制，使得桑黃難以成為穩(wěn)定的工業(yè)產(chǎn)品來源[2]。因此，尋求人工培育的方法，研究以大量易得的菌絲體形式代替子實(shí)體已成為當(dāng)務(wù)之急，采用液體發(fā)酵培養(yǎng)獲得大量桑黃菌絲體或活性物質(zhì)具有重要的意義[3]。

響應(yīng)面分析法(RSM)是建立一個(gè)包括各因素的一次項(xiàng)、平方項(xiàng)和任何兩個(gè)因素之間的一級交互作用項(xiàng)的數(shù)學(xué)模型，近年來日益受到重視[4-8]。該方法能對影響生物產(chǎn)量的因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評價(jià)，從而快速確定最佳生產(chǎn)條件。在微生物發(fā)酵方面已有廣泛應(yīng)用，但在大型真菌發(fā)酵方面的應(yīng)用不多[9-15]。本實(shí)驗(yàn)以菌絲體生物量和胞內(nèi)多糖含量為響應(yīng)值，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，為大規(guī)模利用這一珍稀大型真菌資源提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑

桑黃(Phellinus baumii)菌種由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究中心保藏。

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g，pH值自然，蒸餾水1L；液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖30g/L、蛋白胨20g/L、KH2PO43g/L、MgSO4·7H2O 1g/L，pH值自然；發(fā)酵優(yōu)化用培養(yǎng)基：碳源篩選用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(各成分均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))：各種碳源3%、蛋白胨2%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.1%，pH值自然；氮源篩選用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(各成分均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))：優(yōu)選碳源3%、各種氮源2%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.1%，pH值自然。

葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖、甘露醇、糊精、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素、谷氨酸、硝酸銨、檸檬酸銨均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-250-Ⅱ生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱、DZF-6020真空干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司； SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、W201B恒溫水浴鍋 上海申勝生物技術(shù)有限公司；ALC-Z10.3電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；GLI66-Ⅱ高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠； ZXZ旋片式真空泵 浙江黃巖求精真空泵廠；超純水裝置 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 菌絲平板培養(yǎng)

將滅過菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中制成平板，在無菌條件下，每平板中心接入1塊直徑5mm的活化菌種塊，于28℃培養(yǎng)10d。

1.3.2 種子培養(yǎng)基制備

用打孔器從平板中打取6塊直徑5mm的活化菌種塊，接入液體種子培養(yǎng)基中，于120r/min、25℃培養(yǎng)7d。

1.3.3 碳源篩選

以碳源篩選培養(yǎng)基為培養(yǎng)基質(zhì)，分別以葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、玉米粉、麥芽糖、乳糖、甘露醇、糊精、土豆為碳源，接種10%液體種子培養(yǎng)基，500mL三角瓶中裝液量為100mL，培養(yǎng)溫度26℃，搖床轉(zhuǎn)速120r/min，培養(yǎng)7d，測定菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖含量。

1.3.4 氮源篩選

以氮源篩選培養(yǎng)基為培養(yǎng)基質(zhì)，分別以蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素、谷氨酸、麩皮、硝酸銨、檸檬酸銨為氮源，接種10%液體種子培養(yǎng)基，500mL三角瓶裝液量為100mL，培養(yǎng)溫度26℃，搖床轉(zhuǎn)速120r/min，培養(yǎng)7d，測定菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖含量。

1.3.5 最適碳源、氮源及無機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇

分別對不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳源、氮源、K H2PO4、MgSO4·7H2O對菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖含量的影響進(jìn)行研究，分別篩選出最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并由此確定響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化范圍。

1.3.6 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基

在單因素篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析，以菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖含量為響應(yīng)值，研究各因素對菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖含量影響的顯著性和各組分的最佳組合。

1.3.7 指標(biāo)測定方法

菌絲體干質(zhì)量測定：液體發(fā)酵液離心，取沉淀，蒸餾水洗滌，置65℃真空干燥至質(zhì)量恒定，稱質(zhì)量。

胞內(nèi)多糖含量測定：收集烘干菌絲體，粉碎，以料水比1:30(m/V)，于90℃熱水中浸提4h，離心，將獲得上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用3倍體積的95%乙醇沉淀過夜，離心，收集沉淀，于65℃烘箱烘干至質(zhì)量恒定，稱其質(zhì)量。

胞內(nèi)多糖產(chǎn)量＝胞內(nèi)多糖含量×菌絲體干質(zhì)量

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

利用Design-Expert 7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行多元二次回歸模型方程的建立及方差分析，再利用該軟件中響應(yīng)值優(yōu)化程序求得當(dāng)響應(yīng)面值最大時(shí)的培養(yǎng)基各成分的最優(yōu)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基最適碳源的選擇

圖1 不同碳源對桑黃菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖含量和產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of carbon source type on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production

藥用真菌可以利用多種碳水化合物，但對其利用程度有差異。由圖1可知，不同碳源對桑黃菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖含量和產(chǎn)量均有較大的影響，不同碳源的培養(yǎng)基中菌絲體生物量由大到小依次為：玉米粉＞土豆＞葡萄糖＞糊精＞乳糖＞蔗糖＞麥芽糖＞可溶性淀粉＞甘露醇；胞內(nèi)多糖含量從大到小依次為糊精＞可溶性淀粉＞甘露醇＞葡萄糖＞玉米粉＞土豆＞蔗糖＞麥芽糖＞乳糖；雖然玉米粉為碳源的胞內(nèi)多糖含量稍低，但是由于生物量遠(yuǎn)高于其他碳源，因此從收集的目的產(chǎn)物胞內(nèi)多糖產(chǎn)量看，以玉米粉為碳源的胞內(nèi)多糖產(chǎn)量高于其他碳源，因此，選擇玉米粉作為桑黃發(fā)酵產(chǎn)胞內(nèi)多糖的碳源。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基最適氮源的選擇

圖2 不同氮源對桑黃菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖含量和產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of nitrogen source type on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production

氮源是真菌合成蛋白質(zhì)、核酸的必要原料。由圖2可看出，不同氮源對桑黃菌絲體及胞內(nèi)多糖含量和產(chǎn)量均有明顯差異，在以酵母粉為氮源的培養(yǎng)基中菌絲體生物量最大，從胞內(nèi)多糖含量考慮，蛋白胨優(yōu)于其他氮源，從胞內(nèi)多糖產(chǎn)量角度分析，酵母粉為氮源時(shí)的胞內(nèi)多糖產(chǎn)量最大，為206.865mg/L，稍高于麩皮204.493mg/L，但從生產(chǎn)實(shí)際考慮，麩皮價(jià)格低廉，容易獲得，因此選擇麩皮作為桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

2.3 碳源、氮源及無機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇

2.3.1 碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇

圖3 碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)對桑黃菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖含量和產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of carbon source concentration on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production

由圖3可知，當(dāng)碳源即玉米粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，其菌絲體生物量、胞內(nèi)多糖含量及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量均大于其他碳源，因此，確定碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。

2.3.2 氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇

圖4 氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)對桑黃菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖含量和產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of nitrogen source concentration on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production

由圖4可知，當(dāng)?shù)醇贷熎べ|(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)菌絲體生物量最大，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)胞內(nèi)多糖含量略大于2%，綜合以上結(jié)果可知當(dāng)麩皮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)桑黃菌絲體胞內(nèi)多糖產(chǎn)量最大，由此確定氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。

2.3.3 KH2PO4和MgSO4·7H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇

圖5 KH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對桑黃菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖含量和產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of KH2PO4 concentration on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production

圖6 MgSO4·7H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)對桑黃菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖含量和產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of MgSO4·7H2O concentration on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production

由圖5、6可知，當(dāng)KH2PO4和MgSO4·7H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.2%和0.1%時(shí)可獲得最大的胞內(nèi)多糖產(chǎn)量，由此確定KH2PO4和MgSO4·7H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.2%和0.1%。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基組成

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇玉米粉、麩皮、KH2PO4、MgSO4·7H2O 4個(gè)因素所確定的水平范圍，用Design-Expert 7.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理，以桑黃菌絲體生物量和胞內(nèi)多糖含量為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平，共27個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析，因素水平見表1。試驗(yàn)以隨機(jī)次序進(jìn)行，結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface analysis

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)Box-Benhnken設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design arrangement and experimental results

2.4.2 回歸模型建立及方差分析

經(jīng)Design-expert7.0軟件對表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，建立二次多項(xiàng)式回歸模型。

以菌絲體生物量為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程為：

以胞內(nèi)多糖含量為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程為：

表3 桑黃菌絲體生物量回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model for mycelium biomass

表4 桑黃菌絲體胞內(nèi)多糖含量回歸模型方差分析表Table 4 Variance analysis of regression model for intracellular polysaccharide production

由表3、4方差分析可知，以菌絲體生物量和胞內(nèi)多糖含量為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程的回歸效果均為顯著，P值均＜0.0001；模型的失擬項(xiàng)表示模型預(yù)測值與實(shí)際值不擬合的概率，表3、4中模型失擬項(xiàng)的P值分別為0.0945、0.1896均大于0.05，表明兩模型的模型失擬項(xiàng)均不顯著，說明這兩個(gè)模型建立的回歸方程能運(yùn)用于桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的理論預(yù)測。

2.4.3 桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)基最適組合

通過軟件分析，預(yù)測出最佳培養(yǎng)基水平編碼值，即A=－0.027、B=0.178、C=0.051、D=0.095，相當(dāng)于玉米粉為3.97%、麩皮為2.18%、KH2PO4為0.21%、MgSO4·7H2O為0.10%，在此條件下理論預(yù)測桑黃菌絲體生物量為14.2587g/L，胞內(nèi)多糖含量為16.6395mg/g，由此可知，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為237.2576mg/L?？紤]到實(shí)際操作的方便，將各因子修正為：玉米粉為3.9%、麩皮為2.2%、KH2PO4為0.20%、MgSO4·7H2O為0.10%，在修正條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到桑黃菌絲體生物量和胞內(nèi)多糖含量分別為14.1366g/L、16.4896mg/g，由此得到胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為233.107mg/L。

3 討論與結(jié)論

桑黃菌絲致密、有韌性，菌皮較厚，不易挑取，當(dāng)接種至液體種子培養(yǎng)基時(shí)，菌絲不易分散，容易形成較大的菌球而不分散成小菌球，致使深層培養(yǎng)接種較為困難，因此，為了確保接種條件的均衡性，形成大小較均勻一致的菌球，要還當(dāng)控制接種條件，使之培養(yǎng)的菌球分散均勻。

在碳、氮源篩選實(shí)驗(yàn)中，天然成分玉米粉作為碳源可明顯促進(jìn)桑黃菌絲生長；無機(jī)氮不能有效促進(jìn)桑黃菌絲生長和胞內(nèi)多糖的積累，而有機(jī)氮的使用，如酵母粉、蛋白胨和牛肉膏能明顯促進(jìn)桑黃菌絲生長，麩皮作為一種天然成分對桑黃菌絲生長也有促進(jìn)作用，其促進(jìn)效果與有機(jī)氮源相當(dāng)；作為碳源和氮源的玉米粉、麩皮價(jià)格低廉，也比較易得，非常適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。但是，玉米粉和麩皮的用量要控制好，否則在制作培養(yǎng)基時(shí)過濾比較麻煩。

采用響應(yīng)面法優(yōu)化桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方，分別擬合以菌絲體生物量與胞內(nèi)多糖為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程，其結(jié)果表明桑黃在低氮源、高碳源組合時(shí)，即當(dāng)玉米粉為3.9%、麩皮為2.2%、KH2PO4為0.20%、MgSO4· 7H2O為0.10%時(shí)，桑黃菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖含量和產(chǎn)量均為較理想，說明用響應(yīng)面法尋求同時(shí)獲得最佳菌絲體生物量和胞內(nèi)多糖含量的方法是切實(shí)可行的。

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Application of Response Surface Methodology for Optimization of Liquid Fermentation Medium for Intracellular Polysaccharide Production by Phellinus baumii

XIE Li-yuan，TAN Wei， GUO Yong，JIA Ding-hong，PENG Wei-hong，GAN Bing-cheng* (Institute of Soil and Fertilizer, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China)

The objective of the present study was the optimization of liquid fermentation medium for producing intracellular polysaccharide by Phellinus baumii by response surface methodology. The effects of carbon source, nitrogen source, and metal ions on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production were explored in single factor experiments, and corn flour and wheat bran were found to be the best carbon source and nitrogen source, respectively. Based on this, the optimum levels of corn flour, wheat bran, KH2PO4 and MgSO4 were determined by Box-Benhnken design combined with response surface analysis to be 3.9%, 2.2%, 0.20% and 0.10%, respectively. The intracellular polysaccharide production in optimized medium reached 233.107 mg/L.

Phellinus baumii；liquid-state fermentation；culture medium；intracellular polysaccharide；response surface methodology

TQ920.1

A

1002-6630(2011)07-0224-05

2010-06-08

四川省青年基金項(xiàng)目(2008ZQ026-072)；四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008FZ0157)

謝麗源(1977－)，女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：xieliyuan77@163.com

*通信作者：甘炳成(1968－)，男，研究員，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锛稗r(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：bgan918@sohu.com