許 亮，師俊玲,*，陳東方，王振平

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.寧夏大學(xué) 葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心，寧夏 銀川 750021)

枸杞果酒中總黃酮含量的發(fā)酵條件優(yōu)化

許 亮1，師俊玲1,*，陳東方1，王振平2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.寧夏大學(xué) 葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心，寧夏 銀川 750021)

以寧夏枸杞為原料，通過Box-Behnken試驗設(shè)計研究發(fā)酵溫度、糖添加量、酵母添加量及pH值對發(fā)酵后枸杞果酒中總黃酮含量的影響，建立各影響因素的回歸方程，并通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化出成品酒中總黃酮含量的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度21.9℃、酵母添加量0.29g/L、糖添加量107.0g/L、pH4.3，此條件下的預(yù)測值為0.2404g/L，實測值為(0.2337±0.0043)g/L，表明所得模型有很好的預(yù)測性。

寧夏枸杞；果酒；發(fā)酵；總黃酮；響應(yīng)面；優(yōu)化

枸杞(Lycium barbarum)是中國重要的藥食兩用植物之一[1-2]。中國有7個枸杞品種，主要分布在寧夏、新疆、內(nèi)蒙古、青海、山西和河北等地，其中以寧夏枸杞(Lycium barbarum L.)最為有名。枸杞果實除了具有水果的基本營養(yǎng)成分以外，還含有總黃酮類化合物、多糖等生物活性物質(zhì)[3]。枸杞總黃酮具有清除自由基、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫、防治血管硬化、降血糖等功能[4-7]。枸杞酒是枸杞的傳統(tǒng)食用方式之一。枸杞酒的加工方法主要有浸泡法和發(fā)酵法兩種。浸泡法是將枸杞用高度酒進行浸泡，所得枸杞酒的營養(yǎng)物質(zhì)少，酒度高，適用人群少；發(fā)酵法是通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)果酒，能夠更多地保留枸杞果實中的營養(yǎng)成分，酒精體積分?jǐn)?shù)較低，適用人群廣[8-9]。不適宜的加工條件會導(dǎo)致原料中活性成分含量降低或失去活性。目前有關(guān)枸杞果酒發(fā)酵過程的研究都側(cè)重于提高產(chǎn)品風(fēng)味和感官特性[10-11]，而針對提高酒中活性成分含量的發(fā)酵過程優(yōu)化的研究尚未見報道。果酒中活性物質(zhì)的最終含量不僅與原料品質(zhì)有關(guān)，而且與該物質(zhì)在果酒體系里溶解度、發(fā)酵周期和發(fā)酵條件等因素有關(guān)，不適宜的加工過程和過長的發(fā)酵時間都會導(dǎo)致物質(zhì)的活性或含量降低。

通過控制最適的發(fā)酵過程和發(fā)酵周期來提高成品酒中總黃酮含量，對于提高枸杞酒的營養(yǎng)與保健功能具有重要意義。根據(jù)果酒的發(fā)酵特點和主要的影響因素，本研究重點考察發(fā)酵溫度、糖添加量、酵母添加量和料液pH值對發(fā)酵后果酒中總黃酮含量的影響規(guī)律，通過單因素試驗和Box-Behenken試驗，結(jié)合響應(yīng)面分析方法(RSM)對能夠提高成品酒中總黃酮含量的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，進而得出使枸杞果酒中含有最大量總黃酮的發(fā)酵條件，為進一步提高枸杞果酒營養(yǎng)價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞 寧夏中寧天寶商貿(mào)有限公司(含水量10.7%，使用前在冷庫中密閉保存，用時拿出)。

酵母Excellence SP 法國Lamothe-Abiet公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所；NaHSO3、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；電子恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；ZSD-1160培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；MST-303攪拌機 廣東省中山市美斯特電器有限公司；T-203電子天平 美國丹佛公司；PH-3C雷磁精密pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞果酒發(fā)酵工藝流程

枸杞→以料液比1:10(m/V)用自來水(pH6.7)浸泡30min→打漿→調(diào)整成分(白砂糖、酒石酸、NaHSO3)→接種酵母→發(fā)酵→離心→果酒樣品

打漿：將浸泡后的枸杞用攪拌機(13000r/min)攪拌破碎30s成漿；調(diào)整成分：按照實驗設(shè)計，用白砂糖調(diào)整枸杞漿液的糖度，用酒石酸調(diào)整酸度，并加入SO2(以NaHSO3計)抑制雜菌和防止氧化；發(fā)酵：接入酵母后在實驗設(shè)計的溫度下靜置發(fā)酵4～8d，至發(fā)酵液中殘?zhí)呛坎辉僮兓癁榘l(fā)酵結(jié)束；離心：發(fā)酵結(jié)束后，及時對發(fā)酵液進行離心處理(4000r/min離心5min)，取上清液測定酒中總黃酮含量。

1.3.2 總黃酮含量的測定

參照文獻[12-13]所述方法，測定樣品的總黃酮含量。以總黃酮質(zhì)量濃度ρ(mg/100mL)為縱坐標(biāo)，吸光度A為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得回歸方程：ρ=6.0008A＋0.0997(R2=0.9995)。

取5.0mL總黃酮樣品液，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得回歸方程計算樣品中總黃酮含量。

1.3.3 發(fā)酵條件的單因素試驗設(shè)計

取30g枸杞按料液比1:10于室溫下浸泡30min，打漿，加入162.5mg/L亞硫酸氫鈉，根據(jù)單因素試驗設(shè)計，在維持其他條件不變的條件下，分別改變發(fā)酵溫度、糖添加量、酵母添加量和發(fā)酵液初始pH值，分別考察各因素對成品酒中總黃酮類化合物的影響情況。在單因素試驗中，改變一個因素時，其他因素的水平分別固定為：糖添加量0(此時發(fā)酵醪的含糖量為113.0g/L)，初始pH4.0，酵母接種量0.2g/L，發(fā)酵溫度20℃。各因素的變化范圍分別為：發(fā)酵溫度：15.0、17.5、20.0、22.5、25.0、30.0℃；發(fā)酵液初始pH值：3.0、4.0、5.0、6.0；糖添加量：0、50.0、100.0、150.0、200.0g/L；酵母添加量：0.1、0.2、0.3、0.4g/L。

發(fā)酵結(jié)束后，按照方法1.3.1節(jié)中相關(guān)步驟處理，取上清液測定其中總黃酮含量。

1.3.4 發(fā)酵條件的Box-Behnken試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果并結(jié)合已有文獻[14]報道，選取發(fā)酵溫度、糖添加量、酵母添加量、初始pH值4個因素，按照Box-Behnken設(shè)計進行試驗，設(shè)計四因素三水平試驗。所選因素的水平及其編碼值見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計的因素水平編碼值Table 1 Coded factors and their coded levels in Box-Behnken matrix design

2 結(jié)果與分析

影響枸杞酒中總黃酮含量的主要過程有兩個：一是原料中總黃酮的提取，二是提取液中總黃酮的穩(wěn)定。已有研究表明，影響總黃酮提取效果的主要因素有乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度[12]；影響溶液中總黃酮穩(wěn)定性的主要因素有pH值、還原劑、金屬離子、自然光[15]；影響果酒發(fā)酵過程中總黃酮穩(wěn)定性的主要因素有菌種、溫度、接種量、SO2、自由基、pH值、金屬離子等[16]。枸杞酒發(fā)酵過程中，除了溫度控制恒定以外，發(fā)酵液中的pH值和酒精體積分?jǐn)?shù)則隨著微生物的生長代謝而處于一種變化的狀態(tài)。其中，糖添加量和酵母添加量會影響菌種的生長代謝速度和最終的乙醇產(chǎn)量，溫度會影響菌種的生長和乙醇的產(chǎn)生速度，低pH值有助于抑制其他雜菌的污染和保證發(fā)酵過程的正常進行，酵母添加量會影響發(fā)酵過程的起始速度和發(fā)酵速度。為了掌握發(fā)酵過程酒液中總黃酮含量的變化規(guī)律，本實驗重點考察不同溫度、pH值、接種量和含糖量條件下果酒中總黃酮含量的變化。

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 糖添加量的影響

圖1 糖添加量對枸杞果酒中總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of sugar addition on total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine

為了調(diào)整發(fā)酵醪的糖度以保證產(chǎn)生足夠的酒度，需要在枸杞汁中加入一定量的糖。由圖1可知，發(fā)酵液中糖添加量從0增大至200.0g/L時，成品酒中總黃酮含量呈先上升后下降的趨勢，在糖添加量為100.0g/L時達到最大值。糖添加量對酵母的生長代謝會產(chǎn)生重要影響，進而影響到發(fā)酵果酒中總黃酮的存在；同時糖添加量的不同會造成發(fā)酵后的果酒酒精體積分?jǐn)?shù)不同，總黃酮的溶解度在不同酒精體積分?jǐn)?shù)中有所不同，這也會造成枸杞果酒中總黃酮含量有所變化。本試驗表明，糖添加量100.0g/L有利于酵母的生長，同時此條件下最終枸杞果酒酒精體積分?jǐn)?shù)14%是枸杞中黃酮溶出的適宜酒精體積分?jǐn)?shù)。

根據(jù)已有報道，總黃酮類化合物對葡萄糖、淀粉、蔗糖較穩(wěn)定[15]。因此，糖添加量對酒中總黃酮含量的影響主要在于其對酵母生長和代謝的影響。糖質(zhì)量濃度適宜時酵母的生長速度快，發(fā)酵起動得早，菌體生長旺盛，乙醇產(chǎn)生速度快；代謝速度較快；糖質(zhì)量濃度持續(xù)增加時，酵母的生長和代謝反而會受到抑制，甚至?xí)Ｖ拱l(fā)酵[17]。另外，發(fā)酵液的含糖量高，成品酒的酒精體積分?jǐn)?shù)高；含糖量低，轉(zhuǎn)化成的酒精體積分?jǐn)?shù)也低?？琢蠲鞯萚18]研究表明，在較低酒精體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，總黃酮的溶出率隨酒精體積分?jǐn)?shù)的增加而升高，這與本研究結(jié)果相符。在糖添加量為200.0g/L時總黃酮含量降低，則可能是過高的糖質(zhì)量濃度抑制了酵母的生長與代謝，酒精產(chǎn)量低。

2.1.2 發(fā)酵溫度的影響

圖2 發(fā)酵溫度對枸杞果酒中總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of temperature on total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine

溫度對于總黃酮的提取率、穩(wěn)定性及酵母菌的生長代謝都有重要影響。高溫雖然有利于總黃酮的提取，而且對總黃酮的穩(wěn)定性無顯著影響[19]，但會抑制酵母的生長與代謝，從而影響酒中的乙醇含量。參考果酒發(fā)酵的溫度范圍，本試驗重點考察了當(dāng)發(fā)酵溫度分別控制在15～30℃范圍內(nèi)的不同水平時，所得成品酒中的總黃酮含量。由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的增大，成品酒中總黃酮含量呈先增大后降低趨勢，20℃時達到最大值。與發(fā)酵液中糖添加量的影響相似，發(fā)酵溫度同樣會影響到酵母的生長代謝以及總黃酮的溶解度，進而造成發(fā)酵后枸杞果酒中總黃酮含量的不同，選用20℃為酵母的最佳發(fā)酵溫度，同時是黃酮溶出的適宜溫度。

根據(jù)酵母的生長特性可知，20℃為酵母最適繁殖溫度[20-21]。溫度過低時，酵母生長和代謝速度緩慢，短期內(nèi)的酒精產(chǎn)量低，但最終生成的酒精體積分?jǐn)?shù)高；隨著溫度的升高，酵母的生長和代謝速度增強，短期內(nèi)的酒精產(chǎn)量高，但最終生成的酒精體積分?jǐn)?shù)并不一定高；溫度過高時，發(fā)酵速度雖然快，但發(fā)酵停止得早，酵母衰老更快，產(chǎn)品酒度低，從而使總黃酮苷的含量反而低。余曉紅等[22]在研究啤酒發(fā)酵過程時發(fā)現(xiàn)，主發(fā)酵溫度為13℃時，酵母的生長量、發(fā)酵度和高級醇產(chǎn)量等均高于9℃。而靳桂敏等[16]在研究崗稔果酒的發(fā)酵過程時發(fā)現(xiàn)，控制發(fā)酵溫度為13℃時所得酒中總黃酮含量高于30℃時所得結(jié)果。由于本研究中是短期定時取樣，20℃表現(xiàn)為最佳發(fā)酵溫度主要是因為該溫度是酵母的最適生長溫度，能夠在短期內(nèi)產(chǎn)生較多的酒精，從而有利于提高酒中總黃酮的溶解率，而又保持較好的穩(wěn)定性。

2.1.3 酵母添加量的影響

由圖3可知，酵母添加量從0.1g/L增加到0.4g/L時，成品酒中總黃酮含量呈先增大后減少趨勢，在酵母添加量為0.2g/L時達到最大值。這是因為，發(fā)酵液中糖含量和發(fā)酵溫度一定時，酵母添加量少，發(fā)酵起動慢，容易污染雜菌，短期內(nèi)產(chǎn)酒精量低；酵母添加量大，發(fā)酵啟動早、速度快，短期內(nèi)產(chǎn)酒精量高；酵母添加量過大時，酵母新增細(xì)胞數(shù)少、容易老化，酒精產(chǎn)量少[23]。靳桂敏等[16]也發(fā)現(xiàn)，在崗稔果酒的發(fā)酵過程中，酵母添加量對酒中總黃酮含量也表現(xiàn)出相同的影響規(guī)律。

圖3 酵母添加量對枸杞果酒中總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of yeast inoculation size on total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine

2.1.4 發(fā)酵液pH值的影響

圖4 pH值對枸杞果酒中總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of pH on total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine

自然枸杞汁的pH值為6.0左右。考慮到雜菌污染的影響，在發(fā)酵前都需要降低其pH值，從而抑制發(fā)酵過程中產(chǎn)生的雜菌污染；但是，過高的酸度也會抑制酵母的生長，并且會使果汁內(nèi)一些物質(zhì)如乙酸乙酯發(fā)生水解生成揮發(fā)酸進一步影響發(fā)酵液pH環(huán)境[17,23-24]。由圖4可知，枸杞汁的pH值從2.0增大至6.0時，成品酒中總黃酮含量呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，在pH4.0時達最大值，這說明枸杞中總黃酮在pH4左右的條件下比較穩(wěn)定。

就物質(zhì)結(jié)構(gòu)而言，總黃酮是一類含有酚羥基的化合物，呈酸性[25]。pH值對總黃酮的穩(wěn)定性有重要影響。張雁[26]和王辰[27]等發(fā)現(xiàn)多數(shù)總黃酮在pH4～5時較穩(wěn)定；張久春等[15]報道，柑橘皮中水溶性總黃酮pH5～6條件下比較穩(wěn)定，在強酸和強堿溶液中不穩(wěn)定。這些結(jié)果均與本實驗的研究結(jié)果基本一致。

2.2 Box-Behenken試驗結(jié)果

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken matrix design scheme and corresponding experimental results

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析和模型系數(shù)顯著性檢驗Table 3 Analysis of variance of quadratic regression model and significance test for its each term

為了考察各因素對成品酒中總黃酮含量的綜合影響，按照Box-Behenken設(shè)計進行試驗，結(jié)果見表2。對其中試驗數(shù)據(jù)使用Design-Expert 7.00進行分析并推導(dǎo)得出以總黃酮含量為因變量的函數(shù)關(guān)系：優(yōu)化參數(shù)系數(shù)，因素A(溫度)、D(pH值)以及所有因素的平方項對總黃酮終含量有顯著影響。分析表明，溫度和酵母添加量以及酵母和糖添加量之間也有相互作用。忽略到影響較小的因素，得到預(yù)測模型如下：

總黃酮含量/(g/L)＝0.2364＋0.0138A＋9.083×10-4B＋2.375×10-3C＋9.583×10-3D－8.800×10-3AB＋9.325× 10-3BC－0.019A2－0.018B2－0.013C2－0.018D2

對上述方程及其系數(shù)進行方差分析，結(jié)果如表3所示，回歸模型方差分析結(jié)果表明，F(xiàn)值為27.4284，只有不到0.1%的可能是擾動項造成，表明該模型顯著。模型的各因素中，A、D、A2、B2、C2、D2達到了極顯著水平；交互項AB、BC達到了顯著水平，失擬(P=0.7781＞0.1)不顯著，結(jié)果表明二次項模型擬合試驗數(shù)據(jù)的效果是顯著的。模型R2=0.9384表明僅有6.2%變異的不能由該模型解釋，調(diào)整后R2=0.9042證明該模型具有較高價值；同時變異系數(shù)(2.76%)也較低，表明該試驗具有很高的精確度和可靠性。

由回歸方程中各因素的回歸系數(shù)的絕對值大小可以看出，各因素一次項對總黃酮含量的影響次序為A＞D＞C＞B，即溫度的影響最大，糖添加量的影響最小。

圖5 內(nèi)學(xué)生化殘差正態(tài)概率分布圖Fig.5 Normal plot of internally studentized residuals

圖5為擬合模型的內(nèi)學(xué)生化殘差分布，其殘差各點分布幾乎在一條直線上，表明該模型擬合效果較好。同時對比預(yù)測值與實際值之間相互關(guān)系，結(jié)果顯示，預(yù)測值和實際值的分布也基本在一條直線上，表明模型具有較好的實際作用。

圖6 溫度和酵母添加量交互作用等高線示意圖(a)和響應(yīng)曲面圖(b)Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of yeast inoculation size and temperature on total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine

圖7 酵母添加量和糖添加量交互作用的等高線示意圖(a)和響應(yīng)曲面圖(b)Fig.7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of yeast inoculation size and sugar addition on total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine

由圖6a、7a可以看出，當(dāng)溫度水平較低時，隨著酵母添加量的增加，總黃酮含量隨之增加；當(dāng)溫度水平較高時，總黃酮含量隨酵母添加量的增加反而下降。在溫度處于20.0～22.5℃、酵母添加量在0.25～0.35g/L范圍時總黃酮含量有最大值。圖6b、7b顯示了溫度和pH值處于零水平時酵母添加量和糖添加量的交互作用，總黃酮含量隨著酵母、糖添加量的增加都是先升高后下降的趨勢，與單因素試驗結(jié)果相符。酵母添加量處于0.25～0.3g/L、糖添加量在50～100g/L范圍內(nèi)時，酒中總黃酮含量有最大值。

由圖6 b、7 b可知，擬合曲面有最大值，利用Design-Expert對回歸模型求解，得到發(fā)酵酒中總黃酮含量達到最大時，最佳條件為發(fā)酵溫度21.9℃，酵母添加量0.29g/L，糖添加量107.0g/L，pH4.3，此條件下總黃酮最終含量達到最大為0.2404g/L。在優(yōu)化得出的最佳條件下進行驗證實驗，實際結(jié)果為(0.2337±0.0043)g/L，驗證了響應(yīng)面模型，結(jié)果表明實驗值和預(yù)測值吻合，說明利用響應(yīng)面分析發(fā)酵果酒中總黃酮最終含量可信，該模型得到的發(fā)酵參數(shù)可靠，可以用來反映預(yù)測值，具有實用價值。

3 結(jié) 論

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗方案考察了發(fā)酵溫度、糖添加量、酵母添加量以及初始pH值對發(fā)酵后枸杞果酒中總黃酮含量的影響；利用響應(yīng)面分析方法建立了各因素對枸杞果酒中總黃酮含量的二次多項式模型，對模型進行了方差分析，結(jié)果表明：模型擬合程度高、試驗誤差較小。研究為以保留枸杞中活性因子總黃酮為目標(biāo)的果酒發(fā)酵提供了一定的參考資料。

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Optimization of Fermentation Conditions for Production of Chinese Wolfberry Fruit Wine with Higher Total Flavonoid Content

XU Liang1，SHI Jun-ling1,*，CHEN Dong-fang1，WANG Zhen-ping2
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；
2. Engineering Research Center of Grape and Wine, Ministry of Education, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)

This study aimed to develop a fermentation process for the production of fruit wine using Chinese wolfberry fruits from Ningxia autonomous region as the starting material. The fermentation conditions temperature, sugar addition, yeast inoculation size and pH were investigated in 4 runs of single factor experiments to preliminarily understand their effects on total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine. Subsequently, Box-Behnken matrix design followed by regression analysis was used to establish a quadratic regression model for total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine as a function of the above four fermentation conditions. Finally, response surface analysis was carried out for optimization purpose. The optimum fermentation conditions for improved total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine were determined as follows: fermentation temperature 21.9 ℃; yeast inoculation size 0.29 g/L; sugar addition 107.0 g/L; and pH 4.3. Under these conditions, the predicted value of total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine was 0.2404 g/L, and the experimental value was (0.2337 ± 0.0043) g/L. Therefore, the established regression model has good prediction ability.

Chinese wolberry；fruit wine；fermentation；flavonoids；response surface methodology；optimization

TS262.7

A

1002-6630(2011)07-0188-06

2010-08-07

國家自然科學(xué)基金項目(20862014)

許亮(1989—)，男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：muzxl2007@gmail.com

*通信作者：師俊玲(1972—)，女，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：sjlshi2004@yahoo.com.cn