王蓓蓓，牛付閣，段玉峰*

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062)

高良姜與大高良姜總黃酮抗氧化活性比較研究

王蓓蓓，牛付閣，段玉峰*

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062)

比較研究高良姜和大高良姜總黃酮的體外抗氧化活性。采用2,2-二苯基-1-苦味?；?DPPH)自由基體系、超氧陰離子自由基體系、羥自由基體系對(duì)高良姜和大高良姜總黃酮的抗氧化活性進(jìn)行比較研究，并同VC和BHT的抗氧化活性進(jìn)行比較。在質(zhì)量濃度 (0.05～0.5mg/mL)范圍內(nèi)，高良姜和大高良姜總黃酮對(duì)DPPH自由基、·OH、·的清除率分別為94.0%和94.4%、82.1%和80.7%、16.6%和16.7%，其抗氧化活性微弱于VC和BHT。結(jié)果表明，大高良姜中總黃酮的抗氧化活性大于高良姜。

高良姜；大高良姜；總黃酮；抗氧化性

黃酮類化合物(falvonoids)泛指具有15個(gè)碳原子的多元酚化合物，廣泛存在于自然界，是目前倍受人們關(guān)注的天然產(chǎn)物之一。近年來(lái)，大量的體內(nèi)和體外研究表明黃酮類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化和清除自由基的活性[1]，同時(shí)它們具有抑菌、抗衰老、抗衰變、降血脂、降血壓、抗腫瘤、抗炎，調(diào)節(jié)心血管等的藥理保健功能且毒副作用很小，是一類極具開發(fā)前景的天然有機(jī)抗氧化劑。

高良姜為姜科山姜屬植物高良姜(Alpinia officinarumHance)的干燥根莖，又名風(fēng)姜、小良姜，具有溫胃、祛風(fēng)、散寒、行氣、止痛的功效。用于脘腹冷痛、胃寒嘔吐、暖氣吞酸[2]。大高良姜為姜科山姜屬植物大高良姜(Alpinia galangalWilld)的根莖，又名大良姜、良姜、山姜，是《中國(guó)藥典》收載的植物類藥材，果實(shí)入藥稱為紅豆蔻，味辛、性熱，能散寒、暖胃、止痛，用于胃脘冷痛，脾寒吐瀉，其根莖亦供藥用[3]。

高良姜與大高良姜同屬于姜科植物，是中藥中重要的配伍成分，二者都含有較豐富的黃酮類化合物，卻有不同的功效。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)對(duì)二者總黃酮抗氧化活性的異同進(jìn)行比較研究，本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)二者體外抗氧化活性的強(qiáng)弱進(jìn)行比較，以提供它們藥效差異的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

高良姜、大高良姜購(gòu)于陜西省藥材市場(chǎng)。

乙醇(75%)、石油醚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯三酚、FeSO4·7H2O、DPPH、H2O2、抗壞血酸(VC)、二丁級(jí)羥基甲苯(BHT，食品級(jí))。

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-Ⅲ型循環(huán)真空泵 上海亞榮生化儀器廠；AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HHW-21CU-600型電熱恒溫水槽、DGX-9073B-1電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Alphal-4型真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Chris公司；WFJ2000型可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海) 儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；800B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；FW-80型高速粉碎機(jī) 河北省黃驊市新興電器廠。

1.2 方法

1.2.1 高良姜和大高良姜黃酮粗提物的制備

稱取烘干的高良姜和大高良姜各15g，過(guò)40目篩，用石油醚脫脂24h，揮干石油醚，然后以50%乙醇為提取溶劑，料液比1:75，提取溫度80℃，提取5h，提取液于3000r/min離心20min，取上清液。將得到粗提液減壓濃縮至膏狀，用少量蒸餾水溶解所得到的濃縮物，直至無(wú)色。然后將得到的濃縮物真空冷凍干燥2 4 h，得到干的黃酮粗提物，備用。

1. 2. 2 高良姜和大高良姜中黃酮類組分總還原能力的測(cè)定[4]

在10mL的試管中依次加入2.5mL、pH6.6的磷酸緩沖溶液，1mL不同質(zhì)量濃度提取物溶液和1mL 1g/100mL鐵氰化鉀溶液，搖勻，50℃水浴加熱20min，急速冷卻，再加入2.5mL 10g/100mL三氯乙酸并搖勻，取出5mL再加入5mL蒸餾水和1mL 1g/100mL FeCl3，混勻后靜置10min，于700nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蒸餾水調(diào)零，VC作為陽(yáng)性參照，每組做3個(gè)重復(fù)，求其平均值，吸光度越大，說(shuō)明總還原能力越強(qiáng)。

1.2.3 高良姜和大高良姜中黃酮類組分清除超氧陰離子自由基的能力[5]

取0.05mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH8.2)4.5mL，置于25℃水浴中預(yù)熱20min，分別加入1mL試樣和0.4mL 25mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5min，加入8mol/L HCl 1mL終止反應(yīng)，于299nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(Ai)，空白對(duì)照組以相同體積的蒸餾水取代樣品，測(cè)定吸光度(A0)，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組需重復(fù)3次，求其平均值[6]。

1.2.4 高良姜和大高良姜中黃酮類組分清除羥自由基的能力[7]

移取25mL 2mmol/L FeSO4溶液，25mL 6mmol/L H2O2溶液于150mL的錐形瓶中，混合均勻后加入75mL 6mmol/L水楊酸溶液，在37℃的水浴中反應(yīng)15min，然后在波長(zhǎng)510nm處測(cè)吸光度(A0)，從以上的測(cè)定體系中取24mL于25mL的比色管中，再加入1mL不同質(zhì)量濃度的提取物溶液，37℃的水浴中反應(yīng)15min后，于波長(zhǎng)510nm處測(cè)其吸光度(Ax)，以VC和BHT作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組需重復(fù)3次，求其平均值。

1.2.5 高良姜和大高良姜中黃酮類組分清除DPPH自由基的能力[8]

準(zhǔn)確稱取20mg DPPH試劑，用無(wú)水乙醇溶解并定容于250mL容量瓶，配制成2×10-4mol/L的溶液。取2mL樣品溶液及2mL 2×10-4mol/L DPPH溶液加入同一具塞管中，加入1mL無(wú)水乙醇使反應(yīng)總體積達(dá)到5mL，搖勻[9]。反應(yīng)30min后在最大吸收波長(zhǎng)517nm處測(cè)定吸光度(A0)，計(jì)算DPPH自由基的清除率，根據(jù)公式(3)計(jì)算清除率，以VC作為對(duì)照品。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組需重復(fù)3次，求其平均值。

式中：A0為2mL DPPH溶液+2mL樣品溶劑+1mL無(wú)水乙醇的吸光度；Ai為2mL DPPH溶液+2mL樣品溶液(或?qū)φ掌啡芤?+1mL無(wú)水乙醇的吸光度；Aj為2mL無(wú)水乙醇+2mL樣品溶液(或?qū)φ掌啡芤?+1mL無(wú)水乙醇的吸光度。

1.2.6 半數(shù)清除質(zhì)量濃度(EC50)的測(cè)定

EC50指清除率為50%時(shí)所需樣品的質(zhì)量濃度。所需質(zhì)量濃度越低，表明半清除率越高，清除效果越好[10]。將各項(xiàng)實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)用擬合優(yōu)化法來(lái)模擬S曲線，可通過(guò)Scatchard法和Hill法使量效關(guān)系S型曲線直線化[11]，并得出線性方程y＝mx＋c，從中即可計(jì)算出EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 總還原能力測(cè)定

圖1 大高良姜和高良姜總黃酮與VC的總還原能力Fig.1 Total reducing power of total falvonoids from Alpinia officinarum Hance and Alpinia galangal Willd and VC

如圖1所示，高良姜和大高良姜總黃酮都具有良好的還原能力；隨著樣品中總黃酮質(zhì)量濃度的增大，還原能力逐漸增強(qiáng)。在所測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，大高良姜的還原能力大于高良姜，但都明顯弱于VC。

2.2 對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果

圖2 大高良姜和高良姜總黃酮與VC清除O2·的能力Fig.2 Scavenging capacities of total falvonoids from Alpinia officinarum Hance and Alpinia galangal Willd and VC against superoxide anion radicals

如圖2所示，大高良姜和高良姜總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基都有一定的清除能力，并且隨著黃酮化合物質(zhì)量濃度的增大而增加。同時(shí)，在所測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，大高良姜的清除效果微高于高良姜，但二者的清除率都明顯弱于VC。

2.3 對(duì)羥自由基的清除效果

羥自由基是已知最強(qiáng)的氧化劑，對(duì)細(xì)胞和組織的破壞作用最大。利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基：H2O2＋Fe2+=·OH＋OH－＋Fe3+，水楊酸能有效的捕捉·OH，并產(chǎn)生有色產(chǎn)物2,3-二羥基苯甲酸，該物質(zhì)在510nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收，若在此反應(yīng)體系中加入具有·OH功能的物質(zhì)，便會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)·OH，從而使有色物質(zhì)產(chǎn)物生成量減少[13-14]。

圖3 大高良姜和高良姜總黃酮、VC與BHT清除·OH的能力Fig.3 Scavenging capacities of total falvonoids from Alpiniaofficinarum Hance and Alpinia galangal Willd, VC and BHT against hydroxyl free radicals

由圖3可知，高良姜和大高良姜總黃酮對(duì)·OH均有一定的清除作用。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度在0.1～0.4mg/mL時(shí)，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加清除率逐漸增加，但當(dāng)質(zhì)量濃度增大至0.4mg/mL之后，清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而減小。在所測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，高良姜的清除效果強(qiáng)于大高良姜，但都明顯弱于VC，微弱于BHT。

2.4 對(duì)DPPH自由基的清除效果

自由基消除反應(yīng)是抑制機(jī)體過(guò)氧化過(guò)程的主要機(jī)制之一，樣品清除自由基的能力反映其抗氧化活性的高低。DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，其結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)苯環(huán)，1個(gè)N原子上有1個(gè)孤對(duì)電子，呈紫色，在517nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收。DPPH自由基和抗氧化劑相混合，隨著DPPH自由基與抗氧化劑提供的氫相結(jié)合，孤對(duì)電子被配對(duì)，使體系顏色由紫色變成淡黃色，吸光度減小，反應(yīng)結(jié)束后達(dá)到穩(wěn)定。DPPH自由基剩余百分率與抗氧化劑的清除能力相對(duì)應(yīng)，因此可用分光光度法進(jìn)行定量分析[15]。

圖4 大高良姜和高良姜總黃酮與VC清除DPPH自由基的能力Fig.4 Scavenging capacities of total falvonoids from Alpinia officinarum Hance and Alpinia galangal Willd, VC and BHT against DPPH free radicals

由圖4可知，高良姜、大高良姜總黃酮和VC對(duì)DPPH自由基都有很強(qiáng)的清除作用，且隨著樣品質(zhì)量濃度的增加清除效果逐漸增強(qiáng)。最大清除率分別為94%、94.4%和96.3%，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.8mg/mL時(shí)，高良姜和大高良總姜黃酮的清除率均達(dá)到最大。結(jié)果表明，大高良姜的清除能力大于高良姜，但均微弱于VC。

2.5 半數(shù)清除質(zhì)量濃度(EC50)測(cè)定結(jié)果

EC50值越低，表明清除率越高，清除效果越好[4]。由圖5可知，大高良姜總黃酮清除DPPH自由基的EC50值(0.1018mg/mL)小于高良姜(0.1021mg/mL)，二者之間差異不顯著(P＞0.05)；大高良姜總黃酮清除·的EC50值(1.3185mg/mL)大于高良姜(1.2887mg/mL)，表明高良姜總黃酮半清除率較高，但都小于VC；高良姜總黃酮清除·OH的EC50值(0.1225mg/mL)大于大高良姜(0.1142mg/mL)，表明大高良姜總黃酮半清除率較高，但小于VC。表1所示為大高良姜、高良姜和VC清除自由基的95%置信區(qū)間。

圖5 大高良姜和高良姜總黃酮與VC清除自由基的EC50值Fig.5 Half maximal effective concentrations (EC50) of total falvonoids from Alpinia officinarum Hance and Alpinia galangal Willd and VC for scavenging DPPH, superoxide anion and hydroxyl free radicals

表1 大高良姜和高良姜總黃酮與VC清除自由基的置信區(qū)間(x± s，n=5)Table 1 Confidence intervals of free radical scavenging activity of total falvonoids from Alpinia officinarum Hance and Alpinia galangal Willd and VC (x± s，n=5)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用體外產(chǎn)生的活性自由基系統(tǒng)，通過(guò)測(cè)定樣品中總黃酮對(duì)自由基的清除作用，從而對(duì)高良姜和大高良姜的抗氧化能力進(jìn)行比較研究。在所測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，大高良姜對(duì)DPPH自由基的清除能力強(qiáng)于高良姜；對(duì)O2·的清除能力，二者相差不大；而對(duì)·OH清除作用時(shí)，高良姜的清除能力微弱于大高良姜，但都弱于天然的抗氧化劑VC和BHT。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，高良姜和大高良姜的總黃酮粗提物都具有很好的抗氧化活性，但二者的抗氧化活性存在一定的差異?？傮w而言，大高良姜的抗氧化活性強(qiáng)于高良姜，從而為二者在藥效差異上提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] ZHU Hua, LIANG Dongyan, LIAO Yuekui, et al. Study progress of pharmacology effect of total flavonoid compounds[J]. 廣西中醫(yī)藥, 2003,26(3): 3-5.

[2] 江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大詞典(下冊(cè))[M]. 上海: 上海人民出版社, 1977:1907.

[3] 朱小璐, 竇穎輝, 黃雪峰, 等. 大高良姜的化學(xué)成分研究[J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2008(11): 13-15.

[4] 劉愛青. 蝗蟲黃酮的提取分離和生物活性研究[D]. 西安: 陜西師范大學(xué), 2007.

[5] CONCEPCION S M, JOSE A L. Free radical scavenging capacity and inhibition of lipid oxidantion of wines, grase juices and related polyphenolic constituent[J]. Food Res Int, 1999, 32(7): 407-412.

[6] 文鏡, 賀素華, 張博成, 等. 紅景天提取物清除O2·和·OH的體外實(shí)驗(yàn)研究[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(2): 219-223.

[7] 牛鵬飛, 段玉峰, 仇農(nóng)學(xué), 等. 玉米須中不同極性黃酮類化合物的抗氧化活性比較[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2006, 15(5): 71-74.

[8] 王敏, 魏益民, 高錦明. 苦蕎黃酮的抗脂質(zhì)過(guò)氧化和紅細(xì)胞保護(hù)作用研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2006, 6(3): 278-283.

[9] SUZUKI M, MORI M. Antioxidant mechanism of catechins on DPPH radical[J]. J Tennen Yuki Kagobutsu Toronkai KoenYoshishu, 2000, 40:631-636.

[10] 董彩軍, 謝明勇, 聶少平, 等. 青錢柳提取物體外抗氧化活性研究[J].食品科學(xué), 2007, 28(10): 31-34.

[11] 劉昌孝, 孫瑞元. 藥物評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)[M]. 北京: 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社, 1999: 31.

[12] 吳春, 陳林林. 菟絲子黃酮體外清除自由基活性的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2005, 17(5): 553-556.

[13] 劉平. 玉米須黃酮的提取分離及生物活性研究[D]. 西安: 陜西師范大學(xué), 2006.

[14] 史俊燕, 段玉峰, 牛富革, 等. 首烏藤粗提物及其不同極性黃酮組分的抗氧化活性比較[J]. 食品工業(yè)科技, 2009, 9(6): 112-114.

[15] 高蔭榆, 洪雪娥, 羅麗萍, 等. 甘薯葉柄藤類黃酮的體外抗氧化作用研究[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào): 理學(xué)版, 2007, 42(7): 1-4.

Comparison of Antioxidant Activity of Total Flavonoids fromAlpinia officinarumHance andAlpinia galangalWilld

WANG Bei-bei，NIU Fu-ge，DUAN Yu-feng*
(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)

The main purpose of this study was to comparatively investigate the antioxidant activity of total flavonoids fromAlpinia officinarumHance andAlpinia galangalWilldin vitro. The antioxidant evaluation was achieved by using DPPH, superoxide anion and hydroxyl free radical systems and comparing with the reference materials VC and BHT. In a certain concentration range (0.05－0.5 mg/mL), the scavenging rates of total flavonoids fromAlpinia officinarumHance andAlpinia galangalWilld against DPPH, superoxide anion and hydroxyl free radical were found to be 94.0% and 94.4%, 82.1% and 80.7%, and 16.6% and 16.7%, respectively, slightly inferior to those of VC and BHT. In general, total flavonoids fromAlpinia galangalWilld are better antioxidants than those fromAlpinia officinarumHance.

Alpinia officinarumHance；Alpinia galangalWilld；total flavonoids；antioxidant activity

TS255.1

A

1002-6630(2011)07-0117-04

2010-07-06

王蓓蓓(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称饭δ艹煞珠_發(fā)及利用。E-mail：fairy-miracle0516@stu.snnu.edu.cn

*通信作者：段玉峰(1955—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称饭δ艹煞珠_發(fā)及利用、天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：yfduan@snnu.edu.cn