劉 薇，劉雯佳，劉彥霞，趙 建，文 鏡*

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

鄰二氮菲-Fe3+法測(cè)定保健食品中水溶性成分的抗氧化能力

劉 薇，劉雯佳，劉彥霞，趙 建，文 鏡*

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

目的：建立用鄰二氮菲-Fe3+測(cè)定保健食品中水溶性成分抗氧化能力的方法。方法：用水相提取保健食品中的水溶性抗氧化成分，使其還原反應(yīng)體系中的Fe3+，生成的亞鐵離子與鄰二氮菲反應(yīng)成穩(wěn)定的橙紅色絡(luò)合物，用分光光度計(jì)在536nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以水溶性VE為對(duì)照，由此計(jì)算樣品水溶性成分中抗氧化(還原性)物質(zhì)的多少。通過對(duì)方法線性關(guān)系、最低檢測(cè)限、精密度、準(zhǔn)確度等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，驗(yàn)證方法的可行性。結(jié)果：檢測(cè)Trolox在質(zhì)量濃度0.66～10.53μmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2=0.9999)；最低檢測(cè)下限為0.54μmol /L；平行性精密度為2.7%；重復(fù)性精密度為3.3%；5次重復(fù)加標(biāo)回收率為(99.9±4.6)%。結(jié)論：鄰二氮菲-Fe3+法可用于保健食品中水溶性成分抗氧化能力的檢測(cè)。

保健食品；抗氧化能力；鄰二氮菲-Fe3+法

隨著人們對(duì)自由基研究的日漸深入，發(fā)現(xiàn)損害人體健康的自由基幾乎都與活性較強(qiáng)的含氧物質(zhì)有關(guān)，因而把與這些物質(zhì)相結(jié)合的自由基定義為活性氧自由基?；钚匝踝杂苫鶎?duì)人體的損害本質(zhì)是一種氧化過程[1-3]。要降低自由基的損害，就需要抗氧化?？寡趸瘎┠軌蛱峁╇娮咏o自由基，并且在此過程中不會(huì)產(chǎn)生具有毒性或能引起自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的活性產(chǎn)物，從而消除氧自由基，終止鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[4-7]。體外測(cè)定抗氧化物質(zhì)清除自由基的方法主要包括化學(xué)發(fā)光法、分光光度法、電子自旋共振法、電化學(xué)檢測(cè)法，氣相色譜法和熒光法等[8-14]。這些方法中有些儀器試劑昂貴，操作復(fù)雜，使其應(yīng)用受到限制。分光光度法儀器價(jià)格便宜，操作簡(jiǎn)單，是一般實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)分析儀器。鄰二氮菲比色法最初是用于檢測(cè)樣品中Fe2+含量，其原理是鄰二氮菲可與Fe2+生成穩(wěn)定的橙紅色絡(luò)合物，而這種物質(zhì)在可見光區(qū)有顯著的吸收，利用這一性質(zhì)可對(duì)樣品中的Fe2+進(jìn)行測(cè)定[15-16]。標(biāo)準(zhǔn)的Fenton試劑是由H2O2與Fe2+組成的混合體系，F(xiàn)e2+可以催化分解H2O2產(chǎn)生羥自由基(·OH)，由此出現(xiàn)了對(duì)樣品清除自由基的能力進(jìn)行檢測(cè)的鄰二氮菲- Fe2+氧化法[17-18]。本實(shí)驗(yàn)室曾用分光光度計(jì)及鄰二氮菲- Fe2+法檢測(cè)保健食品的抗氧化能力[19]。該方法雖然具有操作簡(jiǎn)單，快速等優(yōu)點(diǎn)，但由于方法中通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的自由基容易受到多方面因素的干擾，使方法的重復(fù)性受到影響。本實(shí)驗(yàn)采用分光光度計(jì)及鄰二氮菲-Fe3+測(cè)定保健食品中水溶性成分抗氧化能力，使保健食品中的水溶性抗氧化成分直接與反應(yīng)體系中的Fe3+作用，試圖避開額外產(chǎn)生自由基的影響，提高方法的精密度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山竹粉 義烏章舸生物工程有限公司；葡萄籽膠囊艾申特生物科技有限公司；保健食品(品名：健康啟程)北京北衛(wèi)藥業(yè)有限責(zé)任公司；茶色素 江西綠色制藥有限公司；雅培牌胰肽素軟膠囊 北京北衛(wèi)藥業(yè)有限責(zé)任公司。

1,10-鄰二氮菲(分析純) 廣東汕頭市西隴化工廠；水溶性維生素E 美國(guó)Sigma公司；磷酸(分析純)；磷酸二氫鈉；磷酸氫二鉀；硫酸高鐵銨(分析純)；磷酸緩沖液PBS (75mmol/L、 pH7.4)、硫酸高鐵銨(10mmol/L)、鄰二氮菲(1.5mmol/L)、Trolox標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(0.2g/L Trolox)。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；PP-15專業(yè)型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；P211D分析天平 北京賽多利斯有限公司；METTLER AE100電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；渦旋混勻器 德國(guó)IKA公司；TDL-5CENTRIFUGE離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ-100B臺(tái)式超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV-2450 紫外-可見分光光度計(jì) 日本Shimadzu 公司。

1.3 方法

1.3.1 鄰二氮菲-Fe3+分光光度法原理

將待測(cè)保健食品樣品粉碎，用磷酸緩沖液提取樣品中水溶性抗氧化成分。反應(yīng)體系中的三價(jià)鐵離子(Fe3+)被提取液中的抗氧化成分(還原性物質(zhì))還原為Fe2+，亞鐵離子再與反應(yīng)體系中的鄰二氮菲生成穩(wěn)定的橙紅色絡(luò)合物，其吸光度與Fe2+濃度的關(guān)系符合朗伯-比耳定律，可用分光光度計(jì)檢測(cè)，由此測(cè)定出樣品中抗氧化(還原性)物質(zhì)的多少。以水溶性VE為標(biāo)準(zhǔn)，用每單位抗氧化樣品還原能力相當(dāng)于水溶性VE的當(dāng)量作為該樣品的抗氧化能力。

1.3.2 樣品提取

準(zhǔn)確稱取樣品(例如葡萄籽膠囊0.025g)用20mL緩沖液溶解后，超聲提取20min， 5000r/min離心10min，將上清移入50mL容量瓶?jī)?nèi)，沉淀用20mL緩沖液溶解后再提取一次，合并兩次提取液，用緩沖液定容至50mL搖勻，即為待測(cè)樣品。

1.3.3 樣品及Trolox的測(cè)定

在干凈試管中加入1mL磷酸緩沖液PBS，再加入0.1mL樣品或標(biāo)準(zhǔn)Trolox(分別為樣品管或標(biāo)準(zhǔn)Trolox管)，再加入2mL鄰二氮菲和0.5mL硫酸高鐵銨，水浴30min后取出試管再加入0.2mL磷酸，室溫靜置10min；以不加入任何樣品或標(biāo)準(zhǔn)Trolox，其他條件與上述相同的試管為對(duì)照管；以只加0.1mL樣品其余體積用磷酸緩沖液PBS補(bǔ)齊，該試管為樣品空白管。在536nm波長(zhǎng)處以蒸餾水調(diào)零比色測(cè)定其吸光度，記錄數(shù)值。

反應(yīng)中Fe3+會(huì)被抗氧化劑還原為Fe2+，但未反應(yīng)完剩余的Fe3+也會(huì)與鄰二氮菲生成黃色絡(luò)合物，因此當(dāng)Fe2+和Fe3+共存情況下，F(xiàn)e3+的干擾是客觀存在且不可忽視的。因此選用磷酸(H3PO4)當(dāng)掩蔽劑，F(xiàn)e3+可與H3PO4形成穩(wěn)定的無色Fe(HPO4)+配離子，從而有效地排除了顯色時(shí)Fe3+對(duì)Fe2+離子的干擾。H3PO4不具有氧化性，測(cè)定時(shí)不參與對(duì)Fe2+離子的氧化作用。

1.3.4 抗氧化能力計(jì)算

式中：抗氧化能力值以Trolox當(dāng)量(μmol Trolox當(dāng)量/g)表示，即1g樣品相當(dāng)于Trolox微摩爾數(shù)；A樣品、ATrolox、A對(duì)照分別為樣品管、標(biāo)準(zhǔn)管和對(duì)照管的吸光度；MTrolox為標(biāo)準(zhǔn)管所含Trolox的微摩爾數(shù)；M樣品為樣品管所含樣品的質(zhì)量。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取0.2g/L Trolox標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1mL加1mL磷酸緩沖液稀釋為0.1g/L應(yīng)用液，再將應(yīng)用液用磷酸緩沖液稀釋為0.05、0.025、0.0125、0.00625g/L的Trolox標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按1.3.3節(jié)方法測(cè)定。

1.3.6 最低檢測(cè)下限

連續(xù)測(cè)定對(duì)照管吸光度10次，根據(jù)最低檢測(cè)限的計(jì)算公式計(jì)算結(jié)果。

DL=3SD/K

式中：DL為最低檢測(cè)限；SD為標(biāo)準(zhǔn)偏差；K為斜率。

1.3.7 平行性精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取山竹粉0.025g 5份，平行操作，用1.3.3節(jié)方法提取并測(cè)定。

1.3.8 重復(fù)性精密度實(shí)驗(yàn)

每天準(zhǔn)確稱取山竹粉0.025g 3份，用1.3.3節(jié)方法提取并測(cè)定。連續(xù)測(cè)定5 d。

1.3.9 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取0.025g山竹粉2份，其中一份定量加入0.0025g標(biāo)準(zhǔn)Trolox，樣品處理及測(cè)定方法同上。重復(fù)測(cè)定5次。

2 結(jié)果與分析

2.1 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Troloxst and ardcurve

由圖1可知，Trolox 在質(zhì)量濃度0.00625～0.1g/L范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系和較低的檢測(cè)下限。

2.2 最低檢測(cè)下限測(cè)定

平行測(cè)定10次對(duì)照管值，計(jì)算可得方法檢測(cè)Trolox的最低檢測(cè)下限為0.27μmol/L。由于在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)干擾因素較多，因此將這一數(shù)值再放大2倍作為本方法的最低檢測(cè)下限，即0.54μmol/L。

2.3 平行性精密度實(shí)驗(yàn)

用山竹粉樣品進(jìn)行平行性精密度實(shí)驗(yàn)，5個(gè)平行測(cè)定結(jié)果為(396±11.0)μmol/g ，變異系數(shù)為2.7%，表明方法的平行性精密度良好。

2.4 重復(fù)性精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用山竹粉進(jìn)行重復(fù)性精密度實(shí)驗(yàn)，其5次重復(fù)性測(cè)定結(jié)果為(402±13.2)μmol/g ，變異系數(shù)為3.3%，表明方法的重復(fù)性精密度良好。

2.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table1 Spiker ecoveries for Trolox in mangosteen powder

用山竹粉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)(表1)，5次重復(fù)結(jié)果為(99.9±4.6)%，表明方法具有較好的準(zhǔn)確度。用鄰二氮菲-Fe2+法測(cè)定同一樣品(山竹粉)，將鄰二氮菲-Fe3+法與鄰二氮菲-Fe2+法[19]測(cè)定結(jié)果進(jìn)比較(表2)。結(jié)果表明，鄰二氮菲-Fe3+法測(cè)得最低檢測(cè)下限有了明顯的下降，這可能與鄰二氮菲-Fe2+法反應(yīng)體系中有H2O2的有關(guān)。當(dāng)H2O2加量過多，過量的H2O2與樣品中還原性物質(zhì)反應(yīng)，還原性物質(zhì)對(duì)Fe2+保護(hù)的靈敏性下降，使得檢測(cè)下限偏高。另外，鄰二氮菲-Fe3+法重復(fù)性精密度明顯好于鄰二氮菲-Fe2+法，其他指標(biāo)都與鄰二氮菲-Fe2+法相差不大。說明與鄰二氮菲-Fe2+法比較，鄰二氮菲-Fe3+法測(cè)定保健食品抗氧化能力有更好的穩(wěn)定性。

表2 鄰二氮菲-F e2+法與鄰二氮菲-F e3+法方法學(xué)對(duì)比Table2 Methodological comparisonbetween phenan throline-Fe2+ and phen an throline-Fe3+ methods

2.6 5種樣品抗氧化能力的測(cè)定結(jié)果

表3 樣品抗氧化能力測(cè)定結(jié)果(n=5)Table 3 Antioxidant capacity of various commercial functional foods determined by phenanthroline-Fe3+ method (n=5)

用該方法順利測(cè)定了山竹粉等5種樣品中水溶性部分的抗氧化能力，結(jié)果見表3。重復(fù)測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)為2.2%～2.8%，表明用此方法實(shí)測(cè)樣品，結(jié)果具有良好的重復(fù)性。

3 討 論

3.1 方法的適用性

由于方法的顯色反應(yīng)是在水相中進(jìn)行，因此對(duì)于樣品的提取、分離等前處理過程采用磷酸緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)參照物也選擇了水溶性VE。保健食品中的抗氧化活性成分可以分為脂溶性和水溶性兩部分。本方法只能檢測(cè)到保健食品中水溶性成分的抗氧化能力，樣品中脂溶性成份的抗氧化能力不能被測(cè)定出來。 因此此方法適用于檢測(cè)不含脂溶性成份或脂溶性成份含量低的保健食品。對(duì)于脂溶性成份含量高的保健食品，本方法只能檢測(cè)其水溶性成份的抗氧化能力，脂溶性成份的抗氧化能力需采用其他方法檢測(cè)。

3.2 方法的局限性

保健食品中的抗氧化成份絕大部分為能夠給出電子將自由基轉(zhuǎn)變?yōu)殛庪x子的還原劑。常見金屬離子氧化性排列順序如下：K+＜Ca2+＜Na+＜Mg2+＜Al3+＜Mn2+＜Zn2+＜Cr3+＜Fe2+＜Ni2+＜Sn2+＜Pb2+＜(H+)＜Cu2+＜Hg2+＜Fe3+＜Ag+＜Pt2+＜Au2+從這個(gè)排列順序可知Fe3+具有很強(qiáng)的氧化性，因此能夠與保健食品中的絕大部分還原劑反應(yīng)，故采用鄰二氮菲Fe3+法可將這些具有還原性的抗氧化成份檢測(cè)出來。但是個(gè)別樣品可能會(huì)含有一些高氧化還原電位的抗氧化物質(zhì)，它們不能將Fe3+還原，盡管它們能夠與自由基發(fā)生反應(yīng)但用本方法卻不能將它們檢測(cè)出來，這是本方法的局限性。

4 結(jié) 論

鄰二氮菲-Fe3+法具有良好的準(zhǔn)確度(RSD 2.7%)和精密度(RSD 3.3%)；最低檢測(cè)下限為0.54μmol/L；在0.66～10.53μmoL/L Trolox濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系(R2=0.9999)。鄰二氮菲-Fe3+法避開自由基的生成和消耗，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)的步驟，與鄰二氮菲-Fe2+法相比具有更好的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)證明鄰二氮菲-Fe3+法適用于保健食品水溶性成份抗氧化能力的檢測(cè)。

[1] ABDI S, ALI A. Role of ROS modified human DNA in the pathogenesis and etiology of cancer[J]. Cancer Letters, 1999, 142(1): 1-9.

[2] OLSEN H, SELJEFLOT I, KHLER H, et al. Increased leukocyte levels of reactive oxygen species (ROS) in populations at risk for atherosclerotic disease[J]. Atherosclerosis, 2000, 151(1): 57-59.

[3] ANGELOPOULOU R, LAVRANOS G, MANOLAKOU P. ROS in the aging male: Model diseases with ROS-related pathophysiology[J]. Reproductive Toxicology, 2009, 2(28): 167-171.

[4] 李云. 綜述自由基對(duì)人體健康的影響及目前的預(yù)防措施[J]. 內(nèi)蒙古石油化工, 2011(1): 87-89.

[5] 方允中. 自由基生物學(xué)的理論與應(yīng)用[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2002: 649-703.

[6] RYAN P, HYNES M J. The kinetics and mechanisms of the complex formation and antioxidant behaviour of the polyphenols EGCg and ECG with iron(Ⅲ)[J]. Journal of Inorganic Biochemistry, 2007, 101(4): 585-593

[7] CASALINO E, CALZARETTI G, SBLANO C, et al. Molecular inhibitory mechanisms of antioxidant enzymes in rat liver and kidney by cadmium[J]. Toxicology, 2002, 179(1/2): 37-50.

[8] 文鏡, 劉璇, 趙建. 熒光法及化學(xué)發(fā)光法在保健食品抗氧化體外實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)釀造, 2009(11): 130-133.

[9] 楊芬, 張瑞萍, 賀玖明, 等. 羥自由基的產(chǎn)生、捕集及檢測(cè)方法[J].藥學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 42(7): 692-697.

[10] 陳培榕, 李景虹, 鄧勃. 現(xiàn)代儀器分析試驗(yàn)與技術(shù)[M ]. 北京: 清華大學(xué)出版社, 2006,17(11): 65-67.

[11] 叢建波, 孫存普, 莫簡(jiǎn). 自旋捕集短壽命自由基的低溫保存[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 1993, 20(4): 326-327.

[12] 續(xù)潔琨, 姚新生, 栗原博. 抗氧化能力指數(shù)(ORAC)測(cè)定原理及應(yīng)用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2006, 22(8): 1015-21.

[13] 程宏英, 曹玉華. 毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)法測(cè)定硫酸銅-維生素C反應(yīng)體系中的羥基自由基和菊花的抗氧化活性[J]. 2007, 25(5): 681-685.

[14] ONOR, ODA T. Measurement of hydroxyl radicals in pulsed corona discharge[J]. Journal of Elect rostatics, 2002, 55: 333-342.

[15] SAYWELL L B, CUNNINGHAM B B. Determination of iron: colorimetric o-phenanthroline method[J]. Analytical Chemistry, 1937, 9(2): 67-69.

[16] TAMURA H, GOTO K, YOTSUYANAGI T, et al. Spectrophotometric determination of iron(Ⅱ) with 1,10-phenanthroline in the presence of large amounts of iron(Ⅲ)[J]. Talanta, 1974, 21(4): 314-318.

[17] 陳勝兵, 何少華, 婁今生, 等. Fenton試劑的氧化作用機(jī)理及其應(yīng)用[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2004, 3(27):105-107.

[18] 金鳴, 蔡亞欣, 李金榮, 等. 鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測(cè)H2O2/Fe2+產(chǎn)生的羥自由基[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 1996, 23(6): 553-555.

[19] 文鏡, 劉薇, 王宏君, 等. 鄰二氮菲-Fe2+法測(cè)定保健食品的抗氧化能力[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(18): 333-337.

Determination of Antioxidant Capacity of Water-soluble Compounds in Functional Food by Phenanthroline-Ferric Ion Method

LIU Wei，LIU Wen-jia，LIU Yan-xia，ZHAO Jian，WEN Jing*
(Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods, College of Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Objective: To establish a colorimetric method to determine the antioxidant capacity of water-soluble compounds in functional food based on the reaction between 1,10-2 phenanthroline and Fe3+to form yellow complexes. Methods: The hydrophilic antioxidants in functional foods were extracted with pH 7.4 PBS buffer solution (75 mmol/L) and allowed to reduce Fe3+to Fe2+. Fe2+was exposed to 1,10-2 phenanthroline to form a stable Fe2+-phenanthroline complex. The absorbance of the complex was determined on a spectrophotometer at 536 nm and used to calculate the antioxidant capacity of water-soluble compounds in functional food using Trolox, a water soluble vitamin E analog, as the reference standard. The accuracy, linearity, repeatability, recovery rate and limit of detection (LOD) of this method were studied, and its feasibility was also verified. Results: This method showed a good linearity over the Trolox concentration of 0.66－10.53 μmol/L (R2= 0.9999). The LOD was 0.54 μmol/L. The replicability and repeatability was 2.7% and 3.3% relative standard deviation (RSD), respectively. The mean spike recovery was (99.9±4.6)% (n = 5). Conclusion: This method is applicable to determine the antioxidant capacity of water-soluble compounds in functional food.

functional food；antioxidant capacity；phenanthroline-Fe3+method

TS207.3

A

1002-6630(2011)16-0261-04

2011-05-16

北京市教委科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(KM201011417006)

劉薇(1986—)，女，助理工程師，主要從事保健食品功能評(píng)價(jià)研究。E-mail：liuwei4465@sina.com

*通信作者：文鏡(1952—)，男，教授，主要從事保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)機(jī)理和方法學(xué)研究。E-mail：wenjing@ygi.edu.cn