吳彩梅，白 潔，賈 剛，張克英*，丁雪梅，白世平，陳代文，吳秀群

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，教育部抗病營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 雅安 625014)

高效液相色譜法測定雞蛋中的三聚氰胺

吳彩梅，白 潔，賈 剛，張克英*，丁雪梅，白世平，陳代文，吳秀群

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，教育部抗病營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 雅安 625014)

建立采用固相萃取凈化，高效液相色譜法測定雞蛋中三聚氰胺含量的方法。樣品采用三氯乙酸和乙酸鉛溶液提取，優(yōu)化樣品提取時(shí)間、色譜柱及固相萃取柱，最終確定為樣品提取20min、采用TC-C18(4.6mm×150mm，5μm)色譜柱和PCX固相萃取柱。采用紫外檢測器，檢測波長為240nm，流動相為乙腈:辛烷磺酸鈉-檸檬酸緩沖液(10:90，V/V)，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量20μL，外標(biāo)法定量。三聚氰胺在1～50μg/mL范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系(R2=1)，在添加質(zhì)量濃度為5～20mg/kg范圍內(nèi)，三聚氰胺添加回收率在72.8%～87.6%，RSD(n=6)為1.5%～4.0%，最低檢測限為0.54mg/kg。

三聚氰胺；高效液相色譜；固相萃?。浑u蛋

三聚氰胺(melamine)簡稱三胺，學(xué)名三氨三嗪，別名蜜氨、氰尿酰胺、三聚酰胺，微溶于水及乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳。在一般情況下較穩(wěn)定，但在高溫下可能會分解放出氰化物[1]。三聚氰胺的含氮量為66.6%，折合粗蛋白含量為416.27%，因此，不法商販將其摻入蛋白性飼料或食品中提高蛋白質(zhì)測定含量，降低成本。有人估算在植物蛋白粉和飼料中使測試蛋白質(zhì)含量增加一個(gè)百分點(diǎn)，用三聚氰胺的花費(fèi)只有真實(shí)蛋白原料的1/5。三聚氰胺對哺乳動物低毒，但長期吸收到體內(nèi)，會導(dǎo)致體重降低、膀胱結(jié)石、結(jié)晶尿癥。世界衛(wèi)生組織(WHO)[2]報(bào)道，因?yàn)槿矍璋啡菀缀腿梭w內(nèi)氰脲酸(即三聚氰酸)反應(yīng)生成晶體狀聚合物，而引起結(jié)石等病狀，嚴(yán)重影響人類健康。2007年3月中旬以來，美國發(fā)生了寵物食品三聚氰胺污染事件，2008年國內(nèi)發(fā)生了三鹿奶粉事件，且在出口香港的雞蛋中也檢測出了三聚氰胺，因此，建立和完善飼料和食品中的三聚氰胺的檢測方法，勢在必行。目前針對飼料和牛奶中三聚氰胺的測定我國農(nóng)業(yè)部和國家質(zhì)檢總局先后于2007年和2008年相繼發(fā)布了農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和國家標(biāo)準(zhǔn)[3-4]，方法包括高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatogrophy-mass spectrometry，GC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS/MS)等。但是飼料和食品的其他不同基質(zhì)的相應(yīng)測試方法的國家標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)還沒有出臺，雞蛋中三聚氰胺的測定方法，亦未見標(biāo)準(zhǔn)出臺。目前，針對飼料和食品不同基質(zhì)的測定方法已見報(bào)道。Wang 等[5]采用酶聯(lián)免疫法測定豬、雞組織及體液中的三聚氰胺，針對液態(tài)奶、奶粉、飲料等食品以及魚、雞、豬組織等動物性食品，人尿液、小鼠血漿、組織中的三聚氰胺的測定不同學(xué)者[6-11]建立了LC-MS/MS法，對于雞蛋中三聚氰胺的檢測方法，陳義強(qiáng)等[12]建立了氣相色譜-質(zhì)譜法；Xia等[13]建立GC-MS/MS與UPLCMS/MS(ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry)法，Xu等[14]通過應(yīng)用新型離子交換樹脂凈化雞蛋建立了LC-MS/MS法，Chou等[15]采用高效液相色譜法測定了禽肉、蛋中的殺蟲劑及其代謝物三聚氰胺，并采用GC-MS法確證。GC-MS/MS、LC-MS/MS與HPLC相比靈敏度高、選擇性好，但GC-MS需要衍生化，過程比較繁瑣，且前兩種方法成本高儀器設(shè)備昂貴，一般作為確證的方法，而高效液相色譜法由于無需衍生化成本低且儀器設(shè)備較普及是目前最為常用的檢測方法和初篩方法。本實(shí)驗(yàn)主要在農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1372—2007《飼料中三聚氰胺的測定》[3]的基礎(chǔ)上，通過比較不同類型的色譜柱、固相萃取柱和樣品提取時(shí)間建立雞蛋中三聚氰胺的高效液相色譜檢測方法，并采用LC-MS/MS法確證。同時(shí)，應(yīng)用紫外光譜對不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行最大波長掃描，并測定三聚氰胺的總能，為全面了解三聚氰胺的性質(zhì)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地。

三聚氰胺對照品(純度≥99%) 美國Sigma公司；三聚氰胺內(nèi)標(biāo)(15N3-三聚氰胺)對照品(純度≥98%) 美國CIL公司；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純) 美國Fisher公司；正己烷(分析純)、乙酸銨(色譜純)、氨水(分析純) 成都科龍公司；所用水為Millipore儀器制得的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1200L液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀(配備410自動進(jìn)樣器) 美國瓦里安公司；HP1100高效液相色譜儀配備VWD紫外檢測器 美國安捷倫公司；HK6200超聲波提取儀 上海漢克科學(xué)儀器有限公司；Biofuge Primo R 臺式高速冷凍離心機(jī) 美國Kendro公司；Legend Micro 17R臺式高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司；T25勻質(zhì)器、MS3渦旋混合器 德國IKA公司；112氮吹儀 美國N-EVAP公司；混合陽離子固相萃取柱(PCX，HRXC，60mg，3mL)；24DL固相萃取裝置 Visiprep公司；1281能量測定儀 美國Parr公司； Beckman Ⅱ紫外分光光度計(jì) 美國Beckman公司；康氏震蕩器 金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 溶液的配制

三氯乙酸溶液10g/L、氨水甲醇溶液(量取5mL氨水，溶解于95mL甲醇中)；乙酸鉛溶液22g/L；體積分?jǐn)?shù)20%的甲醇溶液；流動相1：稱取2.16g辛烷磺酸鈉和2.10g檸檬酸與1L容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度。取該溶液900mL加入100mL乙腈；流動相2：稱取2.02g庚烷磺酸鈉和2.10g檸檬酸于1L容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度。取該溶液900mL加入100mL乙腈。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取100mg(精確到0.1mg)的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)20%的甲醇溶液溶解并定容于100mL容量瓶中，該溶液質(zhì)量濃度為1mg/mL，于4℃冰箱內(nèi)貯存，有效期3個(gè)月。標(biāo)準(zhǔn)中間液：吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液5.00mL于50mL容量瓶內(nèi)，用體積分?jǐn)?shù)20%甲醇溶液定容至50mL，該溶液三聚氰胺質(zhì)量濃度為100μg/mL，于4℃冰箱內(nèi)貯存，有效期1個(gè)月。標(biāo)準(zhǔn)工作液：用移液管分別移取標(biāo)準(zhǔn)中間液1、5、10、15、20mL于容量瓶內(nèi)，用體積分?jǐn)?shù)20%的甲醇溶液定容，該溶液三聚氰胺質(zhì)量濃度為1.0、5.0、10、15、20μg/mL。于4℃冰箱內(nèi)貯存，有效期1周。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

取雞蛋一枚，打入小燒杯中，用高速勻質(zhì)器將雞蛋攪勻。稱取5.00g試樣(精確至0.01g)于帶蓋塑料離心管中，準(zhǔn)確加入28mL三氯乙酸溶液，2mL乙酸鉛溶液，在渦旋混合器上渦旋1min，超聲提取20min。在10000r/min離心機(jī)上離心10min，取上清液凈化。

1.4.2 凈化

分別用3mL甲醇，3mL水活化混合型陽離子交換固相萃取柱，準(zhǔn)確移取3mL(具體上樣量由樣品含量高低來確定)離心上清液分次上PCX固相萃取柱，控制過柱速度在1mL/min以內(nèi)。再用3mL水和3mL甲醇洗滌混合型陽離子交換固相萃取柱，抽近干后用氨水甲醇溶液5mL洗脫。洗脫液50℃氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1.00mL甲醇溶液，渦旋振蕩1min，過0.22μm濾膜，上機(jī)測定。1.5 色譜條件

色譜柱：C18柱(4.6mm×150mm，5μm)， 柱溫：30℃，流速：1.0mL/min，檢測波長：240nm，流動相：乙腈:辛烷磺酸鈉-檸檬酸緩沖液(10:90，V/V)，進(jìn)樣量：20μL，方法運(yùn)行時(shí)間：20min。

1.6 添加回收及精密度實(shí)驗(yàn)

將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液添加于空白雞蛋勻漿樣品中，添加量分別為5、10mg/kg和20mg/kg。添加樣品室溫靜置30min后按照1.4、1.5節(jié)方法提取凈化，測定三聚氰胺含量，計(jì)算回收率和RSD，每個(gè)添加水平6個(gè)平行。在選定的色譜條件下，質(zhì)量濃度10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)測定5次，計(jì)算保留時(shí)間和峰面積的RSD。

1.7 LC-MS/MS確證方法

1.7.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX RX-SiL (2.1mm×150mm，5μm)；流動相：A：乙腈；B：5mmol/L乙酸銨溶液(含乙酸0.1%)；梯度洗脫：0～3min，95% A；4min，線性變化至10% A；7min，線性變回至95% A；7～12min，95% A，分析全部總時(shí)間為12min；流速：0～3min，0.3mL/min；4～12min，0.35mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL，自動進(jìn)樣。

1.7.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；電離電壓：5.85kV；檢測器電壓：1500V；干燥氣N2：20psi；霧化氣(N2)：50psi；碰撞氣Ar：2.0Torr；干燥氣溫度：350℃；定性離子對：m/z 127.0＞85.0，m/z 127.0＞68.0，毛細(xì)管錐孔電壓：55V，碰撞能量：分別為15eV和25eV，定量離子對：m/z 127.0＞85.0。采用同位素內(nèi)標(biāo)15N3- melamine校正，定性定量離子對：m/z 130.0＞87.0，毛細(xì)管錐孔電壓：55V，碰撞能量：25eV。

1.7.3 樣品處理

稱取需確證的雞蛋樣品2g(精確至0.0001g)于50mL離心管中，加入14mL乙腈水(70:30，V/V)，漩渦震蕩混勻30s，搖床振蕩20min，超聲波提取15min，然后于7000r/min離心5min。取上清液0.5mL，于2mL離心管中，加入496μL乙腈，加入三聚氰胺內(nèi)標(biāo)(15N3- melamine)4μL(10μg/mL)，漩渦混勻30s，于10000r/min離心10min，上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后上機(jī)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

據(jù)文獻(xiàn)資料顯示[16]，三聚氰胺應(yīng)用液相色譜DAD檢測器在線掃描，236nm波長處有最大紫外吸收峰，如圖1所示，王浩等[17]應(yīng)用紫外吸收光譜對三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行波長掃描，發(fā)現(xiàn)在240nm波長處有最大吸收峰，但是本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用具有波長掃描功能的美國貝克曼核酸蛋白儀對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行最大波長掃描，卻沒有得到這樣的結(jié)果，如圖2所示。分析原因，可能是樣品經(jīng)過帶有辛烷磺酸鈉(或庚烷磺酸鈉)的流動相作用后，經(jīng)DAD檢測器掃描能得到三聚氰胺的最大吸收峰，而普通的紫外分光光度計(jì)沒有這個(gè)功能，具體原因如何有待于進(jìn)一步研究。因此，結(jié)合其他文獻(xiàn)資料報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)選擇檢測波長為240nm。

圖1 DAD在線掃描三聚氰胺最大吸收波長Fig.1 UV absorption spectrum of melamine measured using DAD equipped to HPLC

圖2 紫外分光光度計(jì)掃描三聚氰胺的最大吸收波長Fig.2 UV absorption spectrum of melamine measured using UV spectrophotometer

本實(shí)驗(yàn)采用TC-C18(4.6mm×150mm，5μm)色譜柱、ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)色譜柱、HC-C8(4.6mm×150mm，5μm)色譜柱，對三聚氰胺添加量為5mg/kg的雞蛋進(jìn)行測試，C18色譜柱采用辛烷磺酸鈉流動相，C8色譜柱采用庚烷磺酸鈉流動相，結(jié)果C18柱的三聚氰胺保留時(shí)間在12min左右，峰型對稱，C8色譜柱的三聚氰胺保留時(shí)間在8min左右，峰型對稱，測定的結(jié)果分別為4.868、4.858mg/kg和4.916mg/kg，CV=0.63%。因此，3種類型色譜柱對三聚氰胺的測定影響不大，本實(shí)驗(yàn)樣品的測定采用TC-C18色譜柱。

2.2 固相萃取柱的選擇

因?yàn)槿矍璋肥菈A性化合物，所以應(yīng)采用陽離子固相萃取柱凈化。本實(shí)驗(yàn)比較PCX固相萃取柱和HR-XC固相萃取柱的凈化效果。兩種SPE柱均能有效的去除雞蛋樣品中的雜質(zhì)，使三聚氰胺的色譜峰不受干擾。應(yīng)用此兩種類型的SPE小柱對添加了5mg/kg的空白雞蛋進(jìn)行測試，結(jié)果分別為4.834mg/kg和4.841mg/kg，CV=0.1%。應(yīng)用PCX固相萃取柱凈化比HR-XC固相萃取柱凈化得到的雜質(zhì)峰少，因此，本實(shí)驗(yàn)樣品測定采用PCX固相萃取柱對雞蛋樣品進(jìn)行凈化。

混合型陽離子交換柱的規(guī)格決定了上柱的樣品量，如果上樣量過大，萃取柱不能完全保留，會導(dǎo)致部分雞蛋中三聚氰胺損失，使測定結(jié)果偏小。尤其是飼喂了添加高劑量三聚氰胺飼料的雞所產(chǎn)的蛋，三聚氰胺的含量可能會比較高，測定這樣的雞蛋樣品時(shí)，更要慎重選擇樣品的上樣量，最好選用500mg、3mL規(guī)格的萃取柱。測定市售雞蛋中三聚氰胺的殘留，一般選用60mg、3mL規(guī)格的萃取柱。本實(shí)驗(yàn)選用60mg、3mL的萃取柱，上樣量為3mL，測定5、10、20mg/kg的添加水平的雞蛋樣品回收率達(dá)到了87.5%。

2.3 雞蛋樣品提取時(shí)間的確定

為了確定NY/T1372—2007《飼料中三聚氰胺的測定》[3]中設(shè)定的提取時(shí)間20min是否能將雞蛋中的三聚氰胺提取完全，本實(shí)驗(yàn)將3份添加了5mg/kg的空白雞蛋置于超聲波提取器中，分別提取20、25min和30min，測定雞蛋中三聚氰胺含量，最終測定結(jié)果分別為4.86、4.88mg/kg和4.65mg/kg，CV= 2.7%。測定結(jié)果表明提取時(shí)間增加并未顯著增加提取效果，甚至?xí)邢陆第厔?，因此超聲提?0min已可以將雞蛋樣品中三聚氰胺提取完全。

2.4 線性關(guān)系和檢出限

在1.5節(jié)色譜條件下進(jìn)樣20μL，測定1、5、10、25、50μg/mL 5個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以三聚氰胺的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，回歸方程為Y=76.832679X＋3.87297，相關(guān)系數(shù)R2=1.00000。說明三聚氰胺在1～50μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)品圖譜與雞蛋樣品圖譜分別如3、4所示。從圖4可以看出，應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)條件測定雞蛋中三聚氰胺，三聚氰胺可與其他雜質(zhì)分開，峰形對稱。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品圖譜Fig.3 Chromatogram of melamine standard

本方法的檢出限的確定是將質(zhì)量濃度為1μg/mL的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品上機(jī)測定，測定其信噪比為11.7，最低檢測限為0.25μg/mL。因樣品處理時(shí)，上SPE小柱樣品量為3mL，氮?dú)獯蹈珊髴?yīng)用上機(jī)溶液定容到1mL，故轉(zhuǎn)換成實(shí)際樣品的最低檢測限量為0.54mg/kg。

圖4 樣品圖譜Fig.4 Chromatogram of egg sample

2.5 方法的精密度和回收率

在選定的色譜條件下進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，3個(gè)添加水平分別為5、10、20mg/kg，按照樣品處理方法進(jìn)行提取凈化，測定三聚氰胺含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。三聚氰胺添加回收率在72.8%～87.6%，RSD(n=6)為1.5%～4.0%，方法的回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差符合國內(nèi)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)的要求。在選定的色譜條件下，質(zhì)量濃度10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)測定5次，保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為0.12%和2.98%(n=5)。因此，本方法具有很高的靈敏度與精密度，重復(fù)性好，回收率穩(wěn)定，可以為雞蛋樣品中三聚氰胺的測定和初篩提供參考方法。運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對實(shí)驗(yàn)所得的上百個(gè)雞蛋樣品進(jìn)行測定，數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。

表1 雞蛋樣品中三聚氰胺的添加回收率(n=6)Table 1 Spike recoveries of melamine from egg sample (n=6)

另外，是樣品測定過程中，污染常會導(dǎo)致假陽性結(jié)果。由于三聚氰胺是制造塑料的原材料之一，使用塑料材料的實(shí)驗(yàn)器皿如離心管、槍頭、固相萃取柱等，必須確保該器皿在制造的時(shí)候沒有添加三聚氰胺。否則，在樣品處理的時(shí)候，塑料中的三聚氰胺會被溶解出來，導(dǎo)致假陽性的結(jié)果。根據(jù)目前的國標(biāo)和農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)方法，要特別注意塑料離心管和固相萃取小柱的柱管、篩板的材料。交叉污染也是假陽性結(jié)果的一個(gè)重要原因。一切重新使用的實(shí)驗(yàn)器皿都要用乙腈和水溶液清洗過，避免交叉污染。還有進(jìn)樣針在檢測下一個(gè)樣品的時(shí)候確保已經(jīng)清洗干凈。由于三聚氰胺的黏性很強(qiáng)，容易粘在實(shí)驗(yàn)器皿上，塑料器皿則更容易，會導(dǎo)致回收率偏低。避免這種干擾的最好辦法是徹底清洗。對于避免假陽性結(jié)果的方法，除了減少污染還應(yīng)采用LC-MS或者GC-MS的方法進(jìn)行確證。

2.6 LC-MS/MS方法的確證

LC-MS/MS作為確證方法需要滿足以下條件：1)試劑空白和樣品空白不能出現(xiàn)與陽性對照相同的離子峰；2)特征離子色譜峰的信噪比(RSN)應(yīng)在3以上；3)試樣色譜峰的保留時(shí)間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間一致，容許偏差為±2.5%；4)在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的定性離子均出現(xiàn)，而且所選擇的離子的相對豐度與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液的對應(yīng)離子的相對豐度相差不大于20%。在同時(shí)滿足上述4個(gè)條件時(shí)，可判斷雞蛋樣品中存在三聚氰胺。

圖5 50ng/mL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品的MRM圖Fig.5 Multiple reaction monitoring (MRM) chromatogram and MS spectrum of 50 ng/mL melamine

圖6 試劑空白液相色譜圖Fig.6 MRM chromatogram and MS spectrum of reagent blank

圖7 雞蛋樣品空白液相色譜圖Fig.7 MRM chromatogram and MS spectrum of egg sample blank

圖8 待確證雞蛋樣品MRM圖Fig.8 MRM chromatogram and MS spectrum of real egg sample

圖5 為50ng/mL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品的MRM圖。試劑空白和樣品空白MRM圖如圖6和圖7所示，由圖可看出試劑空白和空白雞蛋樣品只出現(xiàn)了校正內(nèi)標(biāo)15N3- melamine130.0＞87.0離子峰，未出現(xiàn)m/z 127.0＞85.0、m/z 127.0＞68.0的定性離子峰。待確證雞蛋樣品MRM圖如圖8所示，定性離子m/z 127.0＞85.0、m/z 127.0＞68.0離子峰均出現(xiàn)，且信噪比(RSN)分別為3393和1504，均大于3。m/z 127.0＞85.0、m/z 127.0＞68.0離子峰保留時(shí)間為6.225min，與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相差0.016%。離子豐度與標(biāo)準(zhǔn)品基本一致。該雞蛋中三聚氰胺定量測定含量為1.023mg/kg，與高效液相色譜方法測定的結(jié)果(1.018mg/kg)基本一致。除了滿足以上4個(gè)條件外，已經(jīng)另有實(shí)驗(yàn)證明該LC-MS/MS方法靈敏度高，檢測限低，采用同位素內(nèi)標(biāo)定量準(zhǔn)確，因此，本實(shí)驗(yàn)的LC-MS/MS法能夠作為HPLC測定雞蛋中三聚氰胺的確證方法，并證實(shí)HPLC的準(zhǔn)確性。

2.7 三聚氰胺能量的測定

為了全面了解三聚氰胺的理化性質(zhì)，為添加三聚氰胺的危害提供數(shù)據(jù)，本實(shí)驗(yàn)使用能量測定儀對三聚氰胺進(jìn)行總能測定。測定結(jié)果三聚氰胺的平均能量為3593.81cal/g，RSD為0.30%(n=5)。據(jù)資料顯示[18]，蔗糖能量為3945cal/g，三聚氰胺的能量值只比蔗糖低351.19cal/g，因此三聚氰胺的能量較高。由于三聚氰胺中的氮為非蛋白氮，添加于飼料當(dāng)中，進(jìn)入動物體內(nèi)并不能轉(zhuǎn)化成可利用的能量，但是三聚氰胺如此高的能量，如果添加量高會給飼料總能的測定帶來很大干擾，甚至?xí)?dǎo)致消化能、代謝能的計(jì)算錯(cuò)誤，從而導(dǎo)致畜禽能量不足。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過確定檢測波長、色譜柱、固相萃取柱和樣品提取時(shí)間建立雞蛋中三聚氰胺的HPLC檢測方法，并采用LC-MS/MS法確證。方法具有靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，且方法簡便、快速，適合雞蛋中三聚氰胺的測定。另外，三聚氰胺按照總能的測定方法，總能較高，對于評估飼料中的總能等有較大干擾。

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Determination of Melamine in Chicken Eggs by High Performance Liquid Chromatography

WU Cai-mei，BAI Jie，JIA Gang，ZHANG Ke-ying*，DING Xue-mei，BAI Shi-ping，CHEN Dai-wen，WU Xiu-qun
(Key Laboratory for Animal Disease-resistance Nutrition, Ministry of Education, Institute of Animal Nutrition,Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

A high performance liquid chromatography method was developed for the quantitative analysis of melamine in chicken eggs based on solid phase extraction. Samples were extracted with mixed trichloroacetic acid/ead acetate solution for 20 min, followed by clean up on a PCX solid phase extraction column. The chromatographic separation was achieved on a TC-C18 column (4.6 mm × 150 mm, 5μm) using a mobile phase composed of perfluorooctane sulfonate and citric acid buffer (10:90, V/V) at a flow rate of 1.0 mL/min. Melamine was detected at 240 nm and quantitatively determined using an external calibration method. The injection volume was 20μL. The linear range of the developed method was between 5 mg/kg and 20 mg/kg (R2＝1). The average recoveries for melamine were ranged from 72.8% to 87.6% with a relative standard deviation between 1.5% and 4.0% (n＝6) at the spiked levels of 5, 10 mg/kg and 20 mg/kg. The limit of detection for melamine was 0.54 mg/kg.

melamine；high performance liquid chromatography (HPLC)；solid phase extraction；chicken egg

TS207.5

A

1002-6630(2011)08-0212-07

2010-07-06

農(nóng)業(yè)部飼料中三聚氰胺限量制定專項(xiàng)

吳彩梅(1979—)，女，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)轱暳习踩c檢測技術(shù)。E-mail：zhuomuniao278@163.com*通信作者：張克英(1962—)，女，教授，碩士，研究方向?yàn)榍莸臓I養(yǎng)。E-mail：zkeying@yahoo.com