吳冬青，徐新建，張 麗，安紅鋼，林 敏

(河西學(xué)院化學(xué)系，甘肅 張掖 734000)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化竹節(jié)草黃酮提取工藝

吳冬青，徐新建，張 麗，安紅鋼，林 敏

(河西學(xué)院化學(xué)系，甘肅 張掖 734000)

研究超聲波輔助法提取竹節(jié)草黃酮工藝。利用響應(yīng)面分析法對(duì)影響竹節(jié)草黃酮得率的4個(gè)主要因素(提取時(shí)間、提取功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和固液比)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：最佳的竹節(jié)草黃酮提取工藝參數(shù)為提取時(shí)間39min、提取功率70W、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、固液比1:21(g/mL)。在此條件下黃酮得率實(shí)測(cè)值為20.07mg/g，實(shí)測(cè)值與回歸模型預(yù)測(cè)值(20.29mg/g)相對(duì)誤差為1.1%，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取條件可靠。

竹節(jié)草；黃酮；響應(yīng)面法；提取工藝

竹節(jié)草(Polygomun aviculane L.)，又稱(chēng)扁竹蓼、烏蓼、扁蓄等，為蓼科蓼屬植物，主要分布在我國(guó)的西部地區(qū)。其全草可入藥，是我國(guó)民間常用的一種中草藥，主治細(xì)菌性痢疾、腮腺炎等癥，也可用作婦科止血?jiǎng)1]。

黃酮類(lèi)化合物是植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在自然界分布廣泛，且具有顯著的抗炎、抗衰老、抗氧化等功效[2]。超聲波提取方法是新發(fā)展起來(lái)的一種提取物質(zhì)有效成分方法，具有提取時(shí)間短、得率高特點(diǎn)[3]。采用超聲波提取物質(zhì)有效成分是目前常用方法之一。本實(shí)驗(yàn)利用超聲波法提取竹節(jié)草中黃酮類(lèi)化合物，為確定竹節(jié)草黃酮類(lèi)化合物的最佳提取工藝，選擇提取時(shí)間、提取功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比為自變量，以竹節(jié)草黃酮得率為響應(yīng)值，借助Design Expert Version 7.1.6軟件設(shè)計(jì)進(jìn)行了中心組合試驗(yàn)，對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為竹節(jié)草黃酮的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

竹節(jié)草采集甘肅省隴南市成縣。

蘆丁(生化試劑) 中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司；95%乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WFJ2100型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海青浦滬西儀器廠(chǎng)；SN-2000直插式超聲波發(fā)生器 廣州辛諾科超聲設(shè)備公司。

1.3 方法

1.3.1 竹節(jié)草黃酮提取工藝[4-7]

工藝流程：竹節(jié)草→洗凈→晾干→粉碎→過(guò)60目篩→80%乙醇→浸泡1h→超聲→提取兩次→抽濾→濾液合并→減壓濃縮→定容→得黃酮備用液。

1.3.2 黃酮含量測(cè)定[4-7]

準(zhǔn)確移取質(zhì)量濃度0.5mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，分別置于10mL容量瓶中，加入5% NaNO20.5mL，搖勻，放置6min后，加入10%Al(NO3)30.5mL，搖勻，再放置6min，然后加4% NaOH溶液5mL，用30%乙醇定容，搖勻，放置10min后，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度(以試劑空白為參比)，以樣品質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)作圖，得回歸直線(xiàn)方程：A=0.4785x－0.006，R2=0.9997。

黃酮得率/(mg/g)=xd/m

式中：d為稀釋倍數(shù)，m為樣品質(zhì)量g。

1.3.3 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)[8-15]

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，借助Design Expert軟件，采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(central composite design，CCD)原理，選取提取時(shí)間、提取功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比為試驗(yàn)因素，以竹節(jié)草黃酮得率為試驗(yàn)指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 竹節(jié)草黃酮提取響應(yīng)面法試驗(yàn)的因素水平編碼Table 1 Factors and levels in central composite design

根據(jù)CCD中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，用統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert Version 7.1.6對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，可推測(cè)出最佳提取工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹節(jié)草黃酮提取響應(yīng)面法試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)與結(jié)果

按照CCD中心組合試驗(yàn)方案進(jìn)行4因素5水平試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

將表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用軟件Design Expert Version 7.1.6進(jìn)行多元回歸分析，各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值影響的回歸方程為：

4個(gè)試驗(yàn)因素均以量綱線(xiàn)性編碼處理，方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小能反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度。

表2 竹節(jié)草黃酮提取CCD響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Central composite design arrangement and experimental results

2.2 回歸方程的方差分析

表3 回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of regression equation for the yield of flavonoids

采用Design Expert Version 7.1.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表 3 可看出，X1、X4、X12、X22、X32、X42對(duì)黃酮得率的影響極顯著，X3對(duì)黃酮得率影響高度顯著，X1X4、X3X4兩個(gè)交互項(xiàng)對(duì)黃酮得率影響顯著，其他項(xiàng)系數(shù)均不顯著。擬合模型檢驗(yàn)極顯著(P＜0.001)，方程決定系數(shù)R2=0.9852，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合良好，可以用該方程代替真實(shí)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析。

2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

圖1 各因素交互作用對(duì)黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plot showing the effects of any two factors on the yield of flavonoids

根據(jù)回歸模型作出了各個(gè)因素交互作用的響應(yīng)曲面和等高線(xiàn)見(jiàn)圖1。

由圖1A可看出，提取時(shí)間和提取功率對(duì)黃酮得率的交互影響顯著。隨提取功率增大，黃酮得率先增后減；隨著提取時(shí)間增加，總黃酮得率也是先增后減，提取時(shí)間增長(zhǎng)，黃酮得率反而降低，這由于超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)有效成分結(jié)構(gòu)有所破壞。當(dāng)提取時(shí)間在40min左右和提取功率在70W左右區(qū)域范圍黃酮得率較高。

由圖1B可看出，提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的交互影響與圖1A相比較，對(duì)響應(yīng)值交互影響的范圍相對(duì)比較窄。當(dāng)提取功率、固液比不變的情況下，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取時(shí)間39min時(shí)，黃酮得率最佳。

由圖1C可看出，隨著提取時(shí)間增加，總黃酮得率是先增后減，但變化不很顯著；提取時(shí)間在35～40min區(qū)域黃酮得率隨固液比的增加而增加，但固液比大于1:27響應(yīng)值增加緩慢。溶劑量加大，會(huì)造成回收溶劑時(shí)間較長(zhǎng)，能源消耗較大。因此，從成本考慮溶劑加入量要適宜。

由圖1D可看出，提取功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的交互影響顯著，隨著提取功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，黃酮得率是一個(gè)升高而后又降低的過(guò)程。在提取功率為70W、乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%附近可達(dá)到響應(yīng)值最高點(diǎn)。

由圖1E可看出，黃酮得率與提取功率呈現(xiàn)較明顯的二次拋物線(xiàn)關(guān)系，固液比對(duì)黃酮得率的影響較提取功率顯著。提取功率在60～80W、固液比在1:25附近可達(dá)到響應(yīng)值最高點(diǎn)。

由圖1F可看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)和固液比對(duì)黃酮得率有交互影響，固液比對(duì)響應(yīng)值的影響明顯強(qiáng)于乙醇體積分?jǐn)?shù)，乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%～70%范圍內(nèi)，隨固液比增大響應(yīng)值增大，乙醇體積分?jǐn)?shù)在80%～90%范圍內(nèi)，隨固液比增大響應(yīng)值先增后降。經(jīng)分析，乙醇體積分?jǐn)?shù)在65%、固液比1:20附近響應(yīng)值可達(dá)到較高值。

總體來(lái)看，固液比4個(gè)試驗(yàn)因素中固液比對(duì)響應(yīng)值影響最為顯著。

2.4 提取條件優(yōu)化

為確定各因素的最佳取值，利用Design Expert軟件進(jìn)行嶺脊分析。通過(guò)分析，得出回歸模型存在最大值點(diǎn)，黃酮得率最大預(yù)測(cè)值為20.29mg/g，各因素X1(提取時(shí)間)、X2(提取功率)、X3(乙醇體積分?jǐn)?shù))、X4(固液比)對(duì)應(yīng)的編碼值分別為－0.08、－0.03、－0.47、0.28。其對(duì)應(yīng)的竹節(jié)草黃酮提取最佳工藝參數(shù)為提取時(shí)間39.2min，提取功率69.7W，乙醇體積分?jǐn)?shù)65.3%，固液比1:21.4。為了便于實(shí)際操作，最終確定竹節(jié)草黃酮提取最佳工藝參數(shù)為提取時(shí)間39min，提取功率70W，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，固液比1:21(g:mL)。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可行性，在以上優(yōu)化條件下進(jìn)行5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，理論值20.29mg/g與實(shí)驗(yàn)平均值20.07mg/g相對(duì)誤差為1.1%，說(shuō)明該方程與實(shí)驗(yàn)情況擬合很好，響應(yīng)面對(duì)竹節(jié)草黃酮提取工藝的優(yōu)化是可行的，得到的黃酮提取工藝具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

3.1 采用響應(yīng)面法對(duì)影響竹節(jié)草黃酮提取工藝的提取時(shí)間、提取功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比4個(gè)主要因素進(jìn)行方差分析。結(jié)果表明：X1、X4、X12、X22、X32、X42對(duì)黃酮得率的影響極顯著；X3對(duì)黃酮得率的影響高度顯著；X1X4、X3X4對(duì)黃酮得率影響顯著，說(shuō)明試驗(yàn)因素與響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。方差分析顯示擬合模型檢驗(yàn)極顯著，同時(shí)決定系數(shù)為0.9852，說(shuō)明回歸方程能很好的預(yù)測(cè)竹節(jié)草黃酮得率隨各因素變化的規(guī)律。3.2 利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法建立了二次多項(xiàng)式模型，確定黃酮最佳提取工藝參數(shù)：提取時(shí)間39min，提取功率70W，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，固液比1:21(g/mL)，回歸模型預(yù)測(cè)黃酮得率(20.29mg/g)與實(shí)驗(yàn)平均值(20.07mg/g)相對(duì)誤差1.1%，表明將響應(yīng)面設(shè)計(jì)引用到竹節(jié)草黃酮提取工藝研究可行、結(jié)果可靠。

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Optimization of Extraction Process for Flavonoids from Polygomun aviculane L. by Response Surface Methodology

WU Dong-qing，XU Xin-jian，ZHANG Li，AN Hong-gang，LIN Min
(Department of Chemistry, Hexi University, Zhangye 734000, China)

Ultrasound assistance was applied to extract flavonoids from Polygomun aviculane L. using aqueous ethanol as extraction solvent. Four main factors (extraction time, ultrasound power, ethanol concentration and solid-to-liquid ratio) affecting the yield of flavonoids were optimized by response surface methodology. The results showed that the optimal extraction conditions were extraction time of 39 min, ultrasound power of 70 W, ethanol concentration of 65%, and solid-to-liquid ratio of 1:21 (g/mL). Under these conditions, the observed yield of flavonoids was 20.07 mg/g, and the relative error in comparison with the predicted one was 1.1%, suggesting that the optimal extraction conditions are reliable.

Polygomun aviculane；flavonoids；response surface method；extraction technique

TS201.1

A

1002-6630(2011)08-0125-04

2010-07-04

甘肅省高等學(xué)校研究生導(dǎo)師科研項(xiàng)目(1009-08)；

甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室面上項(xiàng)目(XZ1008)

吳冬青(1961—)，女，教授，本科，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物有效成分提取、純化和分析。E-mail：hxuwdq@163.com