戴喜末，熊子文，羅麗萍*

(南昌大學生命科學與食品工程學院，江西 南昌 330031)

響應面法優(yōu)化野艾蒿多糖的超聲波提取及其抗氧化性研究

戴喜末，熊子文，羅麗萍*

(南昌大學生命科學與食品工程學院，江西 南昌 330031)

為確定野艾蒿多糖超聲波提取的最佳工藝條件，利用中心組合(Box-Behnken)試驗設計原理，采用三因素三水平響應面分析法，獲得多元二次線性回歸方程，以多糖提取率為響應值作響應面和等高線圖，并考察野艾蒿多糖的體外抗氧化活性。結果表明：野艾蒿多糖最佳超聲波提取工藝條件為超聲時間35min、提取溫度70℃、水料比40:1(mL/g)，在此工藝條件下，多糖得率6.44%與理論預測值6.71%的相對誤差為4.02%，擬合度較好。野艾蒿多糖的總抗氧化能力較強，對DPPH自由基具有一定的清除能力。

野艾蒿；多糖；響應面法；超聲波提??；抗氧化性

野艾蒿(Artemisia lavandulaefolia)為菊科蒿屬多年生草本植物，在全國多數(shù)省份均有分布，資源量巨大。有強烈的揮發(fā)性氣味，富含揮發(fā)油、有機酸、生物堿、黃酮類、萜類及其化合物，有散寒、祛濕、溫經(jīng)、止血作用。野艾蒿的嫩苗還可鮮食或腌制醬菜，曾作救荒本草使用[1]。

超聲輔助提取技術是近年來新發(fā)展起來的一種方法，相比于其他傳統(tǒng)水浸提法、索氏提取法，具有選擇性高、能耗低、效率高等優(yōu)點，已被應用于植物活性成分的提取[2-4]。響應面分析(response surface analysis methodology，RSM)是利用合理的試驗設計并通過試驗得到一定的數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸的方法，將多因子試驗中因子指標的相互關系用多項式近似擬合，通過對函數(shù)響應面和等高線的分析，能夠精確地研究各因子與響應值之間的關系，以最經(jīng)濟的方式對所選試驗參數(shù)進行全面的分析和研究，已越來越多地應用于各種生物化工處理過程的優(yōu)化[5-6]。

目前有不少關于野艾蒿的同屬植物艾葉(Artemisiae argyi)的研究。沈霞等[7]研究發(fā)現(xiàn)艾葉多糖具有很好的抗氧化、抗腫瘤活性和免疫促進作用，但關于野艾蒿多糖的提取及生物活性的研究尚未見報道。本研究以我國豐富的野艾蒿資源的莖葉為實驗材料，利用中心組合(Box-Behnken)試驗設計原理，采用三因素三水平的響應面分析法，從中提取其活性多糖，獲得野艾蒿多糖的超聲波提取最佳工藝條件，并研究野艾蒿多糖的體外抗氧化活性，以期為更好地開發(fā)野艾蒿資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮野艾蒿莖葉(由江西省杭蓮生態(tài)農業(yè)公司提供，采收于4月中旬)：在65℃烘箱中經(jīng)24h烘干后，用粉碎機粉碎，置于干燥器中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1,1-二苯基苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH) 美國Sigma公司；苯酚、無水乙醇、濃硫酸、甲醇、三氯乙酸、正丁醇、丙酮、鐵氰化鉀、葡萄糖均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

JA1003N電子天平 上海精密科學儀器有限公司；GZX-DH-50-55-s電熱恒溫干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇國華電器有限公司；7200可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；SHB-IIIA型循環(huán)水式多用真空泵 河南太康教材儀器廠；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器 江蘇昆山市超聲儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 野艾蒿多糖的制備

精確稱取野艾蒿粉末4.0g，按實驗方法加入水后，放入超聲波清洗器中(超聲頻率40kHz，100%輸出功率)，超聲一定時間后，進行抽濾，濾液用旋轉蒸發(fā)儀蒸干，稱得干質量，再用蒸餾水定容至25mL，得野艾蒿樣品溶液。

1.3.2 標準曲線的繪制[8-10]

精密稱取105℃干燥至質量恒定的葡萄糖10.00mg，置100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配得葡萄糖標準溶液。精密吸取葡萄糖標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，分別置于10mL容量瓶中，加入蒸餾水補至2mL，然后再加入5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0mL。搖勻，沸水浴20min后，在冷水中冷卻至室溫。在490nm波長處測吸光度。同時用2.0mL蒸餾水做空白對照。得標準曲線方程：C=0.0645A－0.0008，r2=0.9995。說明葡萄糖在所取的質量濃度范圍內，其質量濃度和吸光度呈良好線性關系。

1.3.3 野艾蒿多糖的測定[11]

準確吸取0.6mL野艾蒿樣品溶液于50mL容量瓶中，用蒸餾水定容，取2.0mL該溶液，采用苯酚-硫酸法，用分光光度計測定吸光度，通過所得葡萄糖標準曲線計算出多糖的含量，根據(jù)下式計算多糖得率：

式中：比色皿測定的多糖質量濃度/(mg/mL)；樣品溶液稀釋倍數(shù)為125；樣品溶液體積為25mL；實驗樣品質量為4.0g。

1.3.4 提取工藝優(yōu)化

根據(jù)中心組合試驗設計原理(Box-Behnken)，采用三因素三水平的響應面分析方法。在預實驗的基礎上，自變量的試驗水平分別以－1、0、1進行編碼，設計15個試驗點，試驗因素安排見表1。

表1 野艾蒿多糖提取試驗因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface design

1.3.5 野艾蒿多糖的精制

采用Sevag法脫蛋白：上清液濃縮至一定體積后，用4倍體積的無水乙醇醇沉，于冰箱冷藏24h后抽濾取沉淀，得野艾蒿粗多糖。野艾蒿粗多糖加水溶解，配制Sevag溶液(氯仿:正丁醇=4:1(V/V))，按粗多糖溶液:Sevag溶液=4:1(V/V)搖勻20min，5000r/min離心10min，取上清液，重復操作3次，上清液用4倍體積的無水乙醇醇沉，置于冰箱中24h，高速離心去上清溶液，沉淀復溶。

采用活性炭脫色：已脫蛋白的粗多糖提取液加入2g/100mL活性炭，加熱70℃脫色50min，趁熱過濾，濾液濃縮至15mL體積后加4倍體積的乙醇沉淀，靜置后抽濾，沉淀分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3次，凍干得野艾蒿多糖粉末。用于抗氧化活性測定。

1.3.6 野艾蒿多糖的總抗氧化能力測定

采用普魯士蘭法。取一定質量濃度的樣品溶液1mL，加入0.2mol/L、pH6.6的磷酸鹽緩沖液和1%的K3Fe(CN)6溶液各2.5mL并混合均勻，50℃水浴20min后加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液，混合后靜置10min。取上清液7.5mL，加7.5mL雙蒸水和1mL 0.1% FeCl3混合均勻，10min后700nm處測定吸光度，以蘆丁做陽性對照。野艾蒿多糖的總抗氧化能力以多糖質量濃度-吸光度線性回歸方程斜率K表示[12]。

1.3.7 野艾蒿多糖對DPPH自由基的清除作用

取0.0049g DPPH用甲醇定容至100mL容量瓶中，配成濃度為0.124mmol/L DPPH甲醇溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。取0.1mL質量濃度分別20、10、5、2.5、1.25、0.625mg/mL多糖溶液分別加入試管中，再加入3.9mL DPPH溶液，室溫黑暗中反應90min，以蒸餾水做空白對照，在517nm波長處測吸光度。

I/%=[(A0－ As)/A0]× 100

式中：I為DPPH自由基清除率/%；A0為空白樣品的吸光度；AS為不同質量濃度的被測混合物的吸光度。

50%抑制濃度IC50可通過自由基清除活性-樣品濃度的線性關系求出[13]。

2 結果與分析

2.1 野艾蒿多糖得率回歸模型的建立及顯著性檢驗

按照Box-Behnken試驗方案進行三因素三水平試驗，結果見表2。將所得的實驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 7.1.3軟件進行多元回歸擬合，得到以多糖得率(Y)為目標函數(shù)的二次回歸方程：多糖得率對超聲時間(X1)、提取溫度(X2)和水料比(X3)的二次多項回歸方程：

式中的超聲時間X1、提取溫度X2和水料比X3在設計中均經(jīng)量綱線性編碼處理，因此方程中各項系數(shù)絕對值的大小直接反映了各因素對指標值的影響程度，系數(shù)的正負反映了影響的方向。

表2 野艾蒿多糖得率提取Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Scheme and experimental results of response surface design

為了檢驗方程的有效性，對野艾蒿多糖提取的數(shù)學模型進行方差分析，結果見表3。由表3可知，一次項中X1、X2、X3的影響極顯著，其中提取溫度對野艾蒿多糖得率的影響最顯著，其次是水料比，最后是提取時間。交互項X1X2的影響極顯著，說明超聲時間與提取溫度對多糖得率有顯著影響；二次項中X12、X22的影響均達極顯著水平。多糖得率顯著性檢驗F＝131.08＞F0.01(14,15)，表明失擬項影響很小，方程高度顯著。模型的R2Adj為0.9882，說明該模型能反映98.82%響應值的變化，因而該模型擬合程度較好，實驗誤差小，較好地反映了野艾蒿多糖得率與超聲時間、提取溫度和水料比關系，因此可以用此模型對野艾蒿多糖提取進行分析和預測。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for regression equation

2.2 野艾蒿多糖的響應面分析與優(yōu)化

圖1 野艾蒿多糖超聲提取的響應曲面圖Fig.1 Response surface plots showing the pairwise effects of extraction time, temperature and ratio of water to material on the extraction rate of polysaccharides

從圖1a可知，多糖得率隨超聲時間的延長和溫度的提高呈先上升后下降的趨勢，且二者有明顯的交互作用。根據(jù)提取動力學理論，時間的延長有助于多糖的充分擴散析出，同時溫度的升高使得分子解附和擴散運動速度加快，多糖的析出速率和得率提高，因此適當延長時間和提高溫度有助于提高多糖得率。

從圖1b可知，多糖得率隨著水料比和溫度的增加也呈先升后降的趨勢。水料比一定時，在高溫區(qū)和低溫區(qū)的多糖得率較低，這主要是因為溫度的升高使得分子解附和擴散運動速度加快，從而提高了多糖的析出速率和得率，而溫度過高可能會影響破壞多糖結構，降低得率。水料比的增大，使得多糖的濃度更低，更容易從細胞中溶出。

從圖1c可知，超聲時間較長、較高條件下，多糖得率隨著水料比的增加而升高，隨超聲時間延長而先增加后減小。分析其主要原因是，超聲波可以使得野艾蒿的細胞破碎，使得野艾蒿多糖從細胞膜中析出，而超聲時間過長可能會破壞多糖，從而影響提取率。2.3 野艾蒿多糖最佳提取條件的確定和驗證實驗

在選取的各因素范圍內，根據(jù)回歸模型通過Design Expert軟件分析得出，野艾蒿多糖最佳提取條件為超聲時間35.3min、提取溫度70.46℃、水料比40:1(mL/g)，多糖得率的預測值為6.71%?？紤]到實際操作的便利，確定野艾蒿多糖的超聲波提取工藝條件為提取時間35min、提取溫度70℃、水料比40:1(mL/g)。為了證實預測結果，在最佳提取工藝條件下重復實驗3次，結果野艾蒿多糖平均得率為6.44%，與預測值為6.71%相差不大，說明該方程與實際情況擬合較好，充分驗證了所建模型的正確性，說明響應曲面法適用于對野艾蒿多糖的超聲波提取工藝進行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

2.4 野艾蒿多糖總抗氧化性的測定

根據(jù)Atmani等[12]所述，利用普魯士蘭法測定抗氧化劑活性時，反應液吸光度越大，抗氧化活性越強，即抗氧化劑濃度與吸光度線性關系斜率越大，其抗氧化能力越強。野艾蒿多糖抗氧化性曲線的斜率為0.2626，麗艷等[14]研究不同地區(qū)的蜂膠時發(fā)現(xiàn)黑龍江蜂膠總抗氧化能力最強，斜率為2.47，云南蜂膠總抗氧化能力最低，斜率為0.44，沈明花等[15]研究榛蘑多糖的斜率是0.6943。由此可見，野艾蒿多糖抗氧化性雖不及蜂膠等強抗氧化劑，但和榛蘑多糖相比，具有一定的抗氧化性。

2.5 野艾蒿多糖對DPPH自由基的清除作用

按照1.3.7節(jié)步驟，得出野艾蒿多糖對DPPH自由基清除率的線性方程為：y=0.0491x＋0.0364，R2=0.9906，說明自由基的清除率與樣品多糖的濃度呈良好的線性關系。由該方程可知，當抑制率50%時，IC50為9.44mg/mL，在多糖質量濃度0～10mg/mL時，抑制率隨著多糖質量濃度的增大而增強。

賀亮等[16]研究表明，苦楝子多糖IC50為5.02mg/mL；馬惠玲等[17]對蘋果渣果膠多糖研究發(fā)現(xiàn)，其中0.1mol/L鹽洗組IC50為11.5mg/mL。由此可知，雖然野艾蒿多糖的IC50略低于蘋果渣果膠多糖，但比苦楝子多糖的IC50高，說明野艾蒿多糖有一定的清除DPPH自由基能力。

3 結 論

利用軟件Design Expert進行試驗設計，采用響應曲面法建立野艾蒿多糖提取工藝條件的二次多項式數(shù)學模型，對各因素對響應值的影響進行分析。結果表明，模型擬合程度高，試驗誤差小，最佳的提取工藝條件為超聲時間35min、提取溫度70℃、水料比40:1(mL/g)，此工藝條件的多糖得率為6.44%，與預測值相差較小。對野艾蒿多糖的抗氧化性表明，野艾蒿多糖具有一定的總抗氧化能力，具有較強清除自由基的能力。因此，野艾蒿多糖可作為潛在天然抗氧化劑應用于食品和醫(yī)藥工業(yè)中，具有廣泛的開發(fā)價值。

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Response Surface Methodology for Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction and Antioxidant Evaluation of Polysaccharides from Artemisia lavandulaefolia Leaves and Stems

DAI Xi-mo，XIONG Zi-wen，LUO Li-ping*
(College of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China)

To optimize the ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from Artemisia lavandulaefolia leaves and stems,a multiple quadratic regression describing the relationship between the extraction rate of polysaccharides and extraction parameters such as extraction time, temperature and ratio of water to material was established using a 3-factor, 3-level Box-Behnken statistical design, and response surface and contour plots with the extraction rate of polysaccharides as the response were drawn based on the model. The optimum conditions for extracting polysaccharides from Artemisia lavandulaefolia leaves and stems were determined as follows: ultrasound treatment time 35 min, temperature 70 ℃ and ratio of water to raw material 40 mL/g. Under such conditions, the relative error between the experimental and theoretical extraction rates of polysaccharides was 4.02%,indicating that the goodness of fit of the established regression model is quiet good. Polysaccharides from Artemisia lavandulaefolia leaves and stems had strong total antioxidant capacity and showed scavenging ability towards DPPH free radicals.

Artemisia lavandulaefolia；polysaccharides；response surface analysis methodology (RSM)；ultrasoundassisted extraction；antioxidant activity

R284.2

A

1002-6630(2011)08-0093-05

2010-07-11

江西省科技廳攻關重大項目(S00343)

戴喜末(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為植物化學。E-mail：dai8905@126.com

*通信作者：羅麗萍(1972—)，女，教授，博士，研究方向為植物生物化學。E-mail：lluo2@126.com