張 笠，張延英 ，吳建軍，劉 潤

（1.甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物抗腫瘤機(jī)制的研究

張 笠1，張延英2，吳建軍2，劉 潤2

（1.甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

目的通過體外實(shí)驗(yàn)探索貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物抗腫瘤機(jī)制。方法用貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物給小鼠灌胃，觀察藥物對(duì)大鼠免疫功能的影響；同時(shí)用貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物給大鼠灌胃，制備藥物血清，在體外觀察貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物對(duì)K562細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物對(duì)小鼠Mф表面Ia抗原表達(dá)陽性率與正常對(duì)照組對(duì)比P<0.05，3種濃度的貞芪酪蛋白肽血清中以30%貞芪酪蛋白肽血清抑制率最高。結(jié)論貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物能夠促進(jìn)小鼠Mф細(xì)胞系統(tǒng)Ⅰ類抗原表達(dá)，貞芪酪蛋白肽血清對(duì)K562細(xì)胞體外增殖有抑制作用。

貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物；抗腫瘤機(jī)制；免疫功能

貞芪酪蛋白肽是根據(jù)“扶正培本、扶正祛邪”的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論，以黃芪（Astragalus Membranaceus，AM）、女貞子（Ligustrum Lucidum，LL）及酪蛋白復(fù)合多肽等組方經(jīng)特定制劑工藝研制而成，是在長期醫(yī)療實(shí)踐中篩選的一種臨床抗癌驗(yàn)方。該方劑符合中醫(yī)組方原則，是針對(duì)惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制而形成的。酪蛋白復(fù)合多肽在保健品、醫(yī)藥等多領(lǐng)域起著特殊的作用。近十多年來，肽在人體中的作用已引起科學(xué)界的高度重視，大量研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)攝入后，并不能完全水解成氨基酸，而是大部分以肽的形式被吸收；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，多肽被吸收的速度比同組成的氨基酸要快[1]，酪蛋白是牛奶中的主要組成成分，它是一組蛋白的磷酸鹽，由4種成分組成：αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白。酪蛋白肽具有抗誘變、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老、抗過敏性、抗高血壓、促進(jìn)激素分泌和細(xì)胞繁殖、保護(hù)表皮細(xì)胞、防止黑色素沉淀等多種功效[2～4]。本研究應(yīng)用傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論將酪蛋白與黃芪、女貞子配制成復(fù)合物，對(duì)其抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行探索。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞

昆明種小鼠50只，SPF級(jí)，體重18～20 g，SD雄性大鼠30只，體重150～200 g，SPF級(jí)，購自甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，制備藥物血清用。制備藥物血清的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行；人白血病細(xì)胞株K562由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所饋贈(zèng)，用含10%小牛血清和雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代一次。

1.2 藥物與試劑

貞芪酪蛋白復(fù)合肽由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心配制。臨用時(shí)用蒸餾水稀釋成所需濃度（實(shí)驗(yàn)所用劑量均以生藥計(jì)）。小牛血清（Fetal Calf Serum，F(xiàn)CS）購于杭州四季青公司，RPMI-1640培養(yǎng)基干粉為Gibco公司產(chǎn)品，噻唑蘭（MTT）由華美生物工程公司提供，胰蛋白酶由美國Gtbcg公司提供，注射用卡鉑批號(hào)20100112，江蘇恒瑞藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

用貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物給SPF級(jí)小鼠和大鼠灌胃，分為高劑量組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物8g/kg·d）、中劑量組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物4g/kg·d）、低劑量組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物2g/kg·d）以及正常對(duì)照組（生理鹽水）、貞芪扶正顆粒組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物15g/kg·d）共5個(gè)組；體外貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物藥物血清試驗(yàn)血清濃度分別稀釋為10%、20%、30%和K562細(xì)胞對(duì)照組以及正常對(duì)照組這5個(gè)組。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用mean±sd表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)多組之間用多因素方差分析，兩兩比較用SNK法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物對(duì)小鼠免疫功能的影響

將小鼠分為以下5組：正常對(duì)照組（灌胃生理鹽水）、貞芪扶正顆粒組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物15g/kg·d）、低劑量組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物2g/kg·d）、中劑量組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物4g/kg·d）、高劑量組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物8g/kg·d），每組10只小鼠，用以上劑量給小鼠灌胃4 d后采血，分離血清測定Mφ表面Ia抗原表達(dá)的陽性率，并解剖小鼠分離其脾臟與胸腺，稱重后計(jì)算其胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)（見表 1、表 2）。

表1 貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物對(duì)小鼠Mφ表面Ia抗原表達(dá)陽性率的影響（mean±sd）

表2 貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物對(duì)小鼠免疫器官重量的影響（mean±sd）

2.2 貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物藥物血清對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響

將大鼠分為以下5組：正常對(duì)照組（灌胃生理鹽水）、貞芪扶正顆粒組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物15g/kg·d）、低劑量組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物2g/kg·d）、中劑量組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物4g/kg·d）、高劑量組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物8g/kg·d）。每組10只，用以上劑量給大鼠灌胃8d后采血，在恒溫4℃狀態(tài)靜置3 h，以1 500 r/min離心，然后分離血清，在56℃靜置30 min滅活補(bǔ)體，以0.22 nm濾膜抽濾除菌。然后將藥物血清濃度分別稀釋為10%、20%、30%和K562細(xì)胞對(duì)照組以及正常對(duì)照組共5個(gè)組進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 各組K562細(xì)胞增殖情況比較（n=10，±s）

表3 各組K562細(xì)胞增殖情況比較（n=10，±s）

注：與對(duì)照組對(duì)比，▲P<0.05，▲▲P<0.01

組別 吸光率A值 抑制率（%）K562細(xì)胞對(duì)照組正常對(duì)照組藥物血清組10%藥物血清組20%藥物血清組30%-1.02 38.52 57.09 68.35±0.04±0.03▲±0.04▲▲±0.02▲▲±0.04▲▲0.81 0.86 0.53 0.43 0.36

由表3可見，生理鹽水血清對(duì)K562細(xì)胞生長無抵制作用，3種濃度的貞芪酪蛋白肽血清中以30%貞芪酪蛋白肽血清抑制率最高。說明貞芪酪蛋白肽血清濃度為10%、20%、30%時(shí)其抑制率有劑量反應(yīng)依賴關(guān)系。

3 討論

腫瘤的發(fā)生是多種基因的異常表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的結(jié)果，因此，有效控制腫瘤細(xì)胞的異常凋亡是治療腫瘤的有效途徑。近年來，從傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中發(fā)掘新的抗癌藥物用于腫瘤治療已成為趨勢，中藥的抗癌效應(yīng)正受到越來越多的關(guān)注。惡性腫瘤屬于中醫(yī)學(xué)癥瘕、積聚、噎嗝、虛勞、乳巖等范疇，其病機(jī)主要是瘀血內(nèi)停、痰濕停聚、氣血陰陽虧虛，治則主要為活血化瘀、燥濕化痰、清熱解毒、扶正固本、以毒攻毒等。中藥是我國治療腫瘤的傳統(tǒng)方法，中藥治療疾病的主要方法是復(fù)方，因中藥復(fù)方是一個(gè)有機(jī)整體，可互增療效，以最大限度地治療疾病。

本研究發(fā)現(xiàn)，貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物能夠促進(jìn)小鼠Mφ細(xì)胞系統(tǒng)Ⅰ類抗原表達(dá)，說明貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物可以提高免疫功能。貞芪酪蛋白肽血清對(duì)K562細(xì)胞體外增殖的抑制作用及初步顯示的劑量反應(yīng)關(guān)系進(jìn)一步證明其具有抗腫瘤作用。

綜上所述，筆者認(rèn)為誘導(dǎo)凋亡是貞芪酪蛋白肽對(duì)K562細(xì)胞體外抑制增殖作用的重要分子機(jī)制。但實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，隨著貞芪酪蛋白肽血清濃度的增加，出現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)，對(duì)K562細(xì)胞的抵制率有明顯增高。筆者認(rèn)為這可能是由于貞芪酪蛋白肽血清濃度及作用時(shí)間不同所產(chǎn)生的效應(yīng)差異，高濃度或長時(shí)間作用更容易導(dǎo)致細(xì)胞壞死而非凋亡；相對(duì)低濃度和短時(shí)間作用更易引起細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的改變，如細(xì)胞凋亡，而非細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)和功能的喪失，這一點(diǎn)對(duì)于指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。

[1]龐廣昌，王秋韞.生物活性肽的研究進(jìn)展理論基礎(chǔ)與展望[J].食品科學(xué)，2001，2（26）：45～47.

[2]汪永鋒，張延英.貞芪酪蛋白肽對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用[J].中醫(yī)研究，2006，19（3）：22～23.

[3]張延英，朱建坤，吳建軍，等.貞芪酪蛋白肽藥物血清誘導(dǎo)Bel 7402細(xì)胞分化的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14（9）：47～49.

[4]高莉，任潤珍，吳建軍，等.貞芪酪蛋白肽復(fù)合物血清對(duì)A549細(xì)胞抑制及其作用機(jī)制研究[J].中國醫(yī)藥與臨床研究，2009，15（6）：1～4.

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1671-1246（2011）02-0100-02