韓 櫻，何 慧，程海霞，呂 杰，張文君

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070)

蛋清肽-ZN（Ⅱ）配合物的制備

韓 櫻，何 慧*，程海霞，呂 杰，張文君

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070)

為了獲得高生物效價的補(bǔ)鋅制劑，以蛋清肽為原料，產(chǎn)物中鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為測定指標(biāo);通過單因素實驗和正交實驗，確定生成配合物的最優(yōu)條件，并采用紅外光譜法比較了反應(yīng)前后圖譜的變化。結(jié)果表明，獲得配合物的最優(yōu)條件為:多肽反應(yīng)液初始濃度4%，肽鋅(ZnCl2)質(zhì)量比3.5∶1，pH為6.0，溫度40℃，反應(yīng)時間40min，最優(yōu)條件下制得的產(chǎn)物中鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.25%;紅外圖譜分析表明兩者可能形成了雙單齒配位化合物。蛋清肽鋅配合物可作為一種新的補(bǔ)鋅劑。

蛋清肽，肽－Zn配合物，制備

雞蛋清中的成分除水外主要為蛋白質(zhì)，其中含有八種人體必需氨基酸，且比例均衡，氨基酸評分與人乳相近，營養(yǎng)價值極高。由于我國某些飲食習(xí)慣和一些行業(yè)的特殊需求，比如做月餅等，對蛋黃的需求量較大，如何利用余下的蛋清并提高其附加值，是值得研究的課題。將蛋清蛋白進(jìn)行酶解可有效地改變其理化性質(zhì)，并獲得具有生理調(diào)節(jié)作用的活性肽，有利于提高其附加值。鋅是人和動物必需的微量元素，缺鋅會導(dǎo)致多種疾病發(fā)生。鋅也是中國人普遍缺乏的微量元素，早在上世紀(jì)六、七十年代就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)有些氨基酸和小肽配合，具有促進(jìn)鋅吸收的作用。根據(jù)小肽的吸收轉(zhuǎn)運機(jī)制和微量元素的吸收機(jī)理［1］，小肽與金屬離子形成的配合物比氨基酸與之形成的配合物更易被吸收［2］。已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn):當(dāng)Zn2+與肽結(jié)合形成肽－鋅配合物后，在提高動物生長繁殖［3］、增強(qiáng)抗病免疫力［4］、調(diào)節(jié)生理代謝［5］等諸方面都有重要生理作用。因此，開發(fā)兼具營養(yǎng)性和生理調(diào)節(jié)功能的促進(jìn)微量元素吸收的蛋清肽，并進(jìn)一步制得高生物效價的補(bǔ)鋅產(chǎn)品——蛋清肽－鋅配合物，具有良好的應(yīng)用前景。目前，Zn(II)與大豆多肽［6］、羅非魚皮肽［7］、米蛋白肽［8］形成配合物的研究已有報道，但尚未見制備蛋清肽－鋅配合物的研究報道。本實驗以雞蛋清為原料，初步研究了蛋清肽與Zn(Ⅱ)形成配合物的條件，旨在為其在食品、醫(yī)藥、保健品方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋 購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)中百超市;Neutrase中性蛋白酶、Alcalase堿性蛋白酶 丹麥Novo公司;氫氧化鈉、鹽酸、氯化鋅、鉻黑 T、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、碳酸鈣、95%乙醇、無水乙醇、三乙醇胺、氨水、氯化銨 均為國產(chǎn)分析純。

ALPHA 1－4LD真空冷凍干燥機(jī) 德國Marin Christ公司;PB－10酸度計 德國SARTORIUS股份公司;DF－101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;TDL－5A臺式低速離心機(jī)

上海菲恰爾分析儀器有限公司;Nexus 470 FT－IR型傅立葉紅外光譜儀 美國NICOLET公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋清肽的制備 用本實驗室前期工作中建立的方法制備蛋清肽:

雞蛋→分離得蛋清→冷凍干燥，得蛋清粉→按料液比6%加入蒸餾水→攪拌均勻，預(yù)處理(沸水浴30min)→調(diào)節(jié)蛋清液溫度至55℃，pH至8.0→加入堿性蛋白酶Alcalase(酶底比為1∶100)酶解3h→沸水浴滅酶10min→再調(diào)節(jié)溫度至50℃，pH至7.0→加入中性蛋白酶Neutrase(酶底比約1∶25)酶解3h→沸水浴滅酶10min→冷卻，4000r/min離心10min→分離得到上清液，凍干，備用。

1.2.2 肽鋅配合物制備的單因素實驗 以上述方法制得的蛋清肽為原料，與一定濃度的氯化鋅溶液在一定溫度、pH下混合，攪拌一定時間制得肽鋅配合物。分別以溫度、pH、時間、肽鋅質(zhì)量比、肽初始濃度為變量，進(jìn)行單因素實驗，每組實驗重復(fù)3次，結(jié)果為3次實驗的平均值。最后加入95%乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)70%進(jìn)行醇沉，離心得沉淀(肽鋅配合物)，再用乙醇洗滌沉淀數(shù)次，洗去游離Zn2+、氨基酸、蛋清肽。于50℃烘箱中烘1h，稱重。以鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)為測量指標(biāo)，得出各因素的較合適水平。

1.2.3 肽鋅配合物制備的正交實驗 以肽鋅質(zhì)量比、pH、溫度、肽初始濃度為四因素，每個因素確定三水平(以單因素為參考)，按L9(34)正交表得9組實驗方案，用直接混合的方法制得肽鋅配合物，并以鋅含量為測量指標(biāo)。每組實驗重復(fù)3次，結(jié)果為3次實驗的平均值。

1.2.4 產(chǎn)物鋅含量的測定 按照GB8820－88絡(luò)合滴定法［9］標(biāo)準(zhǔn)測定鋅含量。取一定質(zhì)量的已烘干產(chǎn)物，加蒸餾水溶解(可加酸和適當(dāng)加熱增溶)，定容至25mL，取 8mL，加入 pH10的氨－氯化銨緩沖液10mL，鉻黑 T指示劑［10］適量，用 EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，溶液顏色由紫色變?yōu)樗{(lán)色即為滴定終點，重復(fù)平行3次，按下式計算鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)［11］:

式中:C－標(biāo)定的EDTA濃度(mol/L);V－消耗的EDTA體積(mL);65－鋅的相對摩爾質(zhì)量(g/mol);M－配合物質(zhì)量(g);W－產(chǎn)物中鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)。

1.2.5 產(chǎn)物水分的測定 直接干燥法［12］，參見國標(biāo)GB/T 5009.3－2003。

1.2.6 產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量的測定 微量凱氏定氮法［13］，參見國標(biāo) GB/T 5009.5－2003。

1.2.7 產(chǎn)物灰分測定 灼燒重量法［14］，參見國標(biāo)GB/T 5009.4－2003。

1.2.8 紅外光譜分析 取蛋清肽及蛋清肽鋅配合物各2mg與200mg KBr混合研磨均勻，使其粒度在2.5μm以下，裝入壓片模具中，抽氣加壓，壓力約為30MPa，維持 1min，制得一透明的 KBr樣片，利用Nexus 470 FT－IR型傅立葉紅外光譜儀進(jìn)行定性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH對配合反應(yīng)的影響

由圖1可知，在pH=4時產(chǎn)物中鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，原因是當(dāng)溶液中H+大量存在時，H+會與羧酸根結(jié)合，并且氨基也可能會質(zhì)子化，這兩點均不利于肽與Zn2+配合;隨著pH升高，鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐步增大，pH=5以后曲線漸趨平緩，pH=6時達(dá)到最大;pH再增大而鋅在產(chǎn)物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻減少，原因是氫氧化鋅的Ksp較小，在pH6.5的條件下鋅離子即能生成Zn(OH)2沉淀，導(dǎo)致溶液中鋅離子的濃度大大減少，不利于配合反應(yīng)的進(jìn)行。因此在后續(xù)正交實驗中宜將pH控制在6左右。

圖1 pH對產(chǎn)物中鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.2 反應(yīng)時間對配合反應(yīng)的影響

由圖2可知，隨著時間的延長鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，但變化不大，40min時達(dá)到最大，40～50min略有下降，50min后基本保持不變，因為配合反應(yīng)能在短時間內(nèi)完成，只要反應(yīng)物溶解完全，反應(yīng)就基本完成。綜上考慮，后續(xù)實驗都將反應(yīng)時間控制在40min。

圖2 時間對產(chǎn)物中鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.3 反應(yīng)溫度對配合反應(yīng)的影響

由圖3可知，隨著溫度升高，鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，在45℃時達(dá)到最大值，超過45℃后，鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降。因為隨著溫度升高，分子熱運動加劇，肽鏈適度伸展，暴露出較多的可配合位點，使蛋清肽與鋅更易配合，因而產(chǎn)物中鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加;當(dāng)溫度超過45℃后，蛋清肽肽鏈過度伸展，其構(gòu)象會偏離最適配位構(gòu)象，不利于肽鋅形成配合物，產(chǎn)物中鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所降低;故在后續(xù)正交實驗中宜將溫度控制在45℃左右。

2.4 肽初始濃度對配合反應(yīng)的影響

由圖4可知，蛋清肽的初始濃度對配合反應(yīng)的影響較顯著，剛開始蛋清肽的初始濃度較低，原因是中心離子過量，配體不足，故隨著蛋清肽溶液初始濃度的升高，配合物的量不斷增多，產(chǎn)物中鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢;但當(dāng)濃度大于4%時，鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)反而明顯降低，因為配體濃度再增大時，會出現(xiàn)配體過量的情形，故會使計算式的分母單向增大，從而降低產(chǎn)物中鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，故在后續(xù)正交實驗中宜將肽的初始濃度控制在4%左右。

圖3 溫度對產(chǎn)物中鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖4 肽初始濃度對產(chǎn)物中鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.5 肽鋅質(zhì)量比對配合的影響

肽與鋅的質(zhì)量比對配合反應(yīng)的影響很大，當(dāng)比值過大時，配體過量，產(chǎn)物中鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，造成原料浪費;而比值過小，配體不足，亦不利于配合反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)比值為3.68時，產(chǎn)物中鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大。故在后續(xù)正交實驗中宜將的肽鋅質(zhì)量比控制在3.68左右。

圖5 肽鋅質(zhì)量比對產(chǎn)物中鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.6 制備肽鋅配合物的正交實驗

采用極差分析法［15］對正交結(jié)果進(jìn)行分析，極差越大的因素對實驗結(jié)果的影響越大。由表1可知，影響因素的顯著性排序為pH＞肽鋅質(zhì)量比＞肽濃度＞溫度。其最優(yōu)水平組合為:肽鋅質(zhì)量比為3.5∶1，pH為6.0，蛋清肽初始濃度為4%，溫度為40℃。在此最優(yōu)組合條件下制得的肽鋅配合物中的鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以達(dá)到8.25%(見表2)。張全才［16］等采用正交實驗確定了米蛋白肽與硫酸鋅螯合的最佳工藝條件，優(yōu)化后得到米蛋白肽鋅中的鋅的百分含量為7.30%，本文獲得的蛋清肽鋅配合物的鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于此值。

表1 制備肽鋅配合物的正交實驗結(jié)果

2.7 產(chǎn)物成分分析

在經(jīng)正交實驗優(yōu)化后的條件下，制得肽鋅配合物，與蛋清肽比較，由表2可知，肽與鋅發(fā)生配合反應(yīng)后，粗蛋白含量有所降低，灰分大大提高，即礦物質(zhì)含量大大提高，這正是我們所期望的。

表2 成分分析(%)

2.8 蛋清肽及肽鋅配合物的紅外光譜分析

圖6為蛋清肽的紅外圖譜，圖7為蛋清肽與鋅反應(yīng)后得到的紅外圖譜。比較兩者的變化，可以發(fā)現(xiàn):因為肽鋅配合物的制備是在pH=6條件下完成的，故此時羧酸根可以以結(jié)合質(zhì)子的－COOH形式存在，所以從圖7中可以看到羧基在3000cm－1左右有典型的寬峰，且此時－NH2亦可接受質(zhì)子，形成－NH+3，故圖7中也未出現(xiàn)－NH2(伯胺)的雙峰;但由于Zn2+與肽的配合能力較強(qiáng)，可與質(zhì)子競爭配體，故圖7中可同時觀察到－COOH和－COO－的峰特征。比較配合前后的圖譜發(fā)現(xiàn):配合后在1541cm－1處新出現(xiàn)了一個較強(qiáng)的吸收峰，且在1399cm－1處也有峰，這與羧酸成鹽后的變化相一致［17］，即 1541cm－1為羧酸根(O－C－O)的反對稱伸縮振動峰，1399cm－1為羧酸根(O－C－O)的對稱伸縮振動峰，羧酸根的負(fù)離子處的氧具有配位能力。根據(jù)文獻(xiàn)［18］報道:未與金屬離子配位的羧酸根離子其反對稱伸縮振動的峰和對稱伸縮振動峰波數(shù)之差Δν為160cm－1左右;若配合物中的Δν與游離時的Δν相差不多時，則認(rèn)為是以雙單齒形式配位。本文肽鋅配合物圖譜中反對稱伸縮振動的峰和對稱伸縮振動峰 Δν=142cm－1，與 Δν=160cm－1接近，則我們認(rèn)為鋅與蛋清肽中的羧基是以雙單齒形式配位的。

圖6 蛋清肽的紅外吸收圖譜

圖7 蛋清肽－鋅配合物的紅外吸收圖譜

3 結(jié)論

獲得配合物的最優(yōu)反應(yīng)條件為:多肽反應(yīng)液初始濃度4%，肽鋅質(zhì)量比3.5∶1，pH為6.0，溫度40℃，反應(yīng)時間40min，在此最優(yōu)條件下制得的產(chǎn)物中鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.25%;蛋清肽與鋅之間可形成一種雙單齒配合物，可作為一種新的補(bǔ)鋅劑。

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Preparation of ligand compound of egg white peptides and zinc(Ⅱ)

HAN Ying，HE Hui*，CHENG Hai－xia，LV Jie，ZHANG Wen－jun
(College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China)

In order to get zinc supplement with high bioavailability，egg white peptides were used as raw material and zinc mass ratio in products were used as the main index，the optimal conditions to prepare ligand compound were determined by means of single factor experiment and orthogonal tests.The infrared spectra before and after the reaction were compared.The results showed that the optimized conditions to prepare ligand compound were as follows:the concentration of egg white peptide was 4%，the mass ratio of egg white peptide to ZnCl2was 3.5∶1，temperature 40℃，pH 6.0 and the reaction time 40min.Under this condition，the mass ratio of zinc in products was 8.25%.Infrared spectra analysis indicated that double－monodentate ligand compound maybe formed.The ligand compound of egg white peptides and zinc could be used as a new zinc supplement.

egg white peptides;ligand compound of peptide and zinc;preparation

TS202.3

A

1002－0306(2011)09－0357－04

2010－09－25 *通訊聯(lián)系人

韓櫻(1986－)，女，碩士在讀，研究方向:食品科學(xué)。