徐麗珊，黃啟亮，汪雪君

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004)

藍(lán)莓葉中抗氧化物質(zhì)提取工藝研究

徐麗珊，黃啟亮，汪雪君

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004)

主要以對DPPH自由基的清除能力為抗氧化指標(biāo)，研究藍(lán)莓葉中抗氧化物質(zhì)的提取工藝。探究了pH、提取溫度、料液比、提取時(shí)間等因素對藍(lán)莓葉中抗氧化物質(zhì)提取的影響。在單因素和正交實(shí)驗(yàn)中，確定了各因素影響藍(lán)莓葉中抗氧化物質(zhì)提取的主次順序?yàn)?料液比＞提取溫度＞酸堿度＞提取時(shí)間，并得到了最佳提取工藝條件:料液比為1∶14(g∶mL)，提取溫度為100℃，酸堿度為pH2.0，提取時(shí)間為60min。最佳工藝條件下，藍(lán)莓葉提取物中抗氧化活性為159.88mg/g·FW。

藍(lán)莓葉，抗氧化活性，DPPH，提取工藝，正交實(shí)驗(yàn)

近些年，從植物中尋找安全、高效的天然抗氧化劑成為食品研究的熱點(diǎn)。藍(lán)莓是杜鵑花科越橘屬植物，原產(chǎn)、主產(chǎn)于美國，其果實(shí)中含有豐富的抗氧化物質(zhì)［1］，是一種被聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)公認(rèn)的營養(yǎng)保健果品。我國藍(lán)莓栽培雖然起步晚，但發(fā)展勢頭迅猛，浙江省栽培面積就已近萬畝，而且還在不斷迅速擴(kuò)張，隨之而來，就會產(chǎn)生大量的藍(lán)莓葉。相關(guān)研究表明，藍(lán)莓葉中也含有豐富的抗氧化物質(zhì)［2］，如黃酮類物質(zhì)等［3］，具有很高的藥用價(jià)值［3－5］。如從藍(lán)莓葉中提取抗氧化物質(zhì)，就可更好地實(shí)現(xiàn)藍(lán)莓葉的存在價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)旨在探討提取藍(lán)莓葉中的抗氧化物質(zhì)的提取工藝，以尋求新型、高效的天然抗氧化劑的制備方法，提高藍(lán)莓種植的經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮、嫩綠、豐碩的藍(lán)莓葉 取自浙江師范大學(xué)藍(lán)莓基地;無水乙醇 分析純，杭州蕭山化學(xué)試劑廠;DPPH 上海如吉生物科技有限公司。

Uv1000紫外吸光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司;分析天平、PB－10 pH計(jì) 北京賽利多新斯儀器系統(tǒng)有限公司;Sc－5A超級恒溫箱 寧波海曙億恒儀器有限公司;GZX－9140MBE數(shù)顯不銹鋼鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;日立CR22G高速冷凍離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓葉提取液的制備 稱取一定量洗凈瀝干并剪碎的藍(lán)莓葉，按一定的料液比加入提取劑，恒溫浸提一定時(shí)間，離心，將提取液定容到一定體積。

1.2.2 DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取DPPH 10.0mg，用無水乙醇定容至 100mL，配成濃度為0.1mg/mL 的溶液。吸取 0.00、1.00、1.00、0.50、0.50、0.50、0.25mL 溶液，分別加入無水乙醇 2.00、4.00、3.00、4.50、7.00、6.00mL，從而得到濃度為 0.00、4.00、6.70、10.00、14.30、20.00、33.30μg/mL 的 DPPH 標(biāo)準(zhǔn)液。以無水乙醇做空白對照，在517nm處測標(biāo)準(zhǔn)液的OD值。以標(biāo)準(zhǔn)液濃度和OD值回歸處理后，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 DPPH法測定抗氧化物質(zhì)的含量

1.2.3.1 自由基的清除率計(jì)算 取稀釋的提取液2mL，加入2mL配制的DPPH溶液，混勻靜置60min，517nm處測其吸光度(Ai)，以溶劑為參比，于517nm處測定吸光度(Ac);同時(shí)，取稀釋的提取液2mL，加入2mL無水乙醇，充分混勻，測定空白對照的517nm處的吸光度(Aj)。

式中:Ac:2mL溶劑加2mL DPPH溶液的吸光度(僅含DPPH乙醇溶液);Ai:加2mL待測液加2mL DPPH溶液的吸光度;Aj:2mL待測液加2mL溶劑的吸光度空白對照的吸光度值(樣品與無水乙醇用以消除樣品本身顏色的影響)。

1.2.3.2 抗氧化物質(zhì)活性計(jì)算:

抗氧化活性(清除DPPH量，mg/g·FW)=清除率×(DPPH濃度×體積)/(樣品濃度×樣品體積)［7］

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)對藍(lán)莓葉中抗氧化物質(zhì)提取進(jìn)行工藝優(yōu)化，主要選用提取溫度、提取時(shí)間、料液比和酸堿度作為考察因素。

1.2.5 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，選擇提取溫度、提取時(shí)間、料液比和酸堿度4個(gè)因素，設(shè)計(jì)了4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，所采用的正交表為L9(34)，以浸提液中抗氧化物質(zhì)活性作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選藍(lán)莓葉中抗氧化物質(zhì)提取的最佳條件。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Excel 2003進(jìn)行回歸和相關(guān)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程

回歸方程為 y=23.209x+0.0078，R2=0.9996，其中y為實(shí)驗(yàn)所得的吸光值，x為樣品濃度(mg/mL)，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖 1。結(jié)果表明，DPPH濃度在0～0.0333mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖1 DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 提取溶劑的確定

常用的溶劑有水、甲醇、乙醇、丙酮等。甲醇毒性較大，丙酮的毒性也比較高，丙酮沸點(diǎn)較低，極易揮發(fā)，生產(chǎn)過程中損失較大，提取后若去除不完全，會存在安全性問題，不宜用于實(shí)際生產(chǎn);而乙醇廣泛應(yīng)用于活性成分的提取，安全性高。故以乙醇、水為溶劑設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。

稱取一定量洗凈瀝干剪碎的藍(lán)莓葉，按照料液比為 1∶10，分別加入 0%、10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液置于40℃的水浴鍋中，浸提60min。測定藍(lán)莓葉提取液的抗氧化活性，結(jié)果如圖2。

圖2 不同濃度乙醇對提取物抗氧化活性的影響

由圖2可知，在乙醇濃度為0%～30%之間，隨乙醇濃度增大，抗氧化活性增大;當(dāng)乙醇濃度再增大時(shí)，抗氧化活性反而降低。

分別以30%乙醇溶液和自來水為提取溶劑，其余提取條件相同，比較提取物的抗氧化活性，結(jié)果如表1。

表1 不同提取溶劑對提取物抗氧化活性的影響

表1表明，自來水(100℃)的抗氧化活性比30%(40℃)的乙醇溶劑高，而且在實(shí)際生產(chǎn)中，水比乙醇溶液經(jīng)濟(jì)實(shí)惠很多，操作也方便，所以采用水作為提取溶劑，作為工藝優(yōu)化的提取方法。

2.3 水提法提取藍(lán)莓葉中抗氧化物質(zhì)

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1.1 提取溫度的影響 稱取一定量剪碎的藍(lán)莓葉，按照料液比 1∶10 加入自來水，分別在 40、60、80、100℃下提取60min，結(jié)果如圖3。

圖3 溫度對提取物抗氧化活性的影響

由圖3可看出，隨著提取溫度的升高，抗氧化物質(zhì)活性呈上升趨勢，可見提取溫度對抗氧化物質(zhì)提取有一定的影響。

2.3.1.2 料液比的影響 稱取一定量剪碎的藍(lán)莓葉，按照料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 自來水，在80℃下提取60min，結(jié)果如圖4。

由圖4可看出，隨料液比的增大，抗氧化活性逐漸增大，表明隨料液比的增加，藍(lán)莓葉中抗氧化物質(zhì)的提取率逐漸增加，當(dāng)料液比1∶14時(shí)，對抗氧化物質(zhì)提取效果最好，提取液抗氧化活性最高。

圖4 料液比對提取物抗氧化活性的影響

2.3.1.3 pH的影響 稱取一定量剪碎的藍(lán)莓葉，按料液比1∶10分別加入 pH 為 2、4、6、8 的自來水，在80℃下提取60min，結(jié)果如圖5。

圖5 不同pH對提取物抗氧化活性的影響

由圖5可見，當(dāng)提取液pH=2時(shí)，抗氧化活性最高，pH在4～8時(shí)藍(lán)莓葉提取液抗氧化活性趨于平衡，且差異并不顯著，可知在此pH區(qū)間對藍(lán)莓葉抗氧化物質(zhì)提取影響不大。

2.3.1.4 提取時(shí)間的影響 稱取一定量剪碎的藍(lán)莓葉，按照料液比1∶10加入自來水，在80℃下分別提取 30、60、90、120、150、180min，結(jié)果如圖 6。

圖6 不同提取時(shí)間對提取物抗氧化活性的影響

結(jié)果如圖6，提取時(shí)間為30～60min時(shí)，抗氧化活性逐漸提高，提取時(shí)間60～180min時(shí)，抗氧化活性逐漸降低。在不同的提取時(shí)間條件下，抗氧化活性變化趨勢并不明顯，可見提取時(shí)間對藍(lán)莓葉抗氧化物質(zhì)的提取影響不明顯。由圖可知，提取時(shí)間為60min時(shí)抗氧化活性最高，與其他提取時(shí)間相比較，差異極顯著(P＜0.01)。

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選提取溫度、料液比、pH、提取時(shí)間為考察因素，以藍(lán)莓葉提取液中抗氧化活性為指標(biāo)，采用正交表L9(34)進(jìn)行優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)。利用4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)分析了上述因素對藍(lán)莓葉中抗氧化物質(zhì)提取效果的影響，分析藍(lán)莓葉中抗氧化物質(zhì)的最佳提取工藝。因素水平選取如表2所示，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析見表3。

由表3可知，對藍(lán)莓葉提取液抗氧化活性影響最顯著的是料液比，其次是提取溫度、pH、提取時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，最優(yōu)組合為A3B3C2D1，即料液比為1∶14，提取溫度 100℃，pH2，提取時(shí)間為 60min。實(shí)驗(yàn)9的提取工藝條件滿足最佳工藝條件，可取得最高的抗氧化活性159.88mg/g·FW。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表3 藍(lán)莓葉抗氧化活性正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，可知影響藍(lán)莓葉抗氧化物質(zhì)提取率的因素順序?yàn)?料液比＞提取溫度＞pH＞提取時(shí)間;確定了藍(lán)莓葉抗氧化物質(zhì)的最佳提取工藝條件為:提取溫度 100℃，提取時(shí)間60min，pH2，料液比為 1∶14(g∶mL)。在此工藝條件下，藍(lán)莓葉提取物抗氧化活性最高。

本實(shí)驗(yàn)通過比較不同提取條件對藍(lán)莓葉抗氧化物質(zhì)提取的影響，尋找出一種最佳的提取條件，應(yīng)用于抗氧化產(chǎn)品的研究開發(fā)，以新型天然產(chǎn)品取代化學(xué)合成品。這不僅合理利用了藍(lán)莓葉，使之“變廢為寶”，而且為抗氧化產(chǎn)品的生產(chǎn)提供了新的抗氧化資源，為今后更加進(jìn)一步開發(fā)利用藍(lán)莓葉積累了寶貴的經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)行了有益的探索。

［1］王玲，李正全，潘太全.藍(lán)莓富含抗氧化物質(zhì)［J］.中國果業(yè)信息，2009(4):28.

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Study on the extraction technology of antioxidant activity from blueberry leaves

XU Li－shan，HUANG Qi－liang，WANG Xue－jun

(Zhejiang Normal University College of Chemistry and Life Science，Jinhua 321004，China)

Extraction technology for antioxidant activity from blueberry leaf was optimized，and the clearance of DPPH free radical as an indicator was taken for antioxidant.Different pH，extraction temperature，the ratio of solid to liquid and extraction time were compared on the effect of the antioxygenic activity of extractions.With single factor and orthogonal experiments，the primary and secondary order of effect of the factors water extraction method for the extractions antioxidant activity from blueberry leaves was determined:the ratio of solid to liquid＞extraction temperature＞pH＞extraction time.The optimum process conditions was determined:the ratio of solid to liquid was 1∶14(g∶mL)，temperature was 100℃，pH was 2.0，extraction time was 60min.Under the above conditions，the antioxygenic activity could reach to be 159.88mg/g·FW.

blueberryleaf;antioxygenicactivity;DPPH spectrophotometricmethod;extractionprocess;orthogonal experiment

TS255.1

B

1002－0306(2011)09－0270－03

2010－10－08

徐麗珊(1966－)，女，副教授，碩士，研究方向:生理生化和食品營養(yǎng)。

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010C34002)。