廖春燕，黃 惠

(廣西工學(xué)院生物與化學(xué)工程系，廣西柳州545006)

桔梗多糖脫蛋白方法的研究

廖春燕，黃 惠

(廣西工學(xué)院生物與化學(xué)工程系，廣西柳州545006)

目的:探討桔梗多糖脫蛋白的方法。方法:以蛋白去除率和多糖損失率為指標，比較Sevag法、三氯乙酸－正丁醇法、正丁醇法、AB－8大孔吸附樹脂法去除桔梗多糖中蛋白質(zhì)的效果。結(jié)果:AB－8大孔吸附樹脂脫蛋白的效果最好，蛋白去除率為90.1%，多糖損失率為17.4%。結(jié)論:AB－8大孔吸附樹脂蛋白去除率高，且多糖損失率低，是一種有效的脫蛋白方法。

桔梗，多糖，脫蛋白，大孔吸附樹脂

桔梗入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為臨床常用藥，味苦、辛，性平，歸肺經(jīng)。藥理實驗證實，桔梗有抗炎、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗?jié)?、降血壓、擴張血管、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、解熱、降血糖、抗膽堿、促進膽酸分泌、抗過敏等廣泛作用［1－3］。現(xiàn)代藥理研究表明，桔梗多糖具有多種生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、祛痰、保肝、改善胰島素抵抗、抗炎等［4－6］。韓國學(xué)者對桔梗皂苷和多糖類成分進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)桔梗多糖能激活促進細胞分裂的蛋白酶活性［7］。桔梗多糖大多與蛋白質(zhì)共存于某一部位，蛋白質(zhì)或游離蛋白質(zhì)的酸堿性氨基酸常與多糖上的堿性或酸性基團產(chǎn)生靜電結(jié)合使游離的蛋白質(zhì)脫去產(chǎn)生難度。為了提高桔梗多糖的生物活性，得到較高純度的桔梗多糖，必須去除蛋白質(zhì)。目前，國內(nèi)已有對于桔梗多糖的提取方面的報道，但是對于桔梗多糖的純化方面未見詳細報道。脫蛋白的方法有傳統(tǒng)的Sevag法、三氯醋酸法等。本實驗以蛋白去除率與多糖損失率為考察指標，選用了四種脫蛋白方法進行研究，為桔梗多糖分離純化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桔梗 購于柳州市中藥材市場;AB－8大孔樹脂上海摩速科學(xué)器材有限公司;牛血清蛋白、考馬斯亮藍 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;硫酸、苯酚、葡萄糖、乙醇、三氯甲烷、正丁醇、三氯乙酸等試劑 均為分析純。

UV－2000紫外分光光度計 尤尼科(上海)儀器有限公司;HZ－9212水浴恒溫振蕩器 太倉市華利達實驗設(shè)備有限公司;XK96快速混勻器 姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司;ZFD－5250全自動新型鼓風(fēng)干燥箱 上海智城分析儀器制造有限公司;LXJ－Ⅱ離心機 上海醫(yī)分儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桔梗多糖提取液的制備 選擇成熟、無腐爛的桔梗根部，粉碎，過40目篩，80℃烘箱干燥至恒重，備用。稱取一定重量的桔梗粉，以蒸餾水為提取劑，料液比為1∶20(m/v)，在溫度為80℃的水浴鍋中浸提2h，8000r/min下離心20min，取上清液作為多糖提取液。

1.2.2 多糖含量的測定 采用硫酸－苯酚法［8］測定桔梗多糖含量，以葡萄糖為對照品。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍染色法［9］測定蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白為標準品。

1.2.4 Sevag法脫蛋白 將氯仿和正丁醇按照體積比為 2∶1、1∶1、1∶2、1∶3 混合配制成不同比例的 Sevag試劑，取不同比例Sevag試劑與桔梗多糖溶液按體積比為1∶2置于錐形瓶中混合，在30℃下恒溫振蕩30min，4000r/min條件下離心20min，去除變性蛋白，得澄清液并測定蛋白質(zhì)和多糖含量。

1.2.5 三氯乙酸－正丁醇法脫蛋白 將三氯乙酸和正丁醇按照體積比為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 混合配制成三氯乙酸－正丁醇混合試劑，將桔梗多糖提取液與上述四種三氯乙酸－正丁醇試劑按照體積比為1∶2置于錐形瓶中混合，在30℃下恒溫振蕩30min，4000r/min條件下離心20min，棄去沉淀，得澄清液并測定蛋白質(zhì)和多糖含量。

1.2.6 正丁醇法脫蛋白 將多糖樣液與正丁醇按照體積比為 1∶1、2∶3、1∶2、1∶3 分別混合置于錐形瓶內(nèi)，30℃下恒溫振蕩30min后放置過夜，在4000r/min條件下離心20min，棄去沉淀，得澄清液并測定蛋白質(zhì)和多糖含量。

1.2.7 AB－8大孔吸附樹脂脫蛋白工藝

1.2.7.1 AB－8大孔吸附樹脂的預(yù)處理 用去離子水將AB－8大孔吸附樹脂洗至無混濁→5%HCl浸泡2～4h→去離子水洗至中性→2%NaOH浸泡2～4h→去離子水洗至中性→乙醇浸泡12h→用去離子水洗至無醇味，備用

1.2.7.2 靜態(tài)吸附實驗 取1g(濕態(tài))AB－8大孔吸附樹脂與10mL桔梗多糖提取液(濃度為2mg/mL)混合，置于搖床振搖(110r/min，30℃，pH=7)，在時間間隔為2、4、6、8、10、12、24h 時，取出一定樣液分別測定蛋白質(zhì)和多糖的含量，按式(1)計算樹脂對蛋白和多糖的吸附率。

式中，E1為吸附率(%);Co為吸附前的起始濃度(mg/mL);Ce為吸附后的平衡濃度(mg/mL)。

1.2.7.3 動態(tài)吸附實驗 取預(yù)處理過的AB－8大孔吸附樹脂，濕法裝柱(1.4cm×13cm)，加入25mL濃度為2mg/mL的桔梗多糖提取液，控制吸附流速為1mL/min，等桔梗多糖的溶液吸附完全后用蒸餾水洗脫，洗脫流速為1mL/min，測定洗脫液的蛋白含量和多糖含量，按式(2)計算多糖和蛋白的洗脫率。

式中，E2為洗脫率(%);C2為洗脫液中樣品濃度(mg/mL);Co為吸附前的起始濃度(mg/mL);Ce為吸附后的平衡濃度(mg/mL);V1為上樣液體積(mL);V2為洗脫液體積(mL)。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同比例的Sevag試劑對桔梗多糖溶液脫蛋白效果的影響

由圖1可知，蛋白去除率隨著氯仿和正丁醇體積比的增大而上升，在氯仿和正丁醇體積比大于1∶2時，蛋白去除率變化減小，而多糖損失率增加明顯。各組間蛋白去除率和多糖損失率均存在顯著性差異(P＜0.05)。綜合考慮蛋白去除率和多糖損失率，在氯仿和正丁醇體積比為1∶2時配成的Sevag試劑對桔梗多糖溶液脫蛋白的效果最好，蛋白去除率為59.3%，多糖損失率為21.3%。

圖1 不同比例的Sevag試劑對桔梗多糖溶液脫蛋白效果的影響

2.2 三氯乙酸與正丁醇體積比對桔梗多糖溶液脫蛋白效果的影響

由圖2可知，蛋白去除率和多糖損失率隨著三氯乙酸和正丁醇體積比的增大而增大，在體積比大于1∶10時，蛋白去除率增大緩慢，而多糖損失率增大較快。各組間蛋白去除率和多糖損失率均存在顯著性差異(P＜0.05)。綜合考慮蛋白去除率和多糖損失率，在三氯乙酸和正丁醇體積比為1∶10時，三氯乙酸與正丁醇試劑對樣液脫蛋白效果較好，蛋白去除率為71.8%，多糖損失率為18.5%。

圖2 三氯乙酸與正丁醇體積比對桔梗多糖溶液脫蛋白效果的影響

2.3 桔梗多糖溶液與正丁醇試劑體積比對脫蛋白效果的影響

由圖3可以看出，蛋白去除率隨著桔梗多糖溶液與正丁醇試劑體積比增大而增大，當(dāng)體積比大于2∶3時趨于平穩(wěn)。桔梗多糖溶液與正丁醇試劑體積比為1∶3時，蛋白去除率最大(69.2%)，但多糖損失率也最大(43.2%)。體積比為2∶3和1∶2時，蛋白去除率不存在顯著性差異(P＞0.05)。體積比為1∶1和1∶2時，多糖損失率不存在顯著性差異(P＞0.05);體積比為2∶3時，多糖損失率最小。綜合考慮蛋白去除率和多糖損失率，桔梗多糖溶液與正丁醇的體積比為2∶3時，正丁醇試劑對桔梗多糖脫蛋白效果較好，此時蛋白去除率為58.7%，多糖損失率為18.8%。

圖3 桔梗多糖溶液與正丁醇試劑體積比對脫蛋白效果的影響

2.4 AB－8大孔吸附樹脂脫蛋白工藝

2.4.1 靜態(tài)吸附實驗 由圖4可知，樹脂對多糖和蛋白的吸附率都隨著時間的增加而增大。吸附率在起始階段明顯增加;隨著時間延長吸附率增加緩慢，接近12h時，其吸附基本達到平衡。可見，AB－8大孔吸附樹脂對桔梗多糖和雜蛋白都有良好的吸附作用，因此可選用AB－8大孔吸附樹脂作為桔梗多糖溶液除蛋白的介質(zhì)。

圖4 靜態(tài)吸附實驗

2.4.2 動態(tài)吸附實驗 由圖5可以看出，隨著洗脫劑用量的增加，多糖的洗脫率增加，當(dāng)洗脫劑用量達到25mL后，多糖洗脫率不再明顯增加，此時多糖洗脫率達到82.6%。蛋白洗脫曲線顯示當(dāng)洗脫劑用量達到10mL時，蛋白質(zhì)洗脫基本達到平衡，洗脫率為9.9%，蛋白的洗脫達到平衡。以蒸餾水為洗脫劑，樹脂吸附的多糖大部分被洗脫下來，多糖洗脫率為82.6%，即多糖損失率為17.4%;樹脂所吸附的蛋白很難洗脫，洗脫率為9.9%，即蛋白去除率為90.1%。

圖5 洗脫曲線

2.5 脫蛋白方法的比較

如表1所示，Sevag法和正丁醇法對蛋白去除率無顯著性差異(P＞0.05)。三氯乙酸－正丁醇法和正丁醇法、AB－8大孔吸附樹脂法對多糖損失率無顯著性差異(P＞0.05)。綜合考慮蛋白去除率和多糖損失率，用AB－8大孔吸附樹脂去除蛋白，蛋白去除率為90.1%，多糖損失率為17.4%，效果最好。結(jié)果表明，大孔吸附樹脂能有效地去除桔梗提取液的雜蛋白，顏色變化也比較明顯，說明樹脂不僅可以脫蛋白還可以脫色。

表1 不同脫蛋白方法的比較

3 結(jié)論

本實驗比較了Sevag法、三氯乙酸－正丁醇法、正丁醇法和AB－8大孔吸附樹脂法對桔梗多糖脫蛋白效果的影響。Sevag法和正丁醇法對蛋白去除率無顯著性差異(P＞0.05)。AB－8大孔吸附樹脂法的蛋白去除率最大。Sevag法、三氯乙酸－正丁醇法和正丁醇法的蛋白去除率較AB－8大孔吸附樹脂法小得多。三氯醋酸－正丁醇法和正丁醇法、AB－8大孔吸附樹脂法對多糖損失率無顯著性差異(P＞0.05)，Sevag法的多糖損失率最大。綜合考慮，四種脫蛋白方法中，AB－8大孔吸附樹脂法脫蛋白效果最好。AB－8大孔吸附樹脂具有較好的吸附和解析能力，以蒸餾水為洗脫劑，用AB－8大孔吸附樹脂純化桔梗多糖溶液，蛋白質(zhì)去除率達90.1%，多糖損失率為17.4%，效果明顯。AB－8大孔吸附樹脂用于天然活性物質(zhì)的分離純化，該方法具有收率高、成本低、操作簡單等特點，可用于實現(xiàn)多糖脫蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)，并且還對桔梗多糖溶液具有一定的脫色作用。

［1］武博，劉萍.桔梗的現(xiàn)代研究進展［J］.中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2008，5(2):48－50.

［2］付文衛(wèi)，竇德強，裴月湖.桔梗的化學(xué)成分和生物活性研究進展［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2006，3(3):184－191.

［3］金在久.桔梗的化學(xué)成分及藥理和臨床研究進展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18(2):506－509.

［4］宋楊，齊云.桔梗的藥理研究進展［J］.中國藥房，2006，17(2):140－141.

［5］Yoon YD，Han SB，Kang JS，et al.Toll－ like receptor 4－dependent activation of macrophages by polysaccharide isolated from the radix of Platycodon grandilorum ［J］ .Int Immunopharmacol，2003，3(13－14):1873.

［6］Han SB，Park SH，Lee KH，et al.Polysaccharide deslated from the radix of platyeodon grandiflorum selectively activates B cells and macrophagesbutnotT cells ［J］.Immunol，2001，1(11):1969.

［7］Y D Yoon，J S Kang，S B Han，et al.Activation of mitogenativated protein Kinases and AP－1 by polysaccharide isolated from the radix of platycodon grandiflorum in RAW 264.7 cells［J］.International Immunopharmacology，2004，4(12):1477－1587.

［8］楊勇杰，姜瑞芝.苯酚一硫酸法測定雜多糖含量的研究［J］.中成藥，2005，27(6):706－708.

［9］袁玉蓀，朱婉華，陳鈞輝.生物化學(xué)實驗［M］.北京:高等教育出版社，1992:69－70.

Study on the removal of protein from polysaccharide of Platycodon Grandiflorum by macroporous adsorption resin

LIAO Chun－yan，HUANG Hui

(Department of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Technology，Liuzhou 545006，China)

Objective:The different methods of removing protein from polysaccharide of Platycodon Grandiflorum were studied.Method:The different methods of removing protein including Sevag，trichloroacetic acid－n－Butyl alcohol，butyl alcohol and AB－8 macroporous adsorption resin were compared with the rate of deproteinization and polysaccharide loss as indexes.Result:AB－8 macroporous adsorption resin had the best effect on the removal of protein with the rate of deproteinization and polysaccharide loss were 90.1%and 17.4%.Conclusion:The method of AB－8 macroporous adsorption resin was an effective method for removing protein from polysaccharide extract of Platycodon Grandiflorum with the high rate of deproteinization and the low rate of polysaccharides loss.

Platycodon grandiflorum;polysaccharide;removal of protein;macroporous adsorption resins

TS201.2

B

1002－0306(2011)09－0246－04

2011－01－11

廖春燕(1979－)，女，講師，碩士，研究方向:生物催化。