王偉華，雷紅濤，孫遠明，王利英，王保玲

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院/廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，廣東廣州510642)

消旋氧氟沙星抗體制備及其手性識別特性研究

王偉華，雷紅濤*，孫遠明*，王利英，王保玲

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院/廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，廣東廣州510642)

采用活潑酯法(A)和直接EDC(1－乙基－3－(3－二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)法(D)，合成兩種包被抗原(OFL－A－OVA和OFL－D－OVA)和兩種免疫抗原(OFL－A－BSA和OFL－D－BSA)，然后分別用兩種免疫抗原免疫小鼠獲得與其對應(yīng)的多克隆抗體，建立消旋氧氟沙星殘留免疫檢測方法。研究結(jié)果表明:紫外掃描圖譜證明四種抗原均合成成功，OFL－A－BSA、OFL－D－BSA、OFL－A－OVA 和 OFL－D－OVA 的偶聯(lián)比分別為19.67、3.03、1.93 和 0.99。消旋氧氟沙星的間接競爭ELISA法的線性檢測范圍為16.35～444.10ng/mL，IC50為5.42ng/mL，最低檢測限為6.23ng/mL。消旋氧氟沙星抗體與恩諾沙星、環(huán)丙沙星、加替沙星等其他同類藥物的交叉反應(yīng)率較低，表明消旋氧氟沙星抗體具有較高的特異性，且消旋氧氟沙星抗體對左旋氧氟沙星和右旋氧氟沙星的識別并非對等，對左旋的識別能力較大，左旋氧氟沙星對抗體的產(chǎn)生起主要作用。

氧氟沙星，人工抗原，多克隆抗體，交叉反應(yīng)率，手性識別

食品安全問題已成為全世界關(guān)注和擔憂的焦點，關(guān)系到廣大消費者的身體健康與生命安全，關(guān)系到社會穩(wěn)定與經(jīng)濟發(fā)展。我國的食品安全并不容樂觀，每年因農(nóng)藥、漁藥、獸藥和其他污染物殘留而造成的農(nóng)產(chǎn)品、水產(chǎn)品及加工食品的經(jīng)濟損失巨大。氧氟沙星是一種在畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖等農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中應(yīng)用較廣的喹諾酮類抗菌藥物，主要作用于細菌體內(nèi)DNA促旋酶，抑制該酶的活性，干擾DNA合成，從而起到抗菌作用，氧氟沙星的藥理研究表明，S型異構(gòu)體的抗菌活性比R型高2個數(shù)量級，是外消旋體的2倍，不良反應(yīng)比外消旋體低。Morrissey等發(fā)現(xiàn)氧氟沙星兩個手性異構(gòu)體對DNA促旋酶的親和力大小基本相似，但二者與酶的摩爾結(jié)合比差異很大，S型與酶結(jié)合時有4個單體裝配在結(jié)合口袋，而R型卻只有2個;結(jié)合口袋內(nèi)結(jié)合的多個S型單體優(yōu)化了藥物和酶的作用，通過計算機分子模擬發(fā)現(xiàn)，DNA促旋酶將DNA雙鏈變性形成口袋后，S－氧氟沙星的喹諾酮母環(huán)與該口袋結(jié)合，同時喹諾酮C－7取代基又與DNA促旋酶的b亞基相互作用，從而進一步增強了S型對映體的結(jié)合力［1］。該藥物長期使用，會在動物體內(nèi)大量積聚，從而危害人類健康。氧氟沙星是已上市的13個喹諾酮類抗菌藥中最為優(yōu)秀的、可再開發(fā)的新品種之一，也是迄今國際上臨床使用的480余種含手性因素的藥物之一。手性對映體的性質(zhì)在各向同性的環(huán)境中完全一樣，而在各向異性的環(huán)境中則往往不同，具有生理活性的一些對映體，往往一種活性很高，另一種活性很小或者沒有活性，這種現(xiàn)象在農(nóng)藥［2］、治療藥物［3］中很常見。本文以氧氟沙星為對象，制備消旋氧氟沙星的多克隆抗體，對該抗體的交叉反應(yīng)和手性識別特性進行評價，探索消旋氧氟沙星抗體的識別特性，為闡述半抗原類物質(zhì)的手性識別機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

動物材料 Balb/c純種雌性小鼠，7～8周齡，體重20～22g，中山醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心;牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、Freund氏完全和不完全佐劑 Sigma公司;HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體武漢博士德生物工程有限公司;脫脂奶粉 內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司;消旋氧氟沙星、左旋氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、加替沙星、1－乙基－3－(3－二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N－羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N，N－二甲基甲酰胺(DMF)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、檸檬酸、吐溫－20 北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司;其他化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)分析純。

透析袋、低溫高速離心機 Sigma公司;BP61S型電子天平 德國Sartorius公司;Ultraspec4000型紫外/可見分光光度儀 Pharmacia Biotech公司;Multiskan MK3酶標儀、Wellwash MK2洗板機 美國Thermo labsystems公司;BP61S電子天平 瑞士Sartorius公司;微量可調(diào)移液器 法國Gelson公司;82－5控溫磁力攪拌器 金壇市恒豐儀器廠;94－2磁力攪拌器 國華電器有限公司;TGL－16高速臺式離心機 上海醫(yī)用分析儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 人工抗原制備

1.2.1.1 活潑酯法合成人工免疫原(OFL－A－BSA)和人工包被原(OFL－A－OVA) 稱取39.4mg(0.1mmol)OFL放入小燒杯，加入6mL的DMF，再分別加入 122.0mg(0.6mmol)的 EDC、46.4mg的 NHS(0.4mmol)、6mL雙蒸水，用保鮮紙封口，磁力攪拌下室溫反應(yīng)24h制成 A液。將158.4mg(0.02mmol)BSA溶于20mL 0.1mol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液中，得B液。將A液逐滴加入B液中，磁力攪拌器攪拌下室溫反應(yīng)6h。用生理鹽水在4℃下透析3d，透析完全后，測定人工抗原濃度，分裝，－20℃凍存，即得人工免疫原OFL－A－BSA。

人工包被原OFL－A－OVA的制備基本同免疫原OFL－A－BSA，僅將 BSA 換成105.6mg(0.0024mmol)OVA。

1.2.1.2 直接 EDC法合成人工免疫原(OFL－DBSA)和人工包被原(OFL－D－OVA) 將 3.9mg(0.01mmol)OFL溶于 3mL蒸餾水，加入 10.2mg(0.05mmol)EDC、10mg(0.001mmol)BSA，室溫攪拌反應(yīng)3h，用生理鹽水在4℃下透析3d。透析完全后，測定人工抗原濃度，分裝，－20℃凍存，即得人工免疫原OFL－D－BSA。

人工包被原OFL－D－OVA的制備基本同免疫原OFL－D－BSA，僅將 BSA 換成3.3mg(0.000075mmol)OVA。

1.2.2 人工抗原的鑒定方法

1.2.2.1 人工免疫原和包被原濃度的測定 采用Braford 法［4］。

1.2.2.2 紫外光譜鑒定［5］將合成的OFL－A－BSA、OFL－D－BSA、OFL－A－OVA、OFL－D－OVA、BSA、OVA分別用生理鹽水配制成適當濃度的溶液，用生理鹽水作對照在200～400nm波長下掃描。參照陳新建等［6］的計算方法，計算分子結(jié)合比。

1.2.3 OFL多克隆抗體的制備 將OFL－A－BSA和OFL－D－BSA分別與等量的弗氏佐劑混合，充分乳化后皮下多點注射免疫小鼠，每只100μg免疫原;第二次以后用弗氏不完全佐劑，免疫間隔為3周，第3次免疫后7d尾部取血，4℃冰箱放置過夜，3000r/min離心10min，取上清，－20℃冰箱內(nèi)保存。用 OFL－ABSA免疫的小鼠編號分別為 A1、A2，用OFL－D－BSA免疫的小鼠編號分別為D1、D2。

1.2.4 免疫抗血清效價的測定 采用間接ELISA方法。

1.2.5 抗體的識別特性鑒定

1.2.5.1 數(shù)據(jù)處理和曲線擬合 用PBST分別溶解左旋氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、加替沙星作為競爭抗原，采用間接競爭ELISA法作檢測曲線，采用Origin7.5軟件的四參數(shù)對數(shù)函數(shù)式(1)對ciELISA數(shù)據(jù)進行處理和曲線擬合［7－8］。

式中，A為曲線漸進線最大值，等于0濃度時的吸光度值，即Amax;B為曲線回折點處的斜率，即50%的Amax在曲線上對應(yīng)點的斜率;C為曲線回折點對應(yīng)的x值，等于50%的Amax所對應(yīng)的藥物濃度，即IC50;D為曲線漸進線最小值，等于背景值，即Amin。

1.2.5.2 識別特性評價 根據(jù)下式計算交叉反應(yīng)率［9－10］，以交叉反應(yīng)率評價識別特性。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的紫外光譜法鑒定

將各溶液進行適當?shù)南♂?偶聯(lián)產(chǎn)物按蛋白計)，經(jīng)紫外掃描得各溶液的紫外吸收光譜圖(圖1、圖2)。OFL分子結(jié)構(gòu)中至少有3個基團可作為偶聯(lián)的部位，即哌嗪環(huán)上的亞氨基、3－位碳原子的羧基和4－位碳原子上的羰基。本實驗選擇OFL分子結(jié)構(gòu)中3位碳原子上的羧基作為偶聯(lián)反應(yīng)所需的基團。BSA與OVA是兩種常用的載體［11］，它們分別有60和20個游離的氨基，這些氨基可以和OFL分子結(jié)構(gòu)中3位碳原子上的羧基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，形成肽鍵，從而形成穩(wěn)定的合成產(chǎn)物。由圖1、圖2可以看出，BSA、OFL、OFL－A－BSA三者的紫外吸收光譜均有顯著的差異，合成的抗原的最大特征吸收峰與OFL和BSA均不同，人工抗原在340nm左右明顯呈現(xiàn)出OFL 的特征，說明 OFL 偶聯(lián)成功［6］。同理，OFL－DBSA、OFL－A－OVA及 OFL－D－OVA 三者的紫外光譜圖也證明抗原偶聯(lián)是成功的。

圖1 免疫原的紫外吸收光譜

圖2 包被原的紫外吸收光譜

根據(jù)文獻方法［6］計算可知，OFL－A－BSA、OFLD－BSA、OFL－A－OVA 和 OFL－D－OVA 的偶聯(lián)的結(jié)合比分別為19.67、3.03、1.93 和0.99。

2.2 免疫血清的效價和抑制的測定

OFL－A－BSA免疫所得抗血清用 OFL－A－OVA包被的酶標板檢測后，發(fā)現(xiàn)效價曲線與抑制曲線有明顯差別，且陰性對照數(shù)值都比較低(圖 3－a、圖3－b)，說明OFL－A－BSA抗血清產(chǎn)生了消旋氧氟沙星的抗體。但是OFL－D－BSA免疫所得抗血清用OFL－D－OVA包被的酶標板檢測后，效價曲線與抑制曲線卻沒有明顯差別，說明OFL－D－BSA抗血清特異性較差。

圖3 免疫抗血清A1和A2的效價和抑制

2.3 多克隆抗體的交叉反應(yīng)性的測定

OFL－A－BSA抗血清的交叉反應(yīng)條件如下:取A1小鼠血清以1∶16000稀釋。其中消旋氧氟沙星的藥物濃度從10000ng/mL開始，按10倍稀釋梯度稀釋;左旋氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星和加替沙星的藥物濃度都從10000ng/mL開始，15倍稀釋梯度稀釋。由表1可以看出，用間接競爭ELISA法檢測消旋氧氟沙星，線性檢測范圍為 16.35～444.10ng/mL，IC50為5.42ng/mL，最低檢測限為6.23ng/mL。

消旋氧氟沙星抗體與左旋氧氟沙星的交叉反應(yīng)率為120.08%，與右旋氧氟沙星的交叉反應(yīng)率為101.30%，說明消旋氧氟沙星抗體對左旋氧氟沙星和右旋氧氟沙星的識別并非對等，對左旋的識別能力大于對右旋的識別力，左旋氧氟沙星對抗體的產(chǎn)生起主要作用。消旋氧氟沙星抗體與恩諾沙星的交叉反應(yīng)率為2.88%，從結(jié)構(gòu)上看(表1)，恩諾沙星由環(huán)丙烷替代了消旋氧氟沙星上3環(huán)的結(jié)構(gòu)，4環(huán)結(jié)構(gòu)中增加1個CH3基團，側(cè)鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，其性質(zhì)隨之變化，恩諾沙星交叉反應(yīng)率低，說明側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)對交叉反應(yīng)有較大影響。環(huán)丙沙星與消旋氧氟沙星的結(jié)構(gòu)相比，環(huán)丙烷替代了消旋氧氟沙星上3環(huán)的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)差異較大，導(dǎo)致半數(shù)抑制濃度IC50值增加，交叉反應(yīng)率降低。加替沙星的結(jié)構(gòu)與環(huán)丙沙星相比，4環(huán)上多一個CH3基團，2環(huán)上多一個CH2O基團，這兩個基團同時存在，使加替沙星與環(huán)丙沙星在結(jié)構(gòu)上消除了空間位阻效應(yīng)，因此，消旋氧氟沙星對加替沙星和環(huán)丙沙星的交叉反應(yīng)率幾乎相等，但加替沙星和環(huán)丙沙星都與消旋氧氟沙星在側(cè)鏈結(jié)構(gòu)上有很大的差異，所以對這兩者的交叉反應(yīng)率都很低。綜上所述，消旋氧氟沙星抗體與恩諾沙星、環(huán)丙沙星、加替沙星等同類其他藥物的交叉反應(yīng)率很低，說明該抗體具有很好的特異性。

3 討論

建立靈敏特異的氧氟沙星的ELISA方法需要靈敏特異的抗氧氟沙星抗體。氧氟沙星是小分子物質(zhì)，屬半抗原，只具有反應(yīng)原性而沒有免疫原性，不能直接刺激動物機體產(chǎn)生抗體，必須與大分子載體蛋白進行偶聯(lián)才能作為免疫原。氧氟沙星分子結(jié)構(gòu)中含有羧基，因此可通過中間物NHS在EDC等有機溶劑的作用下與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合形成蛋白質(zhì)與小分子的偶聯(lián)物。本實驗采用直接EDC法和活潑酯法兩種方法進行偶聯(lián)，用直接EDC法合成的免疫原免疫小鼠沒有產(chǎn)生針對消旋氧氟沙星的抗體，其原因是由于直接EDC法易形成蛋白質(zhì)間的聚合物，而不是均一產(chǎn)物，也可能是偶聯(lián)比較低所致;而活潑酯法，在直接EDC法的基礎(chǔ)上，使用NHS，避免了載體間的偶聯(lián)，產(chǎn)物比較單一。

消旋氧氟沙星抗體的特異性可以通過與各種喹諾酮類化合物的交叉反應(yīng)來評價。理論上，抗原同抗體結(jié)合時，距離同半抗原與載體蛋白結(jié)合點最遠的分子部分優(yōu)先被抗體識別。喹諾酮類藥物在結(jié)構(gòu)上相近，有共同特征，因此喹諾酮類藥物抗體往往會與同類藥物產(chǎn)生交叉反應(yīng)。在本實驗中，免疫原是通過消旋氧氟沙星上的羧基與載體蛋白上的氨基連接合成的，在這個連接中，氧氟沙星上離連接點最遠的基團是哌嗪基部分。左旋氧氟沙星的哌嗪基通過一個氮原子與甲基相連，因此與消旋氧氟沙星抗體表現(xiàn)出較高的交叉反應(yīng)。

長期以來，人們一直把對映體當作同一種物質(zhì)來看待。事實上，對映體的性質(zhì)在各向同性的環(huán)境中完全一樣，而在各向異性的環(huán)境中則往往不同。研究表明，不同的對映體在人體內(nèi)的藥理、代謝過程、毒性和療效存在著顯著差異，大致有以下6個類別:兩種對映體的藥理活性可相互協(xié)同，具有互補作用［12］;對映體活性不同，可開發(fā)成 2 個藥物［13］;兩種對映體一種有治療藥理活性，另一種產(chǎn)生毒副作用［14］;對映體具有相反的活性［15］;一個對映體具有顯著的活性但其對映體活性很低或無活性［16］;兩種對映體有等同或相類似的藥理活性，但作用強度有差異［17］。在自然狀態(tài)下，手性藥物的多種構(gòu)型雖然化學(xué)組成一樣，但它們各自的毒性、生理活性和藥理作用往往存在著差別，產(chǎn)生這種差別的主要原因是:生命機體本身是由具有高度不對稱性的生物大分子組成，這種不對稱性賦予生物大分子通過一定的信息去識別不同的對映性的能力，使得與之契合者才能發(fā)生相互作用，從而產(chǎn)生生理活性。

表1 不同種藥物的抑制中濃度和交叉反應(yīng)

1894年，F(xiàn)isher報道了一種底物的結(jié)構(gòu)對酶活性的影響，1904年，激素受體的立體選擇性(手性)被報道。從那以后，有許多關(guān)于蛋白質(zhì)立體選擇和對應(yīng)選擇的事例被發(fā)現(xiàn)。許多科學(xué)家認為，手性是蛋白質(zhì)內(nèi)在的性質(zhì)，在某種程度上，抗體對研究蛋白質(zhì)的立體選擇性來說是一個非常好的模型系統(tǒng)［18］。Landsteiner的經(jīng)典抗體理論表明，如果一個蛋白質(zhì)能跟連在手性中心上的配位體中的原子相互作用，那么它就可能具有立體選擇性。氧氟沙星是喹諾酮抗生素中的一員，它能抑制II型異構(gòu)酶的活性，II型異構(gòu)酶能使松弛的DNA超螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)樨摰某菪问健Ｔ趯@些藥物抑制機制及DNA異構(gòu)酶相互作用的一系列研究中，發(fā)現(xiàn)左旋氧氟沙星比右旋氧氟沙星對雙股小牛胸腺DNA的連接更加有效。這兩個異構(gòu)體在親和吸附性上的區(qū)別大概相差五倍，這比其他已知的異構(gòu)體的差異要大［19］。右旋氧氟沙星在存在和缺乏DNA情況下的圓二色譜與左旋氧氟沙星的最大不同在于對應(yīng)異構(gòu)體的親和吸附性上。LDr的結(jié)果表明，氧氟沙星的兩個對應(yīng)異構(gòu)體在分子平面和DNA螺旋軸之間的角度及約束幾何參數(shù)是相似的，在親和吸附性上的區(qū)別可能不是由氧氟沙星在它的束縛位點上的幾何排列的原因造成的［20］。因此，親和吸附性上的區(qū)別不能直接體現(xiàn)它們在抗藥性上的區(qū)別［21］，只有在對映體形態(tài)水平上研究手性污染物的分離、分析、環(huán)境變化等問題，才能闡明其在環(huán)境中的行為和效應(yīng)，準確評價其對人類健康和生態(tài)系統(tǒng)的風險性。在手性水平上研究食品污染物問題，已經(jīng)逐漸成為國際前沿領(lǐng)域［22－23］。

4 結(jié)論

4.1 紫外掃描圖譜證明四種抗原均合成成功，OFLA－BSA、OFL－D－BSA、OFL－A－OVA 和 OFL－D－OVA的偶聯(lián)比分別為19.67、3.03、1.93和0.99。

4.2 消旋氧氟沙星的間接競爭ELISA法的線性檢測范圍為 16.35～444.10ng/mL，IC50為 5.42ng/mL，最低檢測限為6.23ng/mL。

4.3 消旋氧氟沙星抗體具有較高的特異性，對左旋氧氟沙星和右旋氧氟沙星的識別并非對等，對左旋的識別能力大于右旋，左旋氧氟沙星對抗體的產(chǎn)生起主要作用。

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Study on monoclonal antibodies preparation and
chiral recognition characteristics against racemic ofloxacin

WANG Wei－h(huán)ua，LEI Hong－tao*，SUN Yuan－ming*，WANG Li－ying，WANG Bao－ling

(College of Food Science，South China Agricultural University/Key Laboratory of Food Quality and Safety of Guangdong Province，Guangzhou 510642，China)

Active ester method and direct EDC method were used to synthesize two kinds of coating antigens(OFL－A－OVA and OFL－D－OVA)and two kinds of immunity antigens(OFL－A－BSA and OFL－D－BSA).The objective of experiment was to product artificial antigen and polyclonal antibodies against racemic ofloxacin(OFL)，then by which balb/c mice were immunized and acquired polyclonal antibodies.Meanwhile，racemic ofloxacin residual immunity examination method was established.The results indicated that four artificial antigens synthesized successfully proved by ultraviolet scanning.Happen to carrier protein ratios of OFL－A－BSA，OFL－D－BSA，OFL－A－OVA and OFL－D－OVA were 19.67，3.03，1.93 and 0.99，respectively.Detection scope of racemic ofloxacin with indirect competitive ELISA was 16.35～444.10ng/mL，and IC50value was 5.42ng/mL，and detection limit was 6.23ng/mL.The cross reaction rates between racemic ofloxacin antibody and enrofloxacin，ciprofloxacin，or gatifloxacin were low，which indicated racemic ofloxacin had high specificity.Meanwhile，the abilities were not on balance with greater recognition for L－ofloxacin than D－ofloxacin.L－Ofloxacin played a major role for production of antibody which had high affinity and specificity.

ofloxacin;artificial antigen;polyclonal antibodies;cross reaction rate;chiral recognition

Q939.91

A

1002－0306(2011)09－0198－05

2010－06－21 *通訊聯(lián)系人

王偉華(1977－)，女，博士研究生，講師，研究方向:食品質(zhì)量安全。

國家自然科學(xué)基金(20877029，30700663);廣東省科技項目(cgzhzd0808，2009B040500002，2009A01010004)。