唐 蕾，董曉璇，李珍愛(ài)，孫慧慧，楊瑞金，毛忠貴，*

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122;

2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122)

產(chǎn)β-半乳糖苷酶的節(jié)桿菌誘變選育及培養(yǎng)基優(yōu)化

唐 蕾1，董曉璇1，李珍愛(ài)1，孫慧慧1，楊瑞金2，毛忠貴1，*

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122;

2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122)

酶法合成乳果糖需要使用同時(shí)具備水解和轉(zhuǎn)苷活力的β－半乳糖苷酶為催化劑。采用物理誘變，培養(yǎng)基優(yōu)化手段，以提高細(xì)菌產(chǎn)該類β－半乳糖苷酶的能力為目的，自然篩選獲得的具有轉(zhuǎn)苷能力的節(jié)桿菌Arthrobacter sp.，經(jīng)紫外線照射處理，采用5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X－gal)為平板篩選顯色劑，加之搖瓶發(fā)酵篩選，得到8株產(chǎn)酶水平明顯提高的誘變株，其中Arthrobacter sp.M2酶活力較野生株提高了89%，傳代5次酶活基本穩(wěn)定。采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基，結(jié)果表明:在乳糖濃度為10g/L，玉米漿濃度為22g/L，F(xiàn)e3+濃度為1.5mmol/L時(shí)效果最佳，酶活水平進(jìn)一步提高了113%。紫外誘變和培養(yǎng)基優(yōu)化有效地提高了節(jié)桿菌產(chǎn)β－半乳糖苷酶的水平。

節(jié)桿菌，紫外誘變，β－半乳糖苷酶

乳果糖是由半乳糖和果糖以β－1，4－糖苷鍵結(jié)合而成的二糖，它可以促進(jìn)雙歧桿菌增殖，具有調(diào)整腸道菌群平衡，治療肝性腦病、降低內(nèi)毒素、預(yù)防結(jié)腸息肉術(shù)后復(fù)發(fā)等功效，因而已被很多國(guó)家應(yīng)用于藥物和功能性食品中［1－3］。目前乳果糖的生產(chǎn)有化學(xué)合成與生物轉(zhuǎn)化兩種?；瘜W(xué)合成主要是用堿液處理將乳糖異構(gòu)化，其缺點(diǎn)在于生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的有色副產(chǎn)物難以去除，造成分離純化成本高，而且堿液對(duì)乳果糖的降解降低了產(chǎn)量［4－6］。生物轉(zhuǎn)化法利用全細(xì)胞或者純化的酶，催化底物乳糖和果糖合成乳果糖，目前使用的商用乳果糖合成酶主要是來(lái)自乳酸克魯維酵母的β－半乳糖苷酶，但在用該酶合成乳果糖的過(guò)程中夾雜了其他低聚糖的生成［7］。本實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道了從自然分離得到的節(jié)桿菌Athrobacter sp.具有專一合成乳果糖的能力［8］，但是作為原始出發(fā)菌株，酶活水平較低，需要進(jìn)行改造，并配合適宜的產(chǎn)酶條件，以提高產(chǎn)酶量。為此本文采用紫外誘變處理，篩選酶活性提高的突變株，并通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化，進(jìn)一步提高產(chǎn)酶水平。

表2 正突變菌株的β－半乳糖苷酶活水平及酶活提高率

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

節(jié)桿菌Arthrobacter sp. 由本實(shí)驗(yàn)室篩選得到;固體培養(yǎng)基(g/L) NaCl 5、酵母膏5、蛋白胨10、瓊脂20;液體培養(yǎng)基(g/L) 乳糖20、酵母膏5、蛋白胨10;篩選培養(yǎng)基(g/L) 乳糖20、酵母膏5、蛋白胨10、X－gal 0.3、瓊脂20;酵母膏、蛋白胨 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，生物試劑;鄰硝基苯－β－D－半乳糖苷(ONPG)、X－gal 上海生物工程有限公司，分析純。

超聲破碎儀 Ultrasonic Processor，美國(guó);Unico UV－2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;TGL－16G臺(tái)式高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;旋轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u瓶柜 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 β－半乳糖苷酶酶活測(cè)定 將固體培養(yǎng)基上的Arthrobacter sp.接種于液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/m in振蕩培養(yǎng)18h，離心收集菌體，菌體重懸于50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)中，超聲破碎、離心制成粗酶液。在試管中加入 2.5m L、100mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)，37℃恒溫水浴預(yù)熱后，加入粗酶液和ONPG，37℃反應(yīng)10m in，加入 1mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，測(cè)定420nm處的吸光值。采用國(guó)際酶活單位，規(guī)定1min催化ONPG水解生成1μmoL鄰硝基酚的酶量為一個(gè)酶活單位(U)。

1.2.2 紫外誘變方法 將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液，離心收集菌體，加入無(wú)菌生理鹽水離心洗滌2次后，轉(zhuǎn)入裝有滅菌玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)振蕩，打散菌體，并調(diào)整細(xì)胞濃度至108/m L。取5m L菌液加到直徑9cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于15W紫外燈下，距離30cm，分別照射 30、60、90、120、150s，取未照射的菌液和照射的菌液各0.5m L進(jìn)行梯度稀釋，涂布于固體培養(yǎng)基上，30℃避光培養(yǎng)72h，計(jì)算致死率。選擇致死率為70%的照射時(shí)間進(jìn)行紫外照射，取照射后的菌液2m L置于液體培養(yǎng)基中(250m L搖瓶，裝液量為25m L)，30℃下120 r/m in振蕩培養(yǎng)5h，稀釋涂布于篩選培養(yǎng)基上，30℃避光培養(yǎng)72h，挑選深藍(lán)色的菌落，搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定酶活水平。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn) 選擇影響產(chǎn)酶的4個(gè)主要因素(表1)，根據(jù)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表配制9種液體培養(yǎng)基，接種，30℃下200 r/m in振蕩培養(yǎng)18h，測(cè)定酶活。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外照射致死率

由圖1可知，隨著紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率增加，照射時(shí)間為60s時(shí)致死率達(dá)到70%，將該劑量作為紫外誘變最適劑量。

圖1 紫外照射的致死率曲線

2.2 突變株篩選

利用β－半乳糖苷酶分解X－gal使其變?yōu)樗{(lán)色的特點(diǎn)，從平板上挑取深藍(lán)色菌落，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，破碎細(xì)胞，測(cè)定β－半乳糖苷酶酶活。表2列出了產(chǎn)酶水平明顯提高的8株菌的酶活水平，并與出發(fā)菌株進(jìn)行了比較，其中M2酶活提高最大，產(chǎn)酶水平較出發(fā)株提高了89%，遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明該突變株連續(xù)傳代5次，酶活水平基本穩(wěn)定(表3)。

表3 突變株M2的遺傳穩(wěn)定性

2.3 培養(yǎng)基成分及pH對(duì)產(chǎn)酶水平的影響

2.3.1 碳源的影響 碳源不僅影響到微生物的生長(zhǎng)，而且關(guān)系到酶的誘導(dǎo)與表達(dá)。為此，本文選取了1%單糖(葡萄糖、半乳糖)、雙糖(乳糖、果糖和蔗糖)以及多糖(糊精)為碳源，考察其對(duì)β－半乳糖苷酶的影響，培養(yǎng)基中的其他成分為酵母膏0.5%、蛋白胨1%，以酶活性最高者為100%，結(jié)果表明，在沒(méi)有乳糖誘導(dǎo)物存在的條件下，Arthrobacter sp.M2的β－半乳糖苷酶為低水平組成型表達(dá)，乳糖能夠促進(jìn)其合成(圖2)。進(jìn)一步的研究表明，乳糖的適宜濃度為1%。

2.3.2 氮源的影響 氮源作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的一個(gè)主要元素，對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶發(fā)揮著重要的作用。本文以1%乳糖為碳源，考察了1%的蛋白胨、酵母膏、玉米漿、NH4Cl、尿素、(NH4)2SO4對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果表明玉米漿為適宜的氮源(圖3)。進(jìn)一步的研

圖3 氮源對(duì)Arthrobacter sp.M2發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.3.3 培養(yǎng)基初始pH的影響 培養(yǎng)基中的pH關(guān)系到細(xì)胞膜所帶電荷，從而影響細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及產(chǎn)物的分泌。在本文所考察的pH范圍內(nèi)，Arthrobacter sp.M2產(chǎn)酶的適宜pH為7.0(圖4)。

圖2 碳源對(duì)Arthrobacter sp.M2發(fā)酵產(chǎn)酶的影響究表明，玉米漿的適宜濃度為2%。

圖4 培養(yǎng)基初始pH對(duì)Arthrobacter sp.M2發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 在對(duì)培養(yǎng)基碳、氮源、初始pH研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合三價(jià)鐵離子對(duì)β－半乳糖苷酶的促進(jìn)作用，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表，設(shè)計(jì)了9組實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化M2產(chǎn)酶培養(yǎng)基，結(jié)果如表4所示。極差分析表明，各因素對(duì)酶活的影響程度依次為A＞D＞C＞B，即乳糖濃度對(duì)Arthrobacter sp.M2發(fā)酵產(chǎn)β－半乳糖苷酶的影響最大，其次為初始pH和Fe3+濃度，玉米漿濃度對(duì)其影響較小。A2B3C2D2為最優(yōu)水平組合，即乳糖濃度為10g/L，玉米漿濃度為22g/L，F(xiàn)e3+濃度為1.5mmol/L，初始 pH 為7。由于正交實(shí)驗(yàn)中不包含該組合，進(jìn)一步做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，酶活達(dá)到1.875U/m L，因此該培養(yǎng)基為最佳實(shí)驗(yàn)組合。

3 結(jié)論

3.1 以具有轉(zhuǎn)苷活力的節(jié)桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)紫外線照射，用致死率達(dá)到70%的照射時(shí)間處理細(xì)胞，在含有X－gal的篩選培養(yǎng)基上，篩選深藍(lán)色突變株，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，得到8株酶活水平顯著提高的菌株，其中產(chǎn)酶能力最強(qiáng)的Arthrobacter sp.M2酶活力較出發(fā)菌株提高了89%，連續(xù)傳代5次，穩(wěn)定性良好。

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

3.2 比較碳源、氮源對(duì)Arthrobacter sp.M2產(chǎn)酶影響，結(jié)果表明乳糖、玉米漿對(duì)產(chǎn)酶有利，進(jìn)一步的正交優(yōu)化得到最佳培養(yǎng)基為:乳糖濃度10g/L，玉米漿濃度22g/L，F(xiàn)e3+濃度1.5mmol/L，初始 pH7。

3.3 紫外誘變結(jié)合培養(yǎng)基優(yōu)化有效地提高了節(jié)桿菌產(chǎn)β－半乳糖苷酶的水平。

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Mutagenesis，screening and medium optimization for the production enhancement ofβ－galactosidase from Arthrobacter

TANG Lei1，DONG Xiao－xuan1，LIZhen－ai1，SUN Hui－h(huán)ui1，YANG Rui－jin2，MAO Zhong－gui1，*
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China;
2.School of Food Science ＆ Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

The enzymatic synthesis of lactulose needs the β － galactosidase with both hydolysis and transgalactosylation activities as catalyst.Improving the productivity of such kind of enzyme is necessary. Naturally isolated Arthrobacter sp. was mutated with ultraviolent radiation. The mutants with higher β － galactosidase productivities were obtained by the screening on the selective medium with 5－bromo－4－chloro－3－indolyl－β－Dgalactopyranoside(X－ gal) as indicator and then by the liquid fermentation. The productivity of the best mutant Arthrobacter sp.M2 was 89% higher than the wild type.The optimum medium for the β－galactosidase production determined through orthogonal test was lactose 10g /L，corn syrup 22g/L，F(xiàn)e3+1.5mm ol/L.The productivity was futher increased 113%using the optimized medium.Ultraviolet mutagenesis combined with medium optimization improved the productivity ofβ－galac tosidase from Arthrobacter effectively.

Arthrobacter sp.;ultraviolet mutagenesis;β－galac tosidase

TS201.3

A

1002－0306(2011)07－0192－03

2010－06－22 *通訊聯(lián)系人

唐蕾(1966－)，女，博士，副教授，研究方向:發(fā)酵工程。

國(guó)家863探索項(xiàng)目(2006AA10Z336)。