李 紅，陶 靜，李 穎

(鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州 450002)

L-抗壞血酸棕櫚酸酯的酶法合成

李 紅，陶 靜，李 穎

(鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州 450002)

詳細研究了脂肪酶在有機溶劑中催化合成L－抗壞血酸棕櫚酸酯的反應，并且對影響產物濃度的幾種主要因素進行討論(如脂肪酶、溶劑、溫度、底物比、添加劑)，首次通過加入相轉移劑提高反應產物濃度，確定了合成L－抗壞血酸棕櫚酸酯的最適反應條件:3mL叔戊醇為溶劑，催化劑為Novozyme435，其最佳用量為0.05g，底物棕櫚酸與抗壞血酸摩爾比3∶1，0.3g 4A分子篩作為吸水劑，0.3g四丁基溴化銨作為相轉移劑，反應溫度50℃，反應時間72h，得到產物濃度為16.6mg/mL。

L－抗壞血酸棕櫚酸酯，Novozyme435，叔戊醇，四丁基溴化銨

隨著人們生活水平的提高，人們對食品和食品添加劑的安全性越來越重視。L－抗壞血酸棕櫚酸酯(圖1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型“綠色”、多功能抗氧化劑。研究已表明，其安全性、穩(wěn)定性和抗氧化性均優(yōu)于目前常用的合成抗氧化劑BHA、BHT等，是世界衛(wèi)生組織、食品藥品聯(lián)合委員會認可的營養(yǎng)型抗氧化劑，并為英國、美國藥典收載，已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化妝品和紙制品等領域［1－4］。目前，L－抗壞血酸棕櫚酸酯合成方法主要有直接酯化法［5－6］、酯交換反應法［7－8］、酰鹵酯化法［9］及酶催化合成法［10－13］，其中，酶催化合成法由于具有選擇性高、副反應少、反應條件溫和、產品下游分離操作相對簡單、對設備要求不高等優(yōu)點，符合清潔生產、綠色化工的發(fā)展趨勢，越來越受到人們的重視［10－13］。國內湯魯宏［14］等研究了叔戊醇中NOVO 435催化下L－抗壞血酸棕櫚酸酯的合成，產物濃度僅12.5g/L。于是，通過改變反應條件，提高產物濃度，成為酶法合成L－抗壞血酸棕櫚酸酯研究熱點之一。本文針對該反應為可逆反應，考慮通過加入一定量的吸水劑調節(jié)反應體系中的水分含量，使反應向正方向進行，此外，水分含量的不同，將影響到反應體系中的酶活力，進而影響反應產物濃度;同時，因原料中棕櫚酸為脂溶性，而L－抗壞血酸為水溶性的溶解性特點，于是設想能否通過加入一定量的相轉移劑增加有機相中L－抗壞血酸的量來促進反應進行，實現(xiàn)對酶法合成L－抗壞血酸棕櫚酸酯工藝的優(yōu)化。

圖1 L－抗壞血酸棕櫚酸酯

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

NOVO 435脂肪酶、LIPOLASE脂肪酶、TLIM脂肪酶 河南工業(yè)大學油脂化學研究室贈送;棕櫚酸、L－抗壞血酸、叔戊醇、己烷、氨水、氯化銨、濃鹽酸、鉬酸銨、硅酸鈉、4A分子篩、四丁基溴化銨、無水硫酸鈉 均為分析純。

BS200S型電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;85－2型恒溫磁力攪拌器 江蘇中大儀器廠;754型紫外可見分光光度計 上海第三分析儀器廠;HG101－1B電熱鼓風干燥箱 南京實驗儀器廠;WC－1型顯微熔點儀 溫度未校正，上海光學儀器廠;Bruker VEC－TOR22型紅外光譜儀 德國布魯克公司;Agilent LC/MSD Trap XCT質譜儀 美國Agilent公司。

1.2 L－抗壞血酸脂肪酸酯的合成方法

在由0.5mmol(0.088g)抗壞血酸和1.5mmol(0.384g)棕櫚酸，3m L溶劑組成的反應體系中，分別加入0.05g脂肪酶、0.3g吸水劑、0.3g相轉移劑四丁基溴化銨，在50℃的恒溫水浴中反應，控制轉速200 r/m in，反應72h后產物濃度用硅鉬蘭分光光度法［15］測定。

1.2.1 脂肪酶的選擇 在25m L具塞長試管中分別加入0.088g(0.5mmol)抗壞血酸、0.384g(1.5mmol)的棕櫚酸、0.05g脂肪酶(NOVO435、LIPOLASE和TLIM)、3m L叔戊醇，將試管放入轉速為200 r/m in、溫度為50℃的恒溫磁力加熱攪拌器中反應，72h后取樣檢測。

1.2.2 加酶量的選擇 在溫度為50℃，200 r/m in，3m L叔戊醇體系，棕櫚酸與L－抗壞血酸的摩爾比為3∶1，加入0.3g吸水劑、0.3g相轉移劑四丁基溴化銨條件下，分別加入 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06g 脂肪酶NOVO435，反應72h后取樣檢測。

1.3 L－抗壞血酸脂肪酸酯的紅外光譜測定

紅外光譜用Bruker VEC－TOR22型紅外光譜儀測定，KBr壓片，掃描范圍 4000～500cm－1。

1.4 L－抗壞血酸脂肪酸酯的質譜測定條件

質譜由Agilent LC/MSD Trap XCT質譜儀測定，采用電噴霧ESI離子源;電子能量70eV;傳輸線溫度275℃;離子源溫度200℃;采用負離子模式，母離子m/z 413;激活電壓1.5V;質量掃描范圍m/z 0～650。

2 結果與討論

2.1 脂肪酶的選擇

考察了NOVO 435，LIPOLASE，TLIM三種脂肪酶對L－抗壞血酸棕櫚酸酯合成反應的催化效果，結果見圖2。

圖2 脂肪酶對酯化反應產物濃度的影響

由圖2可以看出，LIPOLASE脂肪酶幾乎不存在催化此反應的功能，TLIM催化效果也比較差，72h后，產物濃度僅0.04mg/m L，NOVO 435催化此反應的效果最好，72h之后，產物濃度可達3.24mg/m L，因此，選擇NOVO 435作為酯化反應的催化劑。

2.2 吸水劑對酯化反應產物濃度的影響

由于L－抗壞血酸棕櫚酸酯合成反應是可逆反應，而且產物中有水生成，因此，考慮將反應體系中加入一定量的吸水劑，促使反應向正方向進行;此外，水分活度的不同，也將影響到反應體系中的酶活力，進而影響反應產物濃度，于是我們考察了無水Na2SO4及活化的4A分子篩對反應產物濃度的影響，結果見圖3。

從圖3可以看出，吸水劑無水Na2SO4及4A分子篩的加入可以明顯地促進反應的進行，且加入4A分子篩要比加入無水Na2SO4效果更好，一方面是因為吸水劑的加入有助于反應向生成產物的方向進行;另一方面可能是因為吸水劑的加入調整了反應體系的水分活度，更適于脂肪酶作用。因此，我們選擇加入4A分子篩作為吸水劑。

圖3 吸水劑對酯化反應產物濃度的影響

2.3 反應溶劑的選擇

反應溶劑作為酶反應的介質直接影響酶的催化活性和穩(wěn)定性。不僅如此，溶劑還能改變酶的特異性。酶在不同的有機溶劑中活力差別很大，酶活力和溶劑之間可能存在著某種定量關系模型。而且，L－抗壞血酸棕櫚酸酯的合成反應與一般的有機相合成反應有所不同，其底物是由L－抗壞血酸和棕櫚酸組成，而L－抗壞血酸極性很強，棕櫚酸非極性很強，因此要獲得高濃度的產物，就要求反應結束時，L－抗壞血酸和棕櫚酸的濃度都非常高，該反應需選擇一種親水性溶劑，即有一定極性，對抗壞血酸有一定溶解性，以保證從理論上獲得的產物濃度較高，同時極性又不宜太強，否則將造成酶的失活。于是研究了分別以水、叔戊醇、正己烷作為反應溶劑，結果見圖4。

圖4 溶劑對酯化反應產物濃度的影響

從圖4看來，水不適合作為此反應的介質。當反應在非極性較強的正己烷中反應時，可能由于溶解度的原因，雖然很適合酶的催化反應，但對抗壞血酸的溶解性較差，導致產物濃度依然很低。于是選擇極性處于兩者之間的叔戊醇，得到的產物濃度最高。

2.4 相轉移劑對酯化反應產物濃度影響

在L－抗壞血酸與棕櫚酸的酯化反應中，L－抗壞血酸是水溶性的，而棕櫚酸是脂溶性的，兩種反應物處在不同的相中，反應不容易進行。于是考慮通過加入一定量的相轉移劑—四丁基溴化銨，增加L－抗壞血酸在叔戊醇相中的溶解度，加速反應，結果見圖5。由圖5可以看出，加入四丁基溴化銨后，產物濃度有所提高，因此，我們選擇加入一定量的相轉移劑四丁基溴化銨。

圖5 相轉移催化劑對酯化反應產物濃度的影響

2.5 反應溫度對酯化反應產物濃度的影響

溫度對NOVO 435酶催化L－抗壞血酸與棕櫚酸的酯化反應的影響如圖6所示。

圖6 溫度對酯化反應產物濃度的影響

由圖6可見，溫度對L－抗壞血酸棕櫚酸酯的合成有較大的影響，溫度升高有利于該反應進行。當溫度在30～50℃時產物濃度迅速上升，在溫度為50℃時產物濃度達到最高。但溫度超過50℃時，隨著溫度的繼續(xù)升高，L－抗壞血酸棕櫚酸酯的產物濃度反而有所下降，主要是因為溫度過高使脂肪酶NOVO435逐漸失活，此外，溫度過高也會破壞抗壞血酸的結構，進而影響產物濃度。于是將反應溫度控制在50℃為宜。

2.6 底物比的選擇

脂肪酶催化該酯化反應是L－抗壞血酸和棕櫚酸反應生成酯和水的反應。要使反應徹底，就必須使反應物過量，或在反應中除去某產物，由于L－抗壞血酸微溶于叔戊醇，且反應結束后，仍有部分固態(tài)L－抗壞血酸，它在反應中的濃度可視為定值，因此，可以通過增加棕櫚酸的量促使反應進行。本實驗通過改變棕櫚酸與L－抗壞血酸的摩爾比，考察對產物濃度產生的影響，結果如圖7所示。

圖7 底物摩爾比對酯化反應產物濃度的影響

由圖7可見，體系中L－抗壞血酸棕櫚酸酯的濃度隨著棕櫚酸和L－抗壞血酸的摩爾比增大而增大，但當摩爾比超過3∶1時，反應產物濃度變化已經不明顯，說明此時酶已經被底物飽和，體系中過量的棕櫚酸對反應影響較小，因此，選擇最適棕櫚酸和L－抗壞血酸的摩爾比為3∶1。

2.7 體系中加酶量的選擇

脂肪酶固體顆粒直接懸浮于有機溶劑中，酶的加入量對于反應進程有相當大的影響。結果如圖8所示。

由圖8可知，體系中L－抗壞血酸棕櫚酸酯的質量濃度隨酶NOVO 435量的增大而增加，當加酶量達到0.05g時，繼續(xù)增加脂肪酶的用量，反應產物的質量濃度增加緩慢，說明，此時酶已經相對底物過剩。因此，體系中最適的加酶量為0.05g。

圖8 酶濃度對酯化反應產物濃度的影響

2.8 反應時間對酯化反應產物濃度的影響

體系中L－抗壞血酸棕櫚酸酯的質量濃度隨時間的變化情況如圖9所示。

圖9 時間對酯化反應產物濃度的影響

由圖9可以看出，反應時間在72h內，L－抗壞血酸棕櫚酸酯的濃度迅速上升，超過72h后，產物濃度升高緩慢，說明此時反應已經趨于平衡，再延長時間并不能有效增加體系中L－抗壞血酸棕櫚酸酯的質量濃度，因此，選擇最佳反應時間為72h。

2.9 產物的結構鑒定

由酶催化提純得到的產品為白色粉末，用熔點儀測定其熔點為110～113℃，在文獻報道的熔點范圍內(107～117℃)。從紅外光譜圖(圖10)中可以看出，在 3404cm－1處出現(xiàn) OH 的吸收峰，在 2918、2850cm－1處出現(xiàn) CH2的 C－H伸縮振動吸收峰，在1733cm－1處出現(xiàn)羧酸酯基伸縮振動吸收峰，1660cm－1附近的吸收峰為L－抗壞血酸中C=C雙鍵的吸收峰;指紋區(qū)的吸收峰(1466、1300、719cm－1)進一步提供了佐證，符合L－抗壞血酸棕櫚酸酯的結構特征。質譜圖(圖11)中的分子離子峰413.2(M－1)更加證實了產品即為L－抗壞血酸棕櫚酸酯。

圖10 L－抗壞血酸棕櫚酸酯的紅外光譜

圖11 L－抗壞血酸棕櫚酸酯的質譜圖

3 結論

本文研究了一種合成L－抗壞血酸棕櫚酸酯的方法，通過對催化合成L－抗壞血酸棕櫚酸酯反應的酶種類和介質進行篩選，發(fā)現(xiàn)在叔戊醇溶劑中用NOVO435催化L－抗壞血酸與棕櫚酸的酯化反應得到的產物濃度最高;同時，對影響合成L－抗壞血酸棕櫚酸酯的因素(溫度、吸水劑、相轉移劑、底物比、酶濃度、反應時間)進行探討，得到了脂肪酶催化合成L－抗壞血酸棕櫚酸酯的最佳反應條件為:3m L叔戊醇作為溶劑，棕櫚酸與L－抗壞血酸的摩爾比為3∶1，酶NOVO435用量為0.05g，以0.3g 4A分子篩作為吸水劑，0.3g四丁基溴化銨作為相轉移劑，在50℃下，反應72h，反應產物濃度可達16.6%。

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Synthesis of L－ascorbyl palmitate catalyzed by lipase

LIHong，TAO Jing，LIYing

(School of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China)

The synthesis of L－ascorbyl palmitate catalyzed by lipase in organic phase was studied.The optimized process conditions，such as enzyme，solvent，temperature，reactants and additive were determined.In the presence of0.05g Novozyme 435 as catalyst，0.3g of 4A molecular sieve and 0.3g of n－Bu4NBr as additive in 3m Ltert－amyl alcohol at 50℃，16.6mg/m L of L－ascorbyl palmitate was obtained in the reaction of palm itic acid and VCwith the molar ratio of 3∶1 after 72h.

L－ascorbyl palmitate;Novozyme 435;tert－am yl alcohol;tetrabutylammonium bromide

TS202.3

A

1002－0306(2011)08－0350－04

2010－01－07

李紅(1978－)，女，博士，副教授，主要從事食品化學方面的研究工作。

鄭州輕工業(yè)學院2008年博士基金項目(000420)。