呂曉玲，溫 娟，陶東川，劉迎旺，孫晶磊

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

植物甾醇及其環(huán)糊精包合物對(duì)高血脂小鼠降血脂實(shí)驗(yàn)研究

呂曉玲，溫 娟*，陶東川，劉迎旺，孫晶磊

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

目的:評(píng)價(jià)植物甾醇經(jīng)過(guò)β－環(huán)糊精及其衍生物包合作用對(duì)高血脂癥小鼠血脂指標(biāo)的影響。方法:將昆明小鼠分為6組，分別為正常組、高脂模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、植物甾醇組、β－環(huán)糊精/植物甾醇包合物組和羥丙基－β－環(huán)糊精/植物甾醇包合物組，建模給藥測(cè)定其血脂水平。結(jié)果:給予不同藥后，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和三個(gè)實(shí)驗(yàn)組均能顯著降低TC、LDL－C和AI水平，提高HDL－C水平，且三個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間各指標(biāo)均沒(méi)有顯著性差異。結(jié)論:植物甾醇有顯著的降血脂作用，而且經(jīng)過(guò)β－環(huán)糊精和羥丙基－β－環(huán)糊精包合后不影響其降血脂功能。

植物甾醇，包合作用，降血脂

植物甾醇(Phytosterol，PS)是以環(huán)戊烷全氫菲為骨架(又稱(chēng)甾核)的一類(lèi)天然活性物質(zhì)，安全性高，具有抑制人體對(duì)膽固醇吸收的作用［1］，可用于預(yù)防和治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化類(lèi)的心臟病，2000年9月，美國(guó)食品與醫(yī)藥管理局(DFA)批準(zhǔn)添加了植物甾醇和植物甾醇酯的食品可以使用“有益健康”的標(biāo)簽［2］。天然植物甾醇的溶解性較差(水中不溶，油相中溶解度低)，限制了其應(yīng)用。β－環(huán)糊精(β－CD)是由7個(gè)葡萄糖組成的大環(huán)低聚糖，空間結(jié)構(gòu)呈桶形，內(nèi)部疏水，外部親水，是典型的客體分子，可以包埋許多小分子物質(zhì)，在改善主體的水溶性、穩(wěn)定性及掩蓋不良?xì)馕斗矫鎽?yīng)用廣泛［3］。羥丙基－β－環(huán)糊精(HP－β－CD)是β－環(huán)糊精的衍生物。已有報(bào)道用β－CD對(duì)植物甾醇進(jìn)行包合［4］，以改善其水溶性，但還未見(jiàn)對(duì)植物甾醇與其環(huán)糊精包埋樣品進(jìn)行體內(nèi)降血脂功能評(píng)價(jià)的報(bào)道?？疾彀献饔檬欠裼绊懫浣笛δ?，對(duì)正確評(píng)價(jià)植物甾醇及其應(yīng)用產(chǎn)品的價(jià)值具有很重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康雄性昆明SPF小鼠72只 體重18～22g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;植物甾醇(w＞95%) 保定鑫泰生物化工有限公司;植物甾醇/β－環(huán)糊精包合物(包合物含量占13.69%)、植物甾醇/羥丙基－β－環(huán)糊精包合物(包合物含量占16.57%) 實(shí)驗(yàn)室自制;血脂康膠囊 北京北大維信生物科技有限公司;花生油 市售;總膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒 中生北控生物科技有限公司;其它試劑 均為分析純;吐溫80。

表1 小鼠喂養(yǎng)與灌胃量

Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司;恒溫加熱水浴鍋，湘儀離心機(jī)，高速分散乳化機(jī)，蝸旋振蕩器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 包合物的制備方法

1.2.1.1 植物甾醇(PS)與β－環(huán)糊精(β－CD)包合物的制備 采用飽和水溶液法，準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的β－CD，加入蒸餾水，沸水浴加熱溶解，室溫冷卻至40℃，于磁力攪拌器上攪拌30m in;準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的植物甾醇，用適量無(wú)水乙醇溶解后，用滴管緩慢加入到β－CD溶液中，反應(yīng)5h后，冷卻至室溫，置于冰箱4℃冷藏24h，抽濾，沉淀于60℃烘箱中干燥，得到包合物。

1.2.1.2 植物甾醇(PS)與羥丙基－β－環(huán)糊精(HP－β－CD)包合物的制備 配制1%的PS無(wú)水乙醇溶液25m L，于磁力攪拌器上50℃、中檔的攪拌速度攪拌，將摩爾比為4∶1的HP－β－CD緩慢地加入該溶液中，待反應(yīng)12h后，冷卻至室溫，置于冰箱4℃冷藏24h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，凍干得到HP－β－CD/PS包合物。

1.2.2 包合物的驗(yàn)證 采用差熱掃描法［6］、傅立葉紅外色譜［7］、紫外可見(jiàn)光波長(zhǎng)掃描、薄層色譜等驗(yàn)證方法，與二者的物理混合物相對(duì)比，包合物與其有明顯的差別［5］，證明包合物已形成。

1.2.3 高脂飼料的配方 普通基礎(chǔ)飼料:73.8%;蛋黃粉:10%;豬油:10%;膽固醇:1%;豬膽鹽:0.2%;蔗糖:5%。

1.2.4 動(dòng)物處理 受試小鼠先適應(yīng)性飼養(yǎng)3d，期間均喂養(yǎng)普通飼料，隨機(jī)將小鼠分成六組，每組12只［8］。禁食，小鼠眼眶取血，分離血清測(cè)定小鼠 TC與TG水平。分組后，正常組給予基礎(chǔ)飼料，其他組均給予高脂飼料，2～3周后，小鼠眼眶取血，試劑盒方法測(cè)定小鼠TC和TG，檢測(cè)高脂模型是否建立成功［9］。高脂模型建立成功之后，各組分別給予相應(yīng)的樣品及灌胃量。具體見(jiàn)表1，小鼠經(jīng)口灌胃［10］，兩周后小鼠眼球取血，斷頸處死，觀察植物甾醇及其環(huán)糊精包合物對(duì)小鼠脂質(zhì)代謝的影響。

1.2.5 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.2.5.1 TC、TG、HDL－C、LDL－C 的測(cè)定按照各試劑盒說(shuō)明測(cè)定。 動(dòng)脈硬化指數(shù)(AI)=LDL－C/HDL－C;肝臟系數(shù)(HI):將處死的小鼠分離肝臟，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱(chēng)其重量(g)，按下式計(jì)算:

1.2.5.2 肝臟中TC的測(cè)定 取肝臟組織的相同部位0.25g，加入5%生理鹽水，10000 r/m in勻漿10s，每例樣品勻漿2次，此過(guò)程要在冰浴中進(jìn)行。加一定量體積比為2∶1的三氯甲烷－甲醇溶液進(jìn)行萃取，在渦旋振蕩器上室溫振蕩 15m in，靜置 10～15m in，3500 r/m in離心10m in，棄去沉淀及上清液，取下清液適量于1.5m L離心管中，氮?dú)獯蹈?，加入適量的無(wú)水乙醇充分溶解，得到的液體為待測(cè)液，用試劑盒測(cè)定TC的含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0 statistics統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 包合物的驗(yàn)證

經(jīng)1.2.1.1與1.2.1.2方法制備β－CD/PS和HP－β－CD/PS包合物，通過(guò)1.2.2中包合物驗(yàn)證方法得到結(jié)果，二者包合物與相應(yīng)的物理混合物有明顯的差別，可以證明包合物形成。

2.2 小鼠高血脂模型的建立

建模前對(duì)各組小鼠進(jìn)行眼眶取血，測(cè)定血清TC、TG，通過(guò)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件單因素方差分析得知，小鼠各組間血清TC與TG沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明小鼠組與組之間沒(méi)有顯著性差異，分組成功。小鼠血清TC、TG結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 模型建立前各組小鼠血清TC、TG值(mmol/L)(n=12)

小鼠飼喂高脂飼料3周后，由表3表明，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和三個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠血清TC、TG等各項(xiàng)指標(biāo)都明顯升高，與正常組相比，TC具有顯著性差異(P＜0.01)，依次分別上升了44.9%、53.8%、48.8%、65.2%、55.8%，但模型組、陽(yáng)性組與三個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間TC值沒(méi)有顯著性差別，表明小鼠高脂模型建立成功。

表3 建模小鼠血清TC、TG的變化(mmol/L)(n=12)

2.3 治療后小鼠血脂的變化

2.3.1 血清中 TC、TG、HDL－C、LDL－C的變化 實(shí)驗(yàn)中所試藥物對(duì)高血脂小鼠血脂水平的影響如表4所示。由表4可知，模型組血清中TC、TG和LDL－C值較正常組有顯著提高(P＜0.01)，HDL－C值有顯著降低(P＜0.01)。與模型組相比，植物甾醇組、β－環(huán)糊精/PS包合物組和羥丙基－β－環(huán)糊精/PS包合物組小鼠血清中TC、LDL－C均有顯著性降低(P＜0.01)，HDL－C值有顯著性升高(P ＜0.01)，陽(yáng)性對(duì)照組(血脂康組)血清中TC有顯著性下降(P＜0.01)，LDL－C值也下降(P＜0.05)，HDL－C值有顯著性升高(P＜0.01)。三個(gè)實(shí)驗(yàn)組血清中 TC、LDL－C、HDL－C值都沒(méi)有差別。對(duì)于高血脂小鼠甘油三酯(TG)，六周后，模型組小鼠血清中TG與正常組相比，升高有顯著性差異(P＜0.01)，與模型組相比，植物甾醇組(P＜0.05)、β－CD/PS包合物組和 HP－β－CD/PS包合物組中TG降低具有顯著性(P＜0.01)，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間沒(méi)有明顯差別。由此可以說(shuō)明，植物甾醇被β－環(huán)糊精與羥丙基－β－環(huán)糊精的包合后，并沒(méi)有影響植物甾醇降血脂功能。

表4 各組小鼠血清中 TC、TG、HDL－C、LDL－C值(mmol/L)(n=12)

2.3.2 小鼠血脂綜合指數(shù)的變化 實(shí)驗(yàn)中所試藥物對(duì)小鼠血脂中動(dòng)脈硬化指數(shù)(AI)與TG/HDL－C比值的影響如表5所示。由表5可知，模型組與正常組相比，小鼠血脂中動(dòng)脈硬化指數(shù)AI、TG/HDL－C值顯著增高(p＜0.01)，與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、PS組、β－CD/PS包合物組和HP－β－CD/PS包合物組血脂中 AI、TG/HDL－C 比值均降低(P ＜0.01)，AI分別降低了44.37%、55.63%、51.66%、57.61%，TG/HDLC比降低了34.53%、50.67%、45.51%、43.05%，說(shuō)明植物甾醇與血脂康、植物甾醇環(huán)糊精包合物均可有效降低動(dòng)脈硬化指數(shù)，有顯著的抗動(dòng)脈硬化作用，可減少冠心病的發(fā)病率，有效預(yù)防和治療高血脂癥。而且，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間經(jīng)過(guò)組間分析，沒(méi)有顯著性差異，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，植物甾醇經(jīng)過(guò)環(huán)糊精的包合后，其降血脂功能性沒(méi)有被破壞或者降低。

表5 各組小鼠血清中動(dòng)脈硬化指數(shù)(AI)、TG/HDL－C值(n=12)

2.3.3 小鼠肝臟系數(shù)及肝臟脂質(zhì)的變化 高血脂小鼠取血后，按照1.2.5.1與1.2.5.2的方法計(jì)算小鼠肝臟系數(shù)和肝臟中的TC值如表6所示。由表6可知，模型組小鼠肝臟系數(shù)顯著高于正常組(P＜0.01)，陽(yáng)性對(duì)照組和植物甾醇組較模型組有極其顯著降低(P＜0.01)，β－CD/PS包合物組和 HP－β－CD/PS包合物組較模型組相比，有顯著的降低(P＜0.05)，但三個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間沒(méi)有明顯差異性(P＞0.05)。由肝臟中的TC值從表中數(shù)據(jù)可以看出，模型組、陽(yáng)性組以及三實(shí)驗(yàn)組肝臟中的TC值均比正常組高，但是陽(yáng)性組和三個(gè)實(shí)驗(yàn)組與模型組相比，有顯著性降低(P＜0.05)。而且三個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間沒(méi)有顯著性差異，就肝臟指標(biāo)來(lái)說(shuō)，進(jìn)一步表明植物甾醇經(jīng)過(guò)環(huán)糊精包合后，沒(méi)有影響其降血脂功能。

表6 各組小鼠肝臟及肝臟系數(shù)的變化(mmol/L)(n=12)

3 結(jié)論

用飽和水溶液法制備β－環(huán)糊精/植物甾醇與羥丙基－β－環(huán)糊精/植物甾醇包合物的方法可行，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，植物甾醇對(duì)高血脂癥小鼠血清總膽固醇(TC)、血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)、TG/HDL－C值、動(dòng)脈硬化指數(shù)(AI)以及小鼠肝臟系數(shù)(HI)和肝臟中TC均有顯著性的降低作用，對(duì)高密度脂蛋白膽固醇(HDL－C)有顯著的升高作用，且經(jīng)β－環(huán)糊精及其衍生物(羥丙基－β－環(huán)糊精)包合后，這些指標(biāo)并沒(méi)有受到影響，說(shuō)明經(jīng)過(guò)包合作用并不會(huì)影響其本來(lái)的降血脂功能，并且可以改善其溶解性等性質(zhì)，有利于植物甾醇及其環(huán)糊精包合物在食品中的應(yīng)用。

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Study on the experiment of reducing blood lipid of high blood cholesterol in mice for phytosterol and its cyclodextrin inclusion complexes

LV Xiao－ling，WEN Juan*，TAO Dong－chuan，LIU Ying－wang，SUN Jing－lei

(College of Food Science and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)

Objective:Evaluated the influence of phytosterol that was inclusion by β－cyclodextrin and its derivative to serum lip id indexes of mice of hyperlip idemia.Method:72 Kunming mice were randomly divided into six groups:normal group，model group，positive control group，phytosterol group，phytosterol/β－cyclodextrin inclusion group，phytosterol/hydroxypropyl－β－cyclodextrin inclusion group，after the model built and d rug delivered then analysed of serum lip id level in mice.Results:After medication，com paring with the model group，the level of serum TC，LDLC，AI decreased and HDL－C was improved obviously in positive control group and the three experimental groups，while there were no significant differences of the serum lipid indexes among the three experimental groups.Conclusion:The result shows that the phytosterol had obvious action of reducing blood lip id.And there had no influence on that when it was included by β－CD or HP－β－CD.

phytosterol;inclusion;reducing blood lipid

TS201.4

A

1002－0306(2011)09－0393－04

2010－09－09 *通訊聯(lián)系人

呂曉玲(1960－)，女，碩士，教授，主要從事食品添加劑與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控方面的研究。