楊 婷，武 蕓，2，*，鄭小江，2

(1.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點實驗室，湖北民族學(xué)院，湖北恩施 445000; 2.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北恩施 445000)

海金沙組培苗水溶性多糖和總黃酮綜合提取工藝優(yōu)化

楊 婷1，武 蕓1，2，*，鄭小江1，2

(1.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點實驗室，湖北民族學(xué)院，湖北恩施 445000; 2.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北恩施 445000)

研究了熱水浸提海金沙組培苗水溶性多糖和總黃酮綜合提取工藝的優(yōu)化。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選定提取溫度、提取時間及料液比進(jìn)行3因素3水平中心組合實驗，建立水溶性多糖和總黃酮的總得率二次回歸方程，通過響應(yīng)面分析得到較優(yōu)的綜合提取工藝參數(shù)為提取時間2.1h、提取溫度80.6℃和料液比1∶26.2(g/mL)。在此優(yōu)化條件下得到海金沙組培苗中水溶性多糖提取得率為13.241%，總黃酮得率為3.211%，二者總得率為16.452%。

海金沙，水溶性多糖，總黃酮，綜合提取，響應(yīng)面分析

海金沙(Lygodium japonicum)是海金沙科(Lygodiaceae)海金沙屬(Lygodium)多年生蕨類植物［1－3］，全草和成熟孢子均可入藥，有利水通淋、清熱解毒之功效，可治療尿路結(jié)石、尿路感染、腎炎水腫、濕熱腫滿、皮膚濕疹、腸炎痢疾、咽喉腫痛等癥狀。海金沙多糖是海金沙的有效成分之一，對細(xì)菌及真菌都有抑制作用，具有修復(fù)造血系統(tǒng)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗腫瘤、抗病毒和抗氧化等作用。海金沙黃酮具有抗腫瘤及抑菌作用，在臨床上，海金沙已作為一種中草藥應(yīng)用于防治腫瘤等疾病，將海金沙多糖、黃酮開發(fā)為天然藥物免疫促進(jìn)劑和調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于疾病防治方面具有重要意義［4－6］。目前對黃酮、多糖類化合物的提取、分離和含量測定方法較多［7－9］，而有關(guān)海金沙水溶性多糖和總黃酮的綜合提取研究還未見報道，本研究采用熱水浸提法對海金沙組培苗可溶性多糖和總黃酮的綜合提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)用響應(yīng)面分析法來確定其最佳提取工藝［10－16］，具有回歸方程精度高、實驗周期短、能同時研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點。本研究旨在為海金沙綜合開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

海金沙組培苗 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點實驗室(湖北民族學(xué)院)組培室提供，將海金沙組培苗先用自來水洗凈，再用蒸餾水沖洗2～3次，于55～60℃烘箱中烘至恒重，用粉碎機(jī)磨成粉末，過60目篩，裝于試劑瓶中，干燥器內(nèi)貯存?zhèn)溆?無水乙醇、95%乙醇、苯酚、正丁醇、氯仿、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、濃硫酸、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(含結(jié)晶水)、5%NaNO2、1mol/L NaOH、10%Al(NO3)3等 分析純，均由恩施市紅霞化工有限公司提供;水 雙蒸水。

SZ－93雙重蒸餾水器、植物樣品粉碎機(jī)、756MC－紫外分光光度計、RE－52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;HWS12電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;DGX型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司;S21－3磁力攪拌器 上海司樂儀器廠;pH計(PHS－3C)、冷凍干燥機(jī)、低速大容量多管離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;B－191噴霧干燥儀 瑞士。

1.2 實驗方法

1.2.1 海金沙組培苗多糖和黃酮綜合提取工藝流程

精確稱取海金沙組培苗粉末1.0g→熱水浸提水溶性多糖和總黃酮→離心→收集上清液→濃縮為適當(dāng)體積→加入3倍體積乙醇→低溫靜置24h→離心→

a.上清液→減壓濃縮→冷凍干燥→黃酮→30%微熱乙醇溶解→定容至50mL備用。

b.沉淀→再復(fù)溶醇沉一次→冷凍干燥→多糖→水溶并定容至50mL備用。

1.2.2 多糖含量測定 苯酚－硫酸法測定多糖含量［17－18］。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品17mg，置于50mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。每管加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和雙蒸水后立即混勻，待各管都加入苯酚試劑后，迅速搖勻，然后迅速加入濃硫酸5mL置于各試管中搖勻，之后置于40℃水浴中，準(zhǔn)確加熱15min后，立即取出置于流水中冷卻10min。再取出所有試管用1cm口徑的比色皿，以第一管為空白，迅速測定其余各管的吸光度。以糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)、吸光度(A490nm)為縱坐標(biāo)，繪出相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出線性回歸方程∶A=0.7940x－0.0304，R2=0.9990。

1.2.2.2 多糖含量測定 吸取3份5.0mL樣液置于3支具塞試管中，加苯酚1.0mL和濃硫酸5.0mL，同上做空白對照，于波長490nm處測定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算出葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/mL)。

式中，C為測得樣品溶液中葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/mL;V為樣品溶液的最終稀釋體積，mL;N為稀釋倍數(shù);m為樣品質(zhì)量，mg。

1.2.3 總黃酮含量測定

1.2.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 標(biāo)準(zhǔn)液制備∶準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0g(含結(jié)晶水)，用30%微熱乙醇溶解，倒入50mL容量瓶中，用30%乙醇定容得濃度為0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作∶準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL置于6支具塞試管中，加30%乙醇到5mL，加5%NaNO2溶液0.3mL，搖勻放置6min。再加入10%Al(NO3)3溶液0.3mL，搖勻放置6min后，加1mol/L NaOH溶液4mL，加30%乙醇0.4mL，搖勻后放置10～15min，于510nm處測定吸光度，以蘆丁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)、吸光度(A510nm)為縱坐標(biāo)，繪出相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出線性回歸方程∶A=1.1624x+ 0.017，R2=0.9998。

1.2.3.2 總黃酮含量測定 采用亞硝酸鈉－硝酸鋁－氫氧化鈉絡(luò)合分光光度法測定總黃酮含量。精確吸取3份5mL樣液置于3支具塞試管中，各加5% NaNO2溶液 0.3mL，搖勻后放置 6min，加入 10% Al(NO3)3溶液 0.3mL，搖勻后放置 6min，加入1moL/L NaOH溶液4mL，加對應(yīng)濃度乙醇0.4mL，搖勻后放置10～15min。以試劑空白作對照，于510nm波長處測定吸光度，求出3組平均值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣液中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

式中，C為測得樣品溶液中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/mL;V為樣品溶液的最終稀釋體積，mL;N為稀釋倍數(shù);m為樣品質(zhì)量，mg。

1.2.4 單因素實驗 分別以提取溫度、提取時間、料液比以及提取次數(shù)為單因素進(jìn)行實驗，考察各單因素對浸提液中水溶性多糖和總黃酮得率的影響。

溫度的影響∶精確稱取1.0g海金沙組培苗粉于錐形瓶中，加入25mL蒸餾水，在不同溫度的水浴中提取2h，連續(xù)提取2次，按1.2.1方法獲得水溶性多糖和總黃酮。所有實驗設(shè)計3組平行實驗，所得實驗結(jié)果為其平均值(以下同)。

料液比的影響∶精確稱取1.0g海金沙組培苗粉15份于錐形瓶中，分成3組，每組分別加入蒸餾水10、20、30、40、50mL，在80℃水浴鍋中提取2h，連續(xù)提取2次。

提取時間的影響∶稱取1.0g的海金沙組培苗干粉于錐形瓶中，加入蒸餾水30mL，在80℃的水浴鍋中提取一定時間，連續(xù)提取2次。

提取次數(shù)的影響∶稱取1.0g樣粉于錐形瓶中，各按1∶30料液比加入蒸餾水，80℃水浴鍋中提取2h，連續(xù)提取一定的次數(shù)。

1.2.5 中心組合實驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，確定中心組合實驗(CCD)的因素與水平，以測量粗多糖和黃酮的總提取量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析(RSA)對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。參考單因素實驗結(jié)果，根據(jù)Box－Benhnken中心組合實驗設(shè)計原理，以浸提溫度、料液比和浸提時間為因素設(shè)計中心組合實驗(見表1)。

表1 中心組合設(shè)計的因素與水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果分析

2.1.1 溫度對海金沙組培苗水溶性多糖和總黃酮提取得率的影響 結(jié)果(見圖1)顯示，海金沙組培苗總黃酮得率隨溫度升高先上升后下降，70℃達(dá)到最大值2.9%，在70～100℃時，隨溫度升高而下降的原因可能是高溫使黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)受到了破壞。其水溶性多糖得率隨著溫度的升高呈現(xiàn)上升趨勢，但在90～100℃時其得率略有下降。

圖1 溫度對黃酮和多糖得率的影響

2.1.2 料液比對海金沙組培苗水溶性多糖和總黃酮提取得率的影響 結(jié)果(見圖2)表明，在一定料液比范圍內(nèi)，海金沙黃酮和多糖含量隨蒸餾水體積的增加不斷升高，到料液比1∶40時達(dá)到最大值，而后略為下降。料液比1∶40(g/mL)比較理想。

圖2 料液比對黃酮和多糖得率的影響

2.1.3 提取時間對多糖和黃酮提取得率的影響 結(jié)果見圖3。由圖3可知，總黃酮的提取量隨著時間的延長先上升后略為下降，在提取2h時達(dá)到最高。多糖的提取量在一直呈上升趨勢，2h后變化不大。綜合分析，提取2h比較理想。

圖3 提取時間對多糖和黃酮得率的影響

2.1.4 提取次數(shù)對海金沙浸提液中多糖和黃酮提取得率的影響 結(jié)果(見圖4)表明，隨提取次數(shù)的增加，總黃酮和多糖得率都呈下降趨勢，第1次和第2次已經(jīng)將絕大部分的總黃酮和多糖提取出來了，第3、4次的提取物得率比較少，幾乎可以忽略不計。因此，本實驗選擇提取2次，提取物得率為兩次提取之和。

2.2 中心組合實驗結(jié)果分析

參考單因素實驗結(jié)果，根據(jù)Box－Benhnken中心組合實驗設(shè)計原理，以浸提溫度、料液比和浸提時間為因素設(shè)計中心組合實驗(見表1)，實驗結(jié)果見表2。

圖4 提取次數(shù)對多糖和黃酮得率的影響

表2 中心組合實驗方案與結(jié)果

在15個實驗中，1～12是析因?qū)嶒灒?3～15是中心實驗，用來估計實驗誤差。以海金沙組培苗水溶性多糖和總黃酮的總得率為響應(yīng)值(Y)，所得結(jié)果用響應(yīng)面分析軟件(SAS)分析，經(jīng)二次回歸擬合求得響應(yīng)函數(shù)，即回歸方程為∶

從表3的t檢驗方差分析表中可以看出，一次項中，浸提溫度對海金沙組培苗浸提液中水溶性多糖和總黃酮總得率的影響達(dá)到了極顯著水平;提取時間對其浸提液中多糖和黃酮總得率的影響達(dá)到了顯著水平;而料液比的影響不顯著。因此，影響浸提液中多糖和黃酮總得率的各因素按影響大小排序依次為提取溫度、提取時間、料液比。在交互項中對提取率有顯著影響，而其他因素之間的交互作用不顯著。

經(jīng)回歸方程方差分析，用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，因線性關(guān)系顯著(R2= 0.9918)，模型的顯著水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.01，此時該回歸方差模型是極顯著的，因此，該實驗方法可靠。而方程失擬誤差不顯著，這說明各因素值和響應(yīng)值之間的關(guān)系可以用此模型來函數(shù)化，可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結(jié)果進(jìn)行分析?；貧w方程各項的方差分析結(jié)果還表明，方程一次項和二次項影響極顯著，交互項不顯著，因此各實驗因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。

表3 t檢驗方差分析

表4 回歸方程的方差分析

從典型分析表(表5)中可以看出，3個因素的特征值都是負(fù)值，表明此二次響應(yīng)面存在極值。由SAS分析所得編碼值為∶X1=0.1653，X2=0.4824，X3= 0. 2154;由編碼值可得最佳工藝參數(shù)為∶提取時間2.1h、提取溫度80.6℃、料液比1∶26.2(g/mL)。在此優(yōu)化條件下對實驗結(jié)果進(jìn)行驗證實驗，得到海金沙中多糖提取量為13.241%，黃酮提取量為3.211%，二者總得率為16.452%，與理論預(yù)測值15.591% 基本相符，說明響應(yīng)面分析法對水溶性多糖和總黃酮提取量的優(yōu)化具有實際應(yīng)用價值。

表5 典型分析表

3 結(jié)論

本研究以海金沙組培苗為原料，利用熱水浸提乙醇沉淀的方法，以水溶性多糖和總黃酮的總得率作為評價指標(biāo)，用響應(yīng)面分析法對綜合提取水溶性多糖和總黃酮的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳綜合提取的工藝參數(shù)為∶提取時間2.1h、提取溫度80.6℃、料液比1∶26.2(g/mL)。在此優(yōu)化條件下得到海金沙組培苗中水溶性多糖提取得率為13.241%、總黃酮得率為3.211%，二者總得率為16.452%。本研究可為海金沙綜合開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

［1］江蘇醫(yī)學(xué)院.中藥大詞典［M］.上海:上海人民出版社，1978:1259.

［2］國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會.中華本草［M］.第一卷.上海:上海科技出版社，1999:443．

［3］中國科學(xué)院植物研究所.中國高等植物圖鑒［M］.第一冊.北京科學(xué)出版社，1985:215.

［4］蘇育才.海金沙多糖的分離純化及抗菌活性［J］.福建師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2005，21(4):76－79.

［5］張雷紅，范春林，葉文才，等，海金沙科植物的化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007，19(2): 552－557.

［6］丁利，孫俊，周送霞.超聲波輔助提取海金沙黃酮及其抑菌效果研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2009，25(10):1212－1215.

［7］江巍，鄭小江.海金沙總黃酮提取工藝研究［J］.湖北民族學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版，2010，28(2):222－225.

［8］肖懷秋，李玉珍.海金沙草總黃酮提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化［J］.氨基酸和生物資源，2010，34(3):68－72.

［9］武蕓，鄭小江，卜貴軍，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化海金沙草多糖的提取工藝［J］.食品科學(xué)，2010，31(18):108－111.

［10］羅祖友，楊曉，吳謀成.藤茶水溶性多糖及總黃酮的提取工藝研究［J］.食品科學(xué)，2005，26(5):156－160.

［11］孔娟，劉曉宇，王蕊霞，等.葛根多糖和黃酮綜合提取工藝優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2010，31(6):43－47.

［12］劉軍海，黃寶旭，蔣德超.響應(yīng)面分析法優(yōu)化艾葉多糖提取工藝研究［J］.食品科學(xué)，2009，30(2):114－118.

［13］胡成旭，侯欣彤，馮永寧，等.響應(yīng)面法優(yōu)化云芝多糖提取條件的研究［J］.食品工業(yè)科技，2007，28(7):124－130.

［14］王明艷，張小杰，王濤，等.響應(yīng)面法優(yōu)化香椿葉多糖的提取條件［J］.食品科學(xué)，2010，31(4):106－110.

［15］王振宇，夏祥慧，李宏菊.響應(yīng)面分析法優(yōu)化大果沙棘總黃酮提取工藝［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，37(6):30－32.

［16］Dong，JZ，Lu DY，Wang，Y.Simultaneous extraction and analysis of polyphenols from leaves of Lycium barbarum L［J］. Journal of Food Biochemistry，2011，35(3):914－931.

［17］王秀奇，秦淑媛，等.基礎(chǔ)生物化學(xué)實驗［M］.第二版.北京:高等教育出版社，1999:103－105.

［18］吳有煒.實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理［M］.蘇州:蘇州大學(xué)出版社，2002:

115－154.

Optimization of simultaneous extraction of water－soluble polysaccharides and total flavone from Lygodium japonicum by tissue culture

YANG Ting1，WU Yun1，2，*，ZHENG Xiao－jiang1，2
(1.Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province，Hubei Institute for Nationalities，Enshi 445000，China; 2.Biological Scientific and Technical College of Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China)

The comprehensive extraction technique of water－soluble polysaccharides and total flavone from tissue cultured Lygodium japonicum was studied.Based on single factor experiments，a central composite design(CCD) involving three variables such as extraction temperature，time and solid/liquid ratio at three levels was employed for establishing a quadratic regression model describing total extraction yield of water－soluble polysaccharides and total flavonoids at different levels of the above variables.The optimal technical conditions of extraction by central composite design and response surface analysis(RSA)were as follows:extraction time 2.1h，extraction temperature 80.6℃，solid/liquid ratio of 1∶26.2.Under the optimized conditions，the water－soluble polysaccharide yield was 13.241%，the total flavone yield was 3.211%，and both of the total extraction yield was 16.452%.

Lygodium japonicum;water－soluble polysaccharides;total flavone;simultaneous extraction;response surface analysis(RSA)

TS201.1

B

1002－0306(2011)11－0227－04

2011－08－18 *通訊聯(lián)系人

楊婷(1991－)，女，本科，研究方向:植物生物技術(shù)。

生物資源保護(hù)與利用湖北省重點實驗室開放課題(2011);湖北省科技廳創(chuàng)新團(tuán)隊項目(2009CDA155);2010年恩施州科技指導(dǎo)項目;湖北民族學(xué)院生科院大學(xué)生創(chuàng)新課題。