岳曉禹，徐 軍，張恒業(yè)，孫忠偉，李 欣，劉相東

(1.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校質(zhì)檢系，河南鄭州 450011; 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083; 3.蘇州國發(fā)創(chuàng)業(yè)投資控股有限公司，江蘇蘇州 215128)

貯藏玉米中優(yōu)勢腐敗霉菌M13的分離與鑒定

岳曉禹1，2，徐 軍1，張恒業(yè)1，孫忠偉3，李 欣1，劉相東2

(1.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校質(zhì)檢系，河南鄭州 450011; 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083; 3.蘇州國發(fā)創(chuàng)業(yè)投資控股有限公司，江蘇蘇州 215128)

貯糧的安全關(guān)系到國計(jì)民生，對其中的腐敗微生物進(jìn)行分析研究具有重要意義。從貯藏玉米中分離到一株優(yōu)勢腐敗霉菌M13，通過形態(tài)特征觀察和ITS序列分析，將該菌株初步鑒定為米曲霉(Aspergillus oryzae)，并構(gòu)建了其系統(tǒng)發(fā)育樹，更是提供了一種準(zhǔn)確可靠且簡單易行的糧食真菌鑒定技術(shù)。

玉米，形態(tài)特征，ITS序列分析，系統(tǒng)發(fā)育樹

貯糧品質(zhì)關(guān)系到食品生產(chǎn)及飼料加工安全，當(dāng)環(huán)境溫濕度滿足霉菌生長的條件后，貯藏玉米就有可能發(fā)生霉腐現(xiàn)象［1］，不僅影響其貯藏穩(wěn)定性和安全性，而且還會(huì)使其食用及加工工藝品質(zhì)下降。更有甚者會(huì)產(chǎn)生黃曲霉毒素等真菌毒素及霉菌的其他有毒代謝產(chǎn)物［2］，從而對人類健康和牲畜飼養(yǎng)的安全造成嚴(yán)重威脅［3－5］。霉菌的種類和數(shù)量能基本反映糧食的安全狀況。對玉米中存在的腐敗或病原霉菌進(jìn)行分離和鑒定，是實(shí)現(xiàn)玉米安全貯藏的重要一步。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)序列分析技術(shù)由于穩(wěn)定性好和測序方便，已廣泛地運(yùn)用到真菌種屬水平的分類鑒定研究中［6－9］。本文從貯藏玉米中分離、純化出其中占優(yōu)勢的霉菌菌株，對其中一株進(jìn)行了鑒定，以了解貯藏玉米的優(yōu)勢霉菌，為糧食的科學(xué)貯藏和食品安全控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米 產(chǎn)于許昌;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，PDA) 附加抗菌素;查氏培養(yǎng)基(Czapek’s Agar，CA)，查氏酵母膏培養(yǎng)基(Czapek Yeast Extract Agar，CYA)，10mg/mL鏈霉素、6×上樣緩沖液(Loading buffer)、50×TAE電泳緩沖液、10mg/mL溴化乙錠(EB)貯存液、1mol/L Tris－HCl (pH8.0)、0.5mol/L EDTA(pH8.0)、TE緩沖液、10% CTAB－0.7mol/L NaCl、提取緩沖液、氯仿∶異戊醇(24∶1) 配制上述試劑所用的藥品均為分析純;TaqDAN聚合酶、蛋白酶K、RNase酶 北京天根生物技術(shù)公司。

表1 ITS rDNA PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

凝膠成像系統(tǒng)Biosens SC 810 上海山富科學(xué)儀器有限公司;PCR儀 Primus 96 Advanced 德國Peqlab公司;穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀EPS－300 上海天能科技有限公司;顯微攝像頭DEM 杭州數(shù)明科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 貯藏玉米中主要霉菌的分離、純化與保存

取3份供試玉米置于滅菌平板中，加入適量無菌水，使其水分活度達(dá)0.97后，在28℃下培養(yǎng)。待其長出霉菌后，挑取形態(tài)各異的菌株，劃線接種到PDA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)。之后反復(fù)進(jìn)行平板劃線，直至得到形態(tài)不同的單菌落。供試菌株于沙土管中長期保存，或PDA斜面上培養(yǎng)后于4℃臨時(shí)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 真菌菌株的形態(tài)學(xué)觀察 將不同形態(tài)的菌株點(diǎn)接種在PDA培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、查氏酵母膏培養(yǎng)基固體平板上，28℃培養(yǎng)12d，觀察菌落形態(tài)特征。觀察菌落在培養(yǎng)基中的顏色、菌落形成是否規(guī)則、菌落大小、菌絲體是否發(fā)達(dá)等。

固體培養(yǎng)基中插片培養(yǎng)3～5d，待菌絲附著在蓋玻片上時(shí)，取出，于顯微鏡下觀察。鏡檢孢子形狀、菌絲體有否橫隔膜，孢子梗形態(tài)結(jié)構(gòu)等。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)方法鑒定

1.2.3.1 菌體的培養(yǎng)與收集 菌株的培養(yǎng)∶將分離得到的菌株，在PDA斜面上活化后，接種到含200mL PDA液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，28℃、180～200r/min搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，鏡檢，驗(yàn)純。

菌體的收集∶驗(yàn)純后的菌絲培養(yǎng)液，用2層無菌紗布過濾，然后用無菌去離子水洗滌2～3次，再用TE緩沖液洗滌1次，無菌濾紙盡量擠干水分，置于Ep管中，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 絲狀真菌總DNA的提取 采用CTAB法，參考文獻(xiàn)［10－13］的方法提取總DNA，有改動(dòng)。對所提取的DNA樣品，采用1%瓊脂糖平板凝膠電泳，EB染色，5μL上樣，紫外檢測其提取質(zhì)量。

1.2.3.3 PCR擴(kuò)增 引物∶以基因組DNA為模板，根據(jù)酵母rDNA保守區(qū)段設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增待鑒定菌株的ITS區(qū)域(ITS1－5.8S rDNA－ITS2)［12］。

ITS區(qū)域∶正向引物∶GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G，反向引物∶TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC。引物由“上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司”合成。

擴(kuò)增反應(yīng)體系∶PCR反應(yīng)體系為30μL，每次反應(yīng)均設(shè)陰性對照(不加模板)。具體組成見表1。

擴(kuò)增程序∶按下述程序進(jìn)行擴(kuò)增ITS rDNA基因。預(yù)變性94℃ 5min;變性94℃ 30s;退火55℃30s;延伸72℃ 40s;重復(fù)步驟40個(gè)循環(huán);最終延伸72℃ 7min。擴(kuò)增產(chǎn)物于－20℃下保存。

PCR產(chǎn)物檢測∶瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，以標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量作對照。電泳結(jié)束后，用紫外凝膠掃描儀掃描、照相，檢測擴(kuò)增片斷長度與產(chǎn)量。

1.2.3.4 ITS rDNA堿基序列分析 將電泳檢測后的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序所用引物與做PCR所用引物為同一對引物。測序結(jié)果經(jīng)校對后采用 BLAST(BasicLocal Alignment Search Tool)程序，在國際生物技術(shù)信息中心(NCBI)GenBank數(shù)據(jù)庫(http∶//www.ncbi.nlm. nih.gov)中進(jìn)行序列相似性比對搜索，查看堿基序列相似性。

1.2.3.5 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 利用BLAST程序，將所測得的ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知菌株的ITS序列進(jìn)行比對，依據(jù)比對結(jié)果，選取同源性適當(dāng)較高的已知菌株的ITS序列和所測菌株的ITS全序列一起建立系統(tǒng)發(fā)育樹。用MEGA4.0軟件采用鄰接法(Neighbor－Joining，NJ法)和最大簡約法(Maximum Parsimony，MP法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［14］，自展值為1000。

1.2.4 菌種鑒定 根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育學(xué)結(jié)果，參考資料對分離純化后的菌株進(jìn)行鑒定［15－17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏玉米中優(yōu)勢腐敗霉菌的分離純化

貯藏玉米經(jīng)過適當(dāng)培養(yǎng)，生長出肉眼清晰可見的霉菌，這些霉菌為腐生型，對貯藏糧食均會(huì)帶來營養(yǎng)、衛(wèi)生、安全等方面的危害，必須予以足夠重視。

經(jīng)過在PDA培養(yǎng)基上的劃線純化，可以分離、純化出形態(tài)不同的霉菌。本文對經(jīng)過適當(dāng)培養(yǎng)后，以肉眼明顯可見，占生長優(yōu)勢的霉菌作為分離純化對象，分離、純化出形態(tài)各異的霉菌，并對分離得到的M13菌株采取形態(tài)學(xué)方法，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育學(xué)，進(jìn)行鑒定。

2.2 M13菌株的鑒定

2.2.1 M13菌株的形態(tài)學(xué)特征 M13鏡檢和菌落形態(tài)觀察，參見圖1～圖4。

圖1 M13菌株插片鏡檢

M13菌株鏡檢觀察，分生孢子頭散生，分生孢子幼時(shí)洋梨形或橢圓形，成熟后大多變?yōu)榍蛐位蚪蛐?。分生孢子梗生自基質(zhì)或氣生菌絲，生于氣生菌絲者較短，壁通常粗糙，頂囊近球形或燒瓶形。

M13菌株在PDA培養(yǎng)基上，27℃、7d菌落直徑

圖2 菌株M13在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖3 菌株M13菌株在查氏培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖4 菌株M13菌株在查氏酵母膏培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

M13菌株在查氏培養(yǎng)基上菌落生長較快，27℃、7d直徑65mm;質(zhì)地較厚，具有輻射狀溝紋，中央現(xiàn)絮狀;初為白色、黃色，繼變?yōu)榈S褐色至淡綠褐色，但不呈真正的綠色;菌落反面呈淡粉紅色至淡褐色，有輻射狀溝紋。

M13菌株菌落在查氏酵母膏瓊脂上27℃、7d直徑可達(dá)80mm;質(zhì)地較厚，中央呈絮狀，具輻射狀溝紋，有菌核;菌落呈厚絨毛狀;初為白色，青色，淡黃褐色，后變?yōu)辄S褐色至綠褐色，菌落反面淡粉紅色，可見輻射狀溝紋。

2.2.2 M13菌株的ITS序列同源性分析

2.2.2.1 DNA的提取 將所培養(yǎng)菌種的菌絲收集后，用CTAB法提取DNA。將提取的DNA進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，見圖5。由圖5中可以看出，其可以用于下一步PCR擴(kuò)展。

圖5DNA瓊脂糖電泳

2.2.2.2 PCR檢測 采用所選取的引物，對不同霉菌基因組 DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，均可以獲得約為590bp的ITS片段的PCR產(chǎn)物，如圖6所示。由圖6中可以看出，擴(kuò)增片段約為580bp。

圖6 引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測圖譜

2.2.2.3 測序結(jié)果 M13菌株的ITS測序結(jié)果如下(580bp，包含18S rDNA的部分序列;ITS1、5.8S、ITS2處的全部序列;28S rDNA的部分序列)∶

將得到的M13菌株的序列在GenBank中進(jìn)行同源搜索，運(yùn)用DNAMAN軟件(Version 5.2.2)進(jìn)行比對。結(jié)果表明，M13菌株與米曲霉(A.oryzae，EU409806)的 ITS、5.8S rDAN的序列同源性均為100%。

2.2.3 以ITS序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 本研究用距離矩陣法(distance matrix method)中的鄰接法(neighbor－joining)以及最大簡約法(maximum parsimony，MP)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用自展法(bootstrap)檢驗(yàn)系統(tǒng)樹的可靠性，自展次數(shù)為1000次，建樹選取的參比菌種見表2。利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建得到系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖7所示。

表2 M13建樹選取的參比菌株

圖7 以ITS序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的M13菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

NJ法以及 MP法中 M13與米曲霉Aspergillus oryzae(AB000533)、黃 曲 霉Aspergillusflavus(FJ216383)、昆蟲曲霉Aspergillus nomius(DQ467976)、寄生曲霉Aspergillus parasiticus(DQ026005)聚為一枝。

2.3 鑒定結(jié)果

依據(jù)文獻(xiàn)［15－17］，綜合M13菌株的形態(tài)特征、序列同源性以及系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，根據(jù)Renske［18］等認(rèn)為真菌通過ITS區(qū)域比對，序列相似性≥99%可鑒別為相同種，初步鑒定該菌為米曲霉(Aspergillus oryzae)。米曲霉 (A.oryzae)歸類于叢梗孢目(Moniliales)，叢梗孢科 (Moniliaceae)，曲霉屬(Aspergillus)。

3 結(jié)論

本研究以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征的鑒定為依據(jù)，同時(shí)采用rDNA ITS序列的比較分析，確定玉米中分離到的一株優(yōu)勢腐敗霉菌為米曲霉(A.oryzae)，并構(gòu)建了其系統(tǒng)發(fā)育樹。米曲霉(A.oryzae)較多地被發(fā)現(xiàn)于發(fā)酵食品中，它可以釀制醬、醬油和味精，也可用來生產(chǎn)乳酸和糊化淀粉，很多資料中都把米曲霉歸為黃曲霉群(A.flavusGroup)。

長期以來真菌主要是依據(jù)其形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，但是形態(tài)性狀的生長受生長環(huán)境和生長時(shí)期的影響，鑒定的結(jié)果受主觀因素的影響也較大，因而基于形態(tài)性狀特征對真菌進(jìn)行分類鑒定有一定的局限性。真菌核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)在進(jìn)化上比編碼區(qū)快，種內(nèi)的不同菌株之間高度保守，但在種間變化極大，ITS序列分析體現(xiàn)的是堿基差異，可為真菌學(xué)的研究提供豐富的遺傳信息，對真菌的鑒定有更好的準(zhǔn)確性和靈敏性［19－21］，同時(shí)借助 GenBank等生物數(shù)據(jù)庫的大量信息，從分子水平為真菌的準(zhǔn)確分類、鑒定提供科學(xué)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的菌屬的鑒定，與傳統(tǒng)的真菌分類主要根據(jù)真菌菌株的形態(tài)特征、生長特性與生理生化指標(biāo)相比，提升了真菌分類鑒定的可靠性。結(jié)果表明，形態(tài)特征、結(jié)合rDNA ITS序列分析能夠有效地進(jìn)行貯糧中霉菌的鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也為分析影響貯藏糧食及飼料品質(zhì)的主要腐敗微生物，開展生態(tài)貯糧研究提供了一定的參考價(jià)值和依據(jù)。

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Isolation and identification of predominant spoiling strain M13 of mold in the stored maize

YUE Xiao－yu1，2，XU Jun1，ZHANG Heng－ye1，SUN Zhong－wei3，LI Xin1，LIU Xiang－dong2
(1.Zhengzhou College of Animal Husbandry Engineering，Zhengzhou 450011，China; 2.College of Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China; 3.Suzhou International Development Venture Capital Holding Co.，Ltd.，Suzhou 215128，China)

It is very significant to research spoilage microorganisms in stored maize.A predominant strain of mold in the stored ice was isolated and identified.According to its morphological observation，phylogenetic analysis of ITS sequence and the reference manual related microbial identification，the strain was preliminary identified as Aspergillus oryzae.The measurement can be used as an accurate，reliable and straightforward method to identify the original species of the stored maize and explore genetic diversity.

maize;morphological characteristics;analysis of ITS sequence;phylogenetic tree

TS201.3

A

1002－0306(2011)11－0183－05

2011－08－04

岳曉禹(1974－)，男，博士研究生，講師，研究方向:食品微生物。

2011年河南省重點(diǎn)科技發(fā)展計(jì)劃(112102110034);2011年度河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2011A550014);鄭州牧專博士科研啟動(dòng)資金項(xiàng)目(5040190)。