劉楚怡，劉 蓉，薛文通，張 惠

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

四種淡水魚(yú)致敏蛋白免疫原性研究

劉楚怡，劉 蓉，薛文通*，張 惠

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

對(duì)常見(jiàn)的食物過(guò)敏原，草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)、烏鱧(Ophicephalus argus)、鲇魚(yú)(Silurus asotus)、花鱸(Lateolabrax japonicus)四種淡水魚(yú)進(jìn)行了特異性抗原的識(shí)別，通過(guò)coca’s緩沖液分別于四類(lèi)魚(yú)肌肉組織中提取蛋白粗提液，經(jīng)SDS－PAGE分離出多種分子量不同的蛋白組分并對(duì)其進(jìn)行分析，再通過(guò)Western－blotting識(shí)別四種淡水魚(yú)過(guò)敏原研究其免疫原性。由SDS－PAGE電泳分別得到四種淡水魚(yú)全蛋白電泳圖，通過(guò)免疫印跡等方法發(fā)現(xiàn)草魚(yú)與IgE結(jié)合的陽(yáng)性帶主要有4條(107、62、50、27ku)，烏鱧與IgE結(jié)合的陽(yáng)性帶主要有6條(62、50、34、32、28、17ku)，鲇魚(yú)與IgE結(jié)合的陽(yáng)性帶主要有4條(62、50、39、37ku)，花鱸與IgE結(jié)合的陽(yáng)性帶主要有6條(62、50、37、34、32、18ku)。

淡水魚(yú)，免疫印跡，食物過(guò)敏原

食品過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為當(dāng)今世界普遍存在的問(wèn)題，它嚴(yán)重影響到部分人群的生活質(zhì)量［1－2］。食品過(guò)敏是人體對(duì)食品中的抗原物質(zhì)產(chǎn)生的由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的不良反應(yīng)，能夠引起這種不良反應(yīng)的抗原物質(zhì)即為食品過(guò)敏原。據(jù)統(tǒng)計(jì)，90%以上的過(guò)敏反應(yīng)是由8類(lèi)，共170種富含蛋白質(zhì)的食物引起的。作為世界糧農(nóng)組織FAO(1995)報(bào)告的八類(lèi)主要過(guò)敏食物中的一類(lèi)，魚(yú)類(lèi)已成為最常見(jiàn)的食品過(guò)敏原之一［3］。美國(guó)嬰幼兒魚(yú)類(lèi)過(guò)敏的發(fā)生率為0.1%，成人為0.4%［4］。瑞典和冰島地區(qū)魚(yú)類(lèi)過(guò)敏的發(fā)生率為0.2%［5］。在亞洲，由于飲食習(xí)慣的問(wèn)題，魚(yú)類(lèi)致敏的現(xiàn)象顯得更為突出。日本調(diào)查全國(guó)范圍內(nèi)2001～2002年速發(fā)型食物過(guò)敏性疾病，結(jié)果指出食物過(guò)敏病例中4.4%是由魚(yú)類(lèi)引發(fā)的［6］。呂相征對(duì)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)生的調(diào)查表明，魚(yú)類(lèi)過(guò)敏人數(shù)占總過(guò)敏人數(shù)的18.2%，對(duì)于過(guò)敏者為最多［7］。我國(guó)是世界淡水養(yǎng)殖大國(guó)，淡水產(chǎn)品產(chǎn)量世界第一。淡水魚(yú)占我國(guó)漁業(yè)總量的41.5%左右。在淡水養(yǎng)殖品種結(jié)構(gòu)中，由淡水魚(yú)引起的過(guò)敏癥在我國(guó)也最為常見(jiàn)，這極大地影響了我國(guó)魚(yú)類(lèi)制品的安全性，降低了其市場(chǎng)普及和魚(yú)產(chǎn)品的利用價(jià)值。到目前為止，對(duì)食品過(guò)敏還沒(méi)有非常有效的治療方法，對(duì)于食品過(guò)敏的防治唯一有效的方法就是嚴(yán)格控制和避免特定食品的攝入。因此，對(duì)于淡水魚(yú)致敏蛋白的識(shí)別，以及對(duì)其致敏性的研究，在過(guò)敏原的防治以及開(kāi)發(fā)低致敏食品方面都具有重要的理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新鮮草魚(yú)、烏鱧、鲇魚(yú)、花鱸 購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)家屬區(qū)市場(chǎng);0.02mol/L pH7.5的Tris－HCl緩沖液、pH8.3的coca’s提取液、pH8.3的25mmol/L Tris－192mmol/L甘氨酸緩沖液、4－氯－1－萘酚、電泳所需試劑、硝酸纖維素膜(Amersham RPN303C)、立春紅

sigma公司;魚(yú)類(lèi)過(guò)敏患者血清 大慶市油田總醫(yī)院皮膚科;蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 10～200ku;HRP標(biāo)記的羊抗人IgE抗體;牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。

GL－20B高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;AE－6450垂直電泳槽、AE－8450 1000V電源 日本ATTO公司;DYY－Ⅲ7B型轉(zhuǎn)移電泳儀、DYY－Ⅲ40B型轉(zhuǎn)移電泳槽 北京六一儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚(yú)肉蛋白的提取 從市場(chǎng)買(mǎi)回新鮮淡水魚(yú)，除去魚(yú)皮、魚(yú)骨以及內(nèi)臟，取魚(yú)肌肉，切成碎塊，放入絞肉機(jī)中絞碎，加入2倍體積的 coca’s提取液(pH8.3)提取，均質(zhì)機(jī)13000r/min均質(zhì)5min后，在4℃下以12000r/min轉(zhuǎn)速離心20min，取上清液。將上清液收集冷凍干燥后成粉狀保存待用。

1.2.2 SDS－PAGE 采用不連續(xù)體系SDS－PAGE垂直板凝膠電泳，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12.5%，恒流30mA，溴酚藍(lán)標(biāo)記電泳完成后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色20min，脫色。標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量范圍為10～200ku之間的14種多肽。

1.2.3 轉(zhuǎn)移電泳 按照進(jìn)行SDS－PAGE電泳后的凝膠的大小剪取NC膜(0.45μm)。將膠和膜放入電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡20min，NC膜接正極，凝膠面接負(fù)極，在150V恒壓下，于4℃冰箱中電轉(zhuǎn)1.5h。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，凝膠用考馬斯亮藍(lán)R－250染色，NC膜用立春紅染色，觀察轉(zhuǎn)移效果，轉(zhuǎn)移完全的膜用于免疫印跡［8］。

1.2.4 血清池的建立 取3份陰性血清和12份魚(yú)過(guò)敏患者陽(yáng)性血清分別等體積混合，制成陰性血清和陽(yáng)性血清池，300μL/tube分裝于－20℃冰箱中保存。

1.2.5 免疫印跡(Western－blotting) 用2%BSA于4℃封閉過(guò)夜后，將NC膜放人10位對(duì)魚(yú)過(guò)敏患者的血清池(1∶10稀釋)中。在4℃冰箱中孵育5h，用TBST清洗3次。將NC膜轉(zhuǎn)入HRP標(biāo)記羊抗人IgE抗體(1∶2000稀釋)中振搖0.5h，TBST清洗3次。將NC膜加入辣根過(guò)氧化物酶底物溶液顯色，待條帶清晰后即用雙蒸水沖洗，終止顯色反應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 四種淡水魚(yú)肌肉全蛋白電泳圖

四種淡水魚(yú)的總蛋白的SDS－PAGE電泳結(jié)果顯示，其蛋白含量豐富，不同的魚(yú)的總蛋白條帶存在不同，分子量廣泛分布于10～150ku之間。其中草魚(yú)共有28條蛋白帶，豐度較高的蛋白條帶分子量分別為107、50、39、37、34、12ku，共6條;烏鱧共有24條蛋白帶，其中豐度較高的7條蛋白條帶分子量為107、62、50、39、37、34、11ku;鲇魚(yú)共有29條蛋白帶，主帶為8條，分別在分子量為107、50、39、37、32、14、13、12ku處可見(jiàn)豐度較高的蛋白條帶;而花鱸共有25條蛋白帶，主帶為8條，分別在107、50、39、37、35、18、14、10ku處。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 四種淡水魚(yú)致敏蛋白的識(shí)別

SDS－PAGE電泳后用由22位經(jīng)檢測(cè)對(duì)魚(yú)過(guò)敏患者的陽(yáng)性血清組成的血清池為一抗，HRP標(biāo)記羊抗人IgE作為二抗，對(duì)四種魚(yú)的總蛋白進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。草魚(yú)與IgE結(jié)合的陽(yáng)性帶主要有4條(107、62、50、27ku);烏鱧與IgE結(jié)合的陽(yáng)性帶主要有6條(62、50、34、32、28、17ku)，鲇魚(yú)與IgE結(jié)合的陽(yáng)性帶主要有4條(62、50、39、37ku)，花鱸與IgE結(jié)合的陽(yáng)性帶主要有6條(62、50、37、34、32、18ku)。

圖1 四種淡水魚(yú)蛋白SDS－PAGE電泳圖

圖2 魚(yú)過(guò)敏陽(yáng)性血清對(duì)四種淡水魚(yú)蛋白Western Blotting圖

3 結(jié)論

本文對(duì)常見(jiàn)的四種淡水魚(yú)草魚(yú)、烏鱧、鲇魚(yú)、花鱸的肌肉蛋白進(jìn)行了特異性抗原的識(shí)別，結(jié)果表明，草魚(yú)存在4條致敏條帶、烏鱧有6條主要致敏帶、鲇魚(yú)致敏條帶為4條、花鱸存在6條蛋白帶與陽(yáng)性血清反應(yīng)。

本研究與文獻(xiàn)報(bào)道中鱈魚(yú)等海水魚(yú)的主要致敏蛋白為12ku的小清蛋白［9－10］的結(jié)論不同，在對(duì)這四種淡水魚(yú)的免疫印記中并未發(fā)現(xiàn)小清蛋白引起過(guò)敏反應(yīng)。四種魚(yú)中62ku和50ku的蛋白都明顯致敏，但不同種魚(yú)引起過(guò)敏的主要蛋白仍然存在差異。分析認(rèn)為其致敏蛋白存在差異與魚(yú)類(lèi)種屬不同有關(guān)。雖然四種魚(yú)都屬于輻鰭魚(yú)亞綱但分屬不同目。草魚(yú)為鯉形目草食魚(yú)，與另外三種比較其致敏性較低，存在27ku的致敏蛋白。烏鱧和花鱸屬于鱸形目，兩者在34、32、17～18ku處的蛋白都引起過(guò)敏。鲇魚(yú)是鯰形目，致敏性較鱸形目的烏鱧和花鱸低，但高于鯉形目草魚(yú)。

淡水魚(yú)引起的過(guò)敏癥極大地影響了我國(guó)魚(yú)類(lèi)制品的安全性，降低了其市場(chǎng)普及和魚(yú)產(chǎn)品的利用價(jià)值。因此，對(duì)于淡水魚(yú)致敏蛋白的識(shí)別，以及對(duì)消除致敏蛋白致敏性的研究，在治療超敏反應(yīng)疾病和研究開(kāi)發(fā)低致敏食品方面都具有重要的理論指導(dǎo)意義。

［1］Altman D R，Chiaramonte L T.Public perception of food allergy［J］.J Allergy Clin Immunol，1996，97:1247－1251.

［2］Cong Y J，Lou F，Xue W T，et al.The effect of cooking methods on the allergenicity of peanut［J］.Food and Agricultural Immunology，2007，18(1):53－65.

［3］Lars K P，Tine K H.Allergens from fish and egg［J］.Allergy，2001，56(67):39－42.

［4］Sampson H A.Update on Food Allergy［J］.J Allergy Clin Immunol，2005，113(5):805－819.

［5］Gislason D，Bjomsson E，Gislason T，et al.Sensitization to Airborne and Food Allergens in Reykjavic(Iceland)and Uppsala (Sweden)－A Comparative Study［J］.Allergy，54:1160－1167.

［6］Imai T，Ebisawa M.Nationwide Survey of Immediate Type Food Allergy in Japan［J］.Journal of Allergy and Clinical Immunology， 2004，114(1):159－165.

［7］呂相征，劉秀梅，楊曉光.健康人群食物過(guò)敏狀況的初步調(diào)查［J］.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2005(2):119－121.

［8］叢艷君，婁飛，薛文通，等.中國(guó)花生致敏蛋白的識(shí)別［J］.食品科學(xué)，2007，28(10):109－112.

［9］Thien Van Do，Ivar Hord vik，Curt Endresen，et al.The major allergen(parvalbumin)of codfish is encoded by at least two isotypic genes:cDNA cloning，expression and antibody binding of the recombinant allergens［J］.Molecular Immunology，2003，39: 595－602.

［10］Swoboda I，Bugajska S A，Valenta R，et al.Recombinant fish parvalbumins:candidates for diagnosis and treatment of fish allergy［J］.Allergy，2002，57:94－96.

Identification of major allergens from four kinds of freshwater fishes

LIU Chu－yi，LIU Rong，XUE Wen－tong*，ZHANG Hui
(College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

Aiming to investigate the major allergens of the following four kinds of freshwater fishes，Grass carp (Ctenopharyngodon idellus)，Snakehead(Ophicephalus argus)，Catfish(Silurus asotus)and Japanese sea perch (Lateolabrax japonicus)were studied.Fish muscle was extracted in the same volume of coca’s buffer(pH 8.3).The relative contents of major allergens were quantified by SDS－PAGE densitometry.Immunoblot on the four kinds of freshwater fish protein extracts were performed with sera from 12 eczema patients with serum specific immunoglobulin E of fish proteins.In result，the major allergen of Grass carp was 107，62，50，27ku protein.There were 6 major allergic protein of Snakehead which were 62，50，34，32，28，17ku.The positive protein which were connected with the specific immunoglobulin E of Catfish were 62，50，39，37ku protein.Japanese sea perch major allergen were 62，50，37，34，32，18ku protein.

freshwater fish;western－blotting;food allergen

TS254.1

A

1002－0306(2011)11－0164－03

2010－10－13 *通訊聯(lián)系人

劉楚怡(1986－)，女，博士研究生，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。