于玉涵，焦必寧，*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘研究所/西南大學(xué)柑橘研究所，重慶 400712; 2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716)

檸檬中類黃酮的含量分析和檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

于玉涵1，2，焦必寧1，2，*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘研究所/西南大學(xué)柑橘研究所，重慶 400712; 2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716)

類黃酮是檸檬中一類重要的多酚類化合物，具有很強(qiáng)的清除DPPH·、超氧陰離子及過氧化氫等自由基的能力，在預(yù)防如肥胖、糖尿病、高血脂、心血管疾病和某些癌癥方面發(fā)揮著獨(dú)特功效。簡要分析了檸檬中類黃酮的種類、結(jié)構(gòu)和影響含量的因素，綜述了檸檬中類黃酮的檢測技術(shù)研究進(jìn)展，并對未來的研究開發(fā)提出展望。

檸檬，類黃酮，含量，檢測技術(shù)

檸檬(Citrus limon(L.)Burm.F.)屬蕓香科(Rutaceae)柑橘屬常綠小喬木，主要栽培品種有尤里克、里斯本、費(fèi)米耐勞等，是繼橙、柑之后第三大柑橘品種，在鮮果市場和食品工業(yè)領(lǐng)域有巨大的商業(yè)價(jià)值。若干研究顯示檸檬中含有的類黃酮、維生素、膳食纖維、香精油、類胡蘿卜素和生物堿等成分具有重要的生理功能，檸檬加工鏈產(chǎn)生的副產(chǎn)物中含有豐富的生物活性物質(zhì)，可以作為生產(chǎn)食品、保健食品和動物飼料的來源。與檸檬中其他功能成分相比，目前國內(nèi)外對檸檬中的類黃酮研究較多。它具有較強(qiáng)的清除DPPH·、超氧陰離子及過氧化氫等自由基的能力，在預(yù)防如肥胖，糖尿病，高血脂，心血管疾病和某些癌癥方面發(fā)揮著獨(dú)特功效。國外研究發(fā)現(xiàn)，檸檬中一種特有的成分圣草枸櫞苷可以預(yù)防白內(nèi)障等糖尿病并發(fā)癥。MIYAKE［1］等還發(fā)現(xiàn)添加0.35%圣草枸櫞苷可以明顯提高食用高脂高膽固醇食物的小鼠糞便中膽汁酸性和肝臟低密度脂蛋白受體m－RNA水平，圣草枸櫞苷的苷元圣草酚，是一種強(qiáng)脂氧化酶抑制劑，可以降低動脈粥樣硬化和癌癥等疾病的發(fā)病率。Ogataetal［2］研究發(fā)現(xiàn)檸檬汁中的圣草枸櫞苷可以誘導(dǎo)HL－60腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，Shafaeetal［3］發(fā)現(xiàn)檸檬中的橙皮苷和地奧司明可以治療慢性靜脈功能不全、慢性痔瘡和下肢靜脈潰瘍，文賽寧－2和香葉木素6，8－di－C－β－葡糖苷對血液粘附分子的表達(dá)有抑制作用，可以用來治療高血壓。本文綜述了近年來國內(nèi)外有關(guān)檸檬中類黃酮的種類、含量和檢測技術(shù)的研究進(jìn)展，并對未來的研究開發(fā)提出展望。

1 檸檬中類黃酮的種類和結(jié)構(gòu)

檸檬中的類黃酮包括:黃烷酮，黃酮和黃酮醇，其中以黃烷酮為主，占總黃酮含量的90%［4］。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，檸檬果皮和果汁中所含類黃酮的種類差別不大，果汁中類黃酮有20種，僅比果皮中少1種。

黃酮骨架是由兩個(gè)芳香環(huán)(即A和B)連接一個(gè)吡喃酮或氫化吡喃酮環(huán)(C)分別組成黃酮和黃烷酮，具體如表1所示。

已檢測出黃烷酮類7種，檸檬汁中主要含橙皮苷和圣草枸櫞苷［5－7］，檸檬果皮中主要含新圣劃枸纖苷，橙皮苷、圣草枸櫞苷及少量柚皮蕓香苷、柚皮苷和新橙皮苷［8－9］，檸檬種子中主要含圣草枸櫞苷和橙皮苷及少量柚皮苷［8］;已檢測出黃酮類9種，檸檬汁中可以檢測出少量的文賽寧－2、地奧司明、金圣草黃素6，8－di－C－葡糖苷、芹菜素7(丙二?；鄄颂腔?－葡糖苷和香葉木素8－C－β－D－葡糖苷［6，10－12］，檸檬果皮含量最豐富的三種黃酮是香葉木素6，8－di－C－葡糖苷、文賽寧－2和地奧司明［9，13－14］;已檢測出黃酮醇7種，檸檬汁中含量最豐富的黃酮醇是蘆丁和楊梅黃酮，檸檬果皮中除含有這兩種外，還檢測出多甲氧基黃酮醇，包括異/甲氧基檸檬黃素3－β－葡糖苷、檸檬黃素3－β－D－葡糖苷和甲氧基檸檬黃素［5，9，15］;與其他柑橘品種相比，檸檬中多甲氧基黃酮含量較少，目前僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道了檸檬果皮、汁和可食用部分中的橙黃酮、川陳皮素，紅橘素的含量［5，14，16－17］。

表1 檸檬中已檢測到的類黃酮和酚酸結(jié)構(gòu)

2 檸檬中類黃酮含量

檸檬中的類黃酮并不是平均分布、穩(wěn)定不變的。研究發(fā)現(xiàn)，檸檬中總黃酮和不同種類類黃酮的含量都受到品種、組織部位、環(huán)境、加工儲存條件的影響。

檸檬不同組織部位的類黃酮含量差別很大。DelR ío［13］等對菲諾－49內(nèi)外果皮和果漿中的橙皮苷、地奧司明和圣草枸櫞苷進(jìn)行測定，內(nèi)果皮中的橙皮苷和圣草枸櫞苷含量較高，分別為12.5、15.9mg/kg干重，是外果皮中含量的2倍，果漿中含量的4倍，內(nèi)、外果皮中地奧司明含量相近，約為果漿中含量的4～6倍。MIYAKE［19］等測定里斯本和尤里克檸檬外內(nèi)果皮、囊衣、果汁、種子中的圣草枸櫞苷發(fā)現(xiàn)，囊衣中的含量最高，其次是內(nèi)外果皮，種子中無檢出。

檸檬不同品種和同品種不同品系的果實(shí)中類黃酮含量和種類也有很大差異。付陳梅［14］等檢測了維拉弗蘭卡檸檬等五種檸檬汁中8種類黃酮，美國粗檸檬檢出7種類黃酮，黃花尤里克僅檢出4種，橙皮苷含量最高的品種與最低的品種相差近76倍。Kawaii［16］等檢測了尤里克檸檬、甜檸檬、北京檸檬可食部分中24種類黃酮，尤里克檸檬中檢出的成分最少，但每種成分的含量較高，圣草枸櫞苷的含量是甜檸檬和北京檸檬的120倍以上。Molina［7，20］等檢測了維爾拉－62、維爾拉－50－2、菲諾－49－5和菲諾－95檸檬汁中的4種類黃酮后發(fā)現(xiàn)，同品種不同品系的檸檬汁中類黃酮含量也有差別。

有文獻(xiàn)研究證明，檸檬汁在加工過程中類黃酮的含量和種類也會發(fā)生變化。Marín［10］等對菲諾和維爾納檸檬三種加工方式獲得的檸檬汁中的總黃酮和4種類黃酮進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)不同加工方式總黃酮和4種類黃酮的含量約相差2.5倍。Belajová［21］研究現(xiàn)榨檸檬汁和市售檸檬汁發(fā)現(xiàn)，市售檸檬汁中沒有檢測出現(xiàn)榨檸檬汁中占優(yōu)勢的柚皮蕓香苷，但可以檢測出一定量的新橙皮苷。

隨儲存時(shí)間延長，成熟檸檬中類黃酮含量逐漸減少。Wang［5］檢測了鮮采的臺灣檸檬干果皮中的總黃酮含為32.7mg/g干重，而Huang［18］檢測儲存到冬季的臺灣檸檬干果皮中總黃酮為2.54mg/g干重，總黃酮含量降低了10倍。DelRío［13］等對成熟期和儲存150d的檸檬中橙皮苷，地奧司明、圣草枸櫞苷進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)隨著檸檬儲存期的延長，三種類黃酮含量都迅速減少，儲存150d的檸檬汁中橙皮苷含量僅為鮮采檸檬汁中橙皮苷含量的二十分之一。

此外，GIL－IZQUIERDO［22］研究了不同砧木和中間砧的檸檬汁中總黃酮、圣草枸櫞苷、橙皮苷、地奧司明和6，8－di－C－葡糖基香木葉素含量發(fā)現(xiàn)，果汁中總黃酮含量是由砧木決定的，砧木和中間砧影響不同類黃酮成分的含量和含量排列順序。

3 檸檬中類黃酮的檢測技術(shù)

3.1 高效液相色譜技術(shù)(high－performance liquid chromatography，HPLC)

HPLC是目前確定酚醛結(jié)構(gòu)應(yīng)用最廣泛的色譜方法。該法具有樣品預(yù)處理簡單，分辨率高，速度快，重復(fù)率高的優(yōu)點(diǎn)。HPLC通常連接紫外(UV)、二極管矩陣(DAD或PDA)檢測器。

早在1994年，Mouly［23］已建立了rpHPLC法檢測檸檬中六種黃酮糖苷。1999年，Kawaii［16］對包括檸檬在內(nèi)的66種柑橘類水果中24種類黃酮進(jìn)行rpHPLC法檢測，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析了品種間的親緣關(guān)系。2003年Belajová［21］等人采用DAD檢測器建立了一種檢測檸檬汁中檢測橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素的HPLC法，結(jié)果表明，在1～50mg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r＞0.99，加標(biāo)回收RSD為0.83～1.02。

反相梯度洗脫類黃酮效果更好，所以一般文獻(xiàn)進(jìn)行多成分分析時(shí)常采用反相梯度洗脫。Justesen［24］建立了檢測包括檸檬汁在內(nèi)的多種果蔬汁中類黃酮的HPLC－PDA法，實(shí)驗(yàn)以A液(甲醇/水/乙酸)和B液(甲醇)為流動相，反相梯度洗脫，分別在290nm和365nm檢測出12種類黃酮，耗時(shí)35min。

HPLC的分析時(shí)間受到保留因子、壓力及柱長等影響。新近出現(xiàn)的微柱液相色譜(μHPLC)、超高速液相色譜(UPLC)、超快速液相色譜(UFLC)等減小了色譜柱填料粒度和內(nèi)徑，增加了泵壓，提升了分離效能。Dugo［6］等人用μHPLC檢測檸檬汁中的類黃酮，分離出圣草枸櫞苷、橙皮苷、新橙皮苷、芹菜素－6，8－di－C－葡糖苷、香葉木素－6，8－di－C－葡糖苷、芹菜素7－(二?；鄄颂腔?－葡糖苷、香葉木素6－C－β－D－葡糖基、香葉木素6，8－di－C－β－葡糖苷、文賽寧－2、異/甲氧基檸檬黃素3－D－葡糖苷、檸檬黃素－3－β－D－糖苷等11中類黃酮，保留時(shí)間僅為46min。

HPLC采用手性色譜柱還可以測定類黃酮的同分異構(gòu)體。Yá?ez［25］等采用 ChiralpakOJ－RH 柱(150mm×4.6mm i.d，5μm)和紫外線檢測器建立了高效液相色譜法檢測圣草酚的立體異構(gòu)體的方法，后又用該方法對果汁中的黃酮苷(橙皮苷，柚皮苷和圣草枸櫞苷)及其苷元(橙皮素，柚皮素和圣草酚)的同分異構(gòu)體進(jìn)行測定，并用高效液相色譜法和LC/MS分別對結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)。

也有文獻(xiàn)報(bào)道采用串聯(lián)液相色譜(LC－LC)和耦合柱高效液相色譜(CC－LC)等二維色譜系統(tǒng)檢測檸檬中類黃酮。Cacciola［26－27］比較 HPLC和 LC－LC發(fā)現(xiàn)LC－LC可以增加蘆丁，柚皮苷，橙皮素和橙皮苷的峰容量和分離度。CC－LC與環(huán)狀糊精(CDs)柱結(jié)合還可以檢測黃酮立體異構(gòu)體。Aturki［28］使用C18柱和羧甲基－β－環(huán)狀糊精(CDs)柱，結(jié)合質(zhì)譜負(fù)離子電噴霧(ESI－MS)技術(shù)，確定了檸檬汁中的新橙皮苷、柚皮苷、柚皮蕓香苷、橙皮苷和圣草枸櫞苷非對映體結(jié)構(gòu)。

表2 確定檸檬中類黃酮常見的檢測方法

3.2 液質(zhì)聯(lián)用(liquid charomatography－mass spectrometry，LC－MS)

LC－MS結(jié)合了HPLC的高效分離能力和MS的強(qiáng)結(jié)構(gòu)鑒定能力，可以對已知目標(biāo)物進(jìn)行定性定量分析，具有靈敏度高、選擇性好、分析快速、方便等優(yōu)點(diǎn)，最常用來檢測如生物類黃酮等小分子裂解物。LC－MS/MS可以降低背景噪音使痕量組分的譜圖不受豐量組分的干擾，檢測靈敏度大幅提高，定量結(jié)果精確，還可以針對未知樣品給出更多的碎片信息進(jìn)行定性。常見的電離方式有電噴霧電離(ESI)和大氣壓化學(xué)電離(APCI)。

ESI電離技術(shù)通過調(diào)整離子源電壓控制離子碎片可以測定化合物結(jié)構(gòu)，液相色譜結(jié)合ESI串聯(lián)質(zhì)譜法不僅能提高同類藥物分析的選擇性，且能預(yù)測未知成分結(jié)構(gòu)。ATURKI［28］等建立了檢測檸檬市售果汁和壓榨果汁中的圣草枸櫞苷和橙皮苷LC－ESIMS方法，在3.12×10－3～0.4mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，日內(nèi)和日間偏差低于0.25%和0.4%，加入20～1.5mg/mL野漆靈樹苷為示蹤物質(zhì)，回收率為98.2% ±2.7%。García［12］等建立了在檸檬汁中C－糖苷黃酮的HPLC－ESI－MS－MS法，研究發(fā)現(xiàn)，［M+H－4H2O］+是C－6－糖苷，而［0.3X］+是C－8－糖苷，再通過CID－MS/MS圖譜與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的圖譜對照，推斷檸檬汁中可能存在的成分為香木葉素6－C－β－D－葡糖苷、香木葉素8－C－β－D－葡糖苷、芹菜素6，8－di－ C－葡糖苷。

APCI電離技術(shù)具有高溶劑流速能力、高靈敏度、良好響應(yīng)線性關(guān)系和適應(yīng)范圍廣等特點(diǎn)，但目前研究檸檬中類黃酮采用 APCI電離方式的較少。Justesen［24］利用HPLC－APCI/MS檢測檸檬汁中的橙皮苷和柚皮苷，與HPLC－PDA的圖譜相比較，發(fā)現(xiàn)兩者極其相似，說明APCI電離技術(shù)可以用來分析檸檬中黃酮。Bocco［8］根據(jù)保留時(shí)間和APCI－MS碎片可以確定檸檬果皮和檸檬種子提取物中的每種類黃酮，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)圣草酚、橙皮苷和柚皮苷都有三個(gè)明顯碎片:［M+H］+、［(M－146)+H］+和［(M－308) +H］+，這個(gè)結(jié)果與1997年Robards［29］等的研究結(jié)果完全相同。

總之，LC－MS和LC－MS/MS檢測檸檬中類黃酮具有靈敏度高、可推斷待測物的結(jié)構(gòu)信息等優(yōu)點(diǎn)，在痕量檢測樣品中主成分和未知物方面有著別的方法無可比擬的優(yōu)勢。

3.3 其他檢測技術(shù)

除以上檢測方法外，檸檬中類黃酮的其他檢查還有氣相色譜法(GC)、核磁共振(NMR)、毛細(xì)管電泳法(CE)和毛細(xì)管色譜法(CEC)。氣相色譜法具有高分辨率和低檢出限等優(yōu)點(diǎn)，但容易生成三甲基硅醚(TMS)衍生物，所以無法廣泛應(yīng)用于檢測類黃酮［30］。核磁共振技術(shù)對樣品不具有破壞性，操作簡單，靈敏度高，短時(shí)間內(nèi)可以同時(shí)獲得樣品中多組分的馳預(yù)時(shí)間曲線圖譜，對樣品能夠進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分析鑒定。毛細(xì)管電泳法對黃酮的分離效果好，可以進(jìn)行同分異構(gòu)體的分離，還可以耦合電化學(xué)檢測法器對樣品中類黃酮進(jìn)行定量檢測［31］。毛細(xì)管色譜法是將毛細(xì)管電泳法和液相色譜法相結(jié)合，可以用于非極性中性化合物(如黃酮糖苷)的快速分離［31］。

4 展望

檸檬作為一種全果食柑橘品種，在人體健康方面發(fā)揮著重要作用。但目前國內(nèi)習(xí)慣把檸檬歸為柑橘一類進(jìn)行研究，針對檸檬香氣成分、精油、胡蘿卜素、類黃酮、膳食纖維等活性成分的研究極少，缺乏系統(tǒng)性，在工業(yè)化分離純化技術(shù)和功能產(chǎn)品的開發(fā)方面更是處于空白狀態(tài)。目前檸檬中類黃酮的檢測方法大都采用以HPLC為基礎(chǔ)的定量定性分析，缺少簡單、快速、價(jià)低、高效的分析方法。Shinkaruk［35］以羧酸合成半抗原，制備了橙皮苷和柚皮苷的多克隆抗體，檢測食物、血漿和小鼠尿樣品中的橙皮苷和柚皮苷，具有較好的特異性，這將為今后檢測類黃酮的含量提供一條新途徑。因此，我國應(yīng)該進(jìn)一步加強(qiáng)檸檬功能成分的研究，多學(xué)科結(jié)合研發(fā)出快速、準(zhǔn)確、靈敏的標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法和高通量、高純度的工業(yè)化制備工藝，從而為提高檸檬的附加值提供新途徑。

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Advances on the analysis of content and detection technologies for lemon flavonoids

YU Yu－h(huán)an1，2，JIAO Bi－ning1，2，*
(1.Citrus Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences/Citrus Research Institute，Southwest University Chongqing 400712，China; 2.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400716，China)

Flavonoids is the main group of polyphenol in lemon fruit.It has a strong scavenging free radicals such as DPPH· radical，superoxide anion and hydrogen peroxide，and plays a unique role in providing obesity prevention，diabetes，hyperlipidemia，cardiovascular disease and other types of cancer diseases.The types，structure and content characteristics of flavonoids in lemon were analyzed，the technological progress of detection of lemon flavonoids was summarized and finally the research and development tendency of lemon flavonoids in the future was discussed.

lemon;flavonoids;content;detection technologies

TS255.1

A

1002－0306(2011)12－0518－06

2010－11－24 *通訊聯(lián)系人

于玉涵(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工與儲藏。

國家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAD47B07);重慶市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(CSTC，2008BB1267);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(柑桔)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目資助。