韓秋敏，李登超，黃亞?wèn)|，韓正亮

(1.江蘇食品職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇淮安 223003; 2.淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江蘇淮安 223300)

淮山藥薯蕷皂苷測(cè)定方法的研究

韓秋敏1，李登超2，黃亞?wèn)|1，韓正亮2

(1.江蘇食品職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇淮安 223003; 2.淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江蘇淮安 223300)

對(duì)常用的紫外－可見(jiàn)分光光度法即香草醛－高氯酸法、香草醛－硫酸法和甲醇－硫酸法測(cè)定薯蕷皂苷含量的方法進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明，不同顯色方法所形成的化合物的最大吸收波長(zhǎng)和穩(wěn)定性有很大差別，其中硫酸－甲醇法最佳，最大吸收波長(zhǎng)為332nm，60min內(nèi)穩(wěn)定性良好，且在2.4～24μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性相關(guān)。采用硫酸－甲醇法測(cè)定淮山藥薯蕷皂苷的含量為0.535mg/g，RSD為1.06%，該法操作簡(jiǎn)單、精密度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，可用于淮山藥薯蕷皂苷的含量測(cè)定。

淮山藥，薯蕷皂苷，比色法

山藥為薯蕷科植物薯蕷的塊莖，它營(yíng)養(yǎng)豐富，既可做主食食用，又可做蔬菜或釀酒原料，同時(shí)又是一味重要的滋補(bǔ)藥物?，F(xiàn)代研究表明，山藥中含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、無(wú)機(jī)鹽和多種維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還含有大量纖維素以及膽堿、皂苷、精氨酸、甘露聚糖、多酚氧化酶等成分，具有益智健腦、降低血糖、固腸止瀉、止咳祛痰等多種作用;廣泛用于滋補(bǔ)健身和防治多種疾病［1－3］。薯蕷皂苷(dioscin)廣泛存在于薯蕷科、百合科、豆科等植物中，其中在薯蕷科植物中含量豐富，如穿龍薯蕷、山藥、盾葉薯蕷等［4］。近年來(lái)隨著分離提取技術(shù)的不斷發(fā)展，多種薯蕷皂苷被分離出來(lái)，并不斷發(fā)現(xiàn)其生物活性，特別是在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血脂等方面的作用不斷被引起重視［5］。目前有關(guān)山藥中薯蕷皂苷的含量的測(cè)定方法有很多種，主要有比色法、高效液相層析法、薄層掃描法等。其中比色法操作簡(jiǎn)便、快捷，不需要昂貴儀器，適于一般實(shí)驗(yàn)室的分析檢測(cè)。常用的顯色方法有香草醛－高氯酸法、香草醛－硫酸法和甲醇－硫酸法。皂苷顯色的原理一般認(rèn)為是強(qiáng)酸使羧基脫水而使其雙鍵數(shù)目增加，又經(jīng)雙鍵位移后與顯色劑縮合等反應(yīng)形成共軛結(jié)構(gòu)，最后在酸作用下形成碳正離子鹽而顯色［6－7］。因此，本文以當(dāng)?shù)刭Y源豐富而又急待開(kāi)發(fā)的淮山藥和其中的活性物質(zhì)薯蕷皂苷為主要研究對(duì)象，對(duì)上述三種比色法測(cè)定薯蕷皂苷含量的測(cè)定方法進(jìn)行了比較研究，期望建立一種簡(jiǎn)便、快速而靈敏的薯蕷皂苷含量測(cè)定方法，為開(kāi)發(fā)淮山藥資源提供有價(jià)值的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薯蕷皂苷對(duì)照品(純度98%) 南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司;鮮淮山藥 購(gòu)自淮安市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);其他所用試劑 均為市售分析純。

UV757CR紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;HH－S恒溫水浴鍋 金壇市億通電子有限公司;RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;BS224S電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器系統(tǒng)有限公司;DHG－92 40A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱(chēng)取薯蕷皂苷對(duì)照品1.2mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，備用。

1.2.2 香草醛－高氯酸法［8］取薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)液1mL，置于10mL具塞試管中，水浴揮干甲醇，加5%香草醛－冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸溶液0.8mL，搖勻，60℃水浴保溫15min，取出后立即用冰水冷卻，加入5mL冰醋酸稀釋?zhuān)圆患釉碥盏钠叫袠訛榭瞻讓?duì)照，在400～1000nm范圍掃描。

1.2.3 香草醛－硫酸法［9］取薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)液1mL，置于10mL具塞試管中，水浴揮干甲醇，加5%香草醛－冰醋酸溶液0.2mL，77%硫酸5mL，搖勻，60℃水浴保溫15min，取出后立即用流水冷卻，以不加皂苷的平行樣為空白，在400～1000nm掃描。

1.2.4 甲醇－硫酸法［10－11］取薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)液0.4mL，置于10mL具塞試管中，水浴揮干甲醇，加硫酸－甲醇(7∶3)溶液5mL，60℃水浴保溫1h，取出后冰水冷卻，以不加皂苷的硫酸－甲醇溶液為對(duì)照，在200～1000nm范圍內(nèi)掃描。

1.3 淮山藥中薯蕷皂苷的提取制備

1.3.1 淮山藥的干燥工藝 淮山藥→洗滌→去皮切片→護(hù)色→低溫→干制→磨粉備用

選取無(wú)腐爛，無(wú)霉變斑點(diǎn)的新鮮淮山藥，用流動(dòng)的水沖洗干凈其外部的泥土、沙粒等。用不銹鋼刀去皮后，迅速切成2～3mm厚的薄片。將切好的山藥片快速浸入護(hù)色液中(檸檬酸∶無(wú)水氯化鈣∶蒸餾水為0.2∶0.2∶100)，使淮山藥充分浸漬，不要露出到空氣中，護(hù)色時(shí)間是1h。

將淮山藥片鋪攤在有篩眼斜盤(pán)上，送入干燥箱中，干燥溫度在45℃左右，在干制初期注意排除濕氣并且避免表面硬化，干制后期要注意溫度，避免焦化。將烘干的淮山藥冷卻，磨成粉末，備用［12］。

1.3.2 回流法提取薯蕷皂苷［13］取5g干燥淮山藥粉，精密稱(chēng)定，置于250mL的錐形瓶中，然后向其中加入80%甲醇，搖勻，在60℃條件下，回流提取6h，冷卻后用布氏漏斗過(guò)濾，將濾渣回收置于錐形瓶中按照上面的操作重復(fù)提取一遍，將2次濾液混合濃縮至褐色粘稠狀時(shí)冷卻。將濃縮液用20mL蒸餾水溶解，然后用等體積的石油醚脫脂2次，取水層，將其濃縮至15mL。水溶液用水飽和的正丁醇萃取(在分液漏斗里面放入21mL水和100mL正丁醇，振搖提取數(shù)分鐘，放置分層后取用上層的水飽和正丁醇即可)，萃取3次(每次5mL)，取正丁醇層濃縮，減壓回收正丁醇。將得到的粗制品用甲醇溶解并定量轉(zhuǎn)移到10mL容量瓶中，為測(cè)定液。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定方法的選擇

為了比較三種不同比色方法的優(yōu)劣，對(duì)不同處理方法得到的化合物進(jìn)行波長(zhǎng)掃描(見(jiàn)圖1)，并對(duì)形成的顯色化合物在0～60min進(jìn)行穩(wěn)定性分析(見(jiàn)圖2)。

圖1 比色法吸光值掃描曲線(xiàn)

由圖1可知，不同的顯色方法，形成化合物的最大吸收波長(zhǎng)和吸光度值均不同。香草醛－高氯酸法處理的化合物的最大吸收峰是481nm，吸光值是0. 913;香草醛－硫酸法處理的化合物最大吸收峰在458nm，吸光值是1. 019;甲醇－硫酸法處理的化合物最大吸收峰是332nm，吸光值0.526。圖2顯示的是不同處理方法得到的化合物在60min的穩(wěn)定性。可以看出香草醛－高氯酸法的穩(wěn)定性最差，60min吸收值下降了27.5%，RSD為8.29%(n=7);香草醛－硫酸法和甲醇－硫酸法的穩(wěn)定性都很好，RSD分別為0.34%(n=7)和0.08%(n=7)，但甲醇－硫酸法峰形更好、靈敏度高，并且考慮到所用藥品來(lái)源，甲醇易得價(jià)廉。因此，采用甲醇－硫酸法方法作為薯蕷皂苷比較適宜的測(cè)定方法。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于10mL具塞試管中，揮干溶劑，加硫酸－甲醇溶液5.0mL，60℃水浴保溫1h，取出立即冰水浴冷卻至室溫，搖勻，在332nm測(cè)定吸光度值，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，薯蕷皂苷的含量在2.4～24μg/mL范圍內(nèi)，具有良好的線(xiàn)性相關(guān)性?；貧w方程為y= 0.0554x+0.0776，相關(guān)系數(shù)R2=0.9965。

表1 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 化合物在60min穩(wěn)定性

圖3 薯蕷皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一份標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.3mL，按2.2方法操作，重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果測(cè)定RSD=0.56%，表明該方法精密度良好。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批次的樣品6份，按1.3方法制備樣品液，按2.2方法操作，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果RSD=1.48%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密吸取供試樣品液，精密加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照樣品含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1，計(jì)算加樣回收率為98.2%。

2.6 淮山藥樣品測(cè)定

精密稱(chēng)取同一批次的山藥粉3份，按回流法提取山藥中的薯蕷皂苷，甲醇－硫酸法測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得山藥中薯蕷皂苷的含量分別為0.540、0.537、0.529mg/g，平均含量為0.535mg/g，RSD為1.06%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比色法測(cè)定薯蕷皂苷含量不同顯色劑的選擇方面，進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)表明，香草醛－高氯酸法在最大吸收峰處的吸光值最大，但穩(wěn)定性差;香草醛－硫酸法、甲醇－硫酸法在最大吸收峰處的吸光值適中，穩(wěn)定性好。但甲醇－硫酸法峰形更好，靈敏度高。甲醇－硫酸法測(cè)定薯蕷皂苷含量在2.4～24μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性相關(guān)。采用甲醇－硫酸法測(cè)定淮山藥中薯蕷皂苷含量為0.535mg/g，RSD為1.06%。通過(guò)方法學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，該法簡(jiǎn)便快捷、重現(xiàn)性好，精密度高。

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Study on the determination method of dioscin in Dioscorea opposita Thunb

HAN Qiu－min1，LI Deng－chao2，HUANG Ya－dong1，HAN Zheng－liang2
(1.School of Biological and Chemical Engineering，Jiangsu Food Science College，Huai’an 223003，China; 2.School of Life Sciences，Huaiyin Normal University，Huai’an 223300，China)

Commonly used ultraviolet－visible spectrophotometry methods，vanillin－perchloric acid method，vanillinsulfuric acid and methanol－sulfuric acid method，for determination content of dioscin were comparatively studied. The results showed that compounds formed under different treatments were very different at the maximum absorption wavelength and their stabilities.The methanol－sulfuric acid method was good，and the maximum absorption wavelength was 332nm，with good stabilities within 60min.The calibration curve was linear in the range of 2.4～24μg/mL.Average content of dioscin in Dioscorea opposita Thunb was 0.535mg/g with RSD 1.06%by the methanol－sulfuric acid method.This method was simple，accurate，sensitive and stable，which could be used for the quantitative determination of total dioscin in Dioscorea opposita Thunb.

Dioscorea opposita Thunb;dioscin;colorimetry

TS207.3

A

1002－0306(2011)12－0494－03

2011－06－27

韓秋敏(1976－)，女，講師，碩士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)方面的研究。