石萌萌，王 嘉，謝 瑤

(北京東方紅航天生物技術(shù)股份有限公司，北京 100190)

高效液相色譜法測(cè)定表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯含量

石萌萌，王 嘉，謝 瑤*

(北京東方紅航天生物技術(shù)股份有限公司，北京 100190)

建立了一種利用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定綠茶提取物原料中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)含量的方法。通過(guò)對(duì)流動(dòng)相組成、色譜柱、流速及溫度等色譜條件的選擇及優(yōu)化，得到了適合EGCG檢測(cè)的色譜條件:色譜柱TSK－GEL?ODS－100V，流動(dòng)相組成甲醇∶水∶乙酸=23∶75∶2的，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)276nm，柱溫24℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EGCG在含有咖啡因及與EGCG類(lèi)似物質(zhì)的復(fù)雜體系中被快速、高效地檢出。同時(shí)，該方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)效率高，重現(xiàn)性好，可以有效地節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，進(jìn)一步證明了該方法可行性。在實(shí)際測(cè)定中，可以實(shí)現(xiàn)原料檢測(cè)工作的快速、高效運(yùn)行，適合企業(yè)對(duì)綠茶提取物原料中EGCG的質(zhì)量控制。

綠茶提取物，EGCG，HPLC，測(cè)定，質(zhì)量控制

飲茶在我國(guó)擁有悠久的歷史，茶葉中的多酚對(duì)健康極為有利，它是茶葉中兒茶素類(lèi)、丙酮類(lèi)、酚酸類(lèi)和花色素類(lèi)化合物的總稱(chēng)。兒茶素類(lèi)主要包括:表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGC)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)及表兒茶素(EC)。其中EGCG的含量最高，約占兒茶素總量的50%［1－2］。EGCG是一種抗氧化和清除自由基功能很強(qiáng)的活性物質(zhì)，已作為一種抗癌新藥成為現(xiàn)今科研和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)［3］。它的抗氧化活性是VE的20倍、SOD的6倍［4］，具有明顯的清除體內(nèi)自由基、抗癌、抗炎、抗突變、抗衰老及改善肝功能等生物活性［4］。研究表明，EGCG能較全面地調(diào)節(jié)血脂，一方面，通過(guò)其自身的強(qiáng)抗氧化活性控制膽固醇的氧化，抑制脂質(zhì)物在血管壁沉積;另一方面，抑制食物中不飽和脂肪酸的氧化，從而減少血清膽固醇含量及保持脂質(zhì)在動(dòng)脈壁的進(jìn)入和移出的正常動(dòng)態(tài)平衡［5］。目前，EGCG的檢測(cè)方法主要包括容量法、比色法及原子吸收法［3］，但大多存在儀器要求復(fù)雜、靈敏度低等缺點(diǎn)。由于高效液相色譜技術(shù)具有分辨率高、分析速度快、重復(fù)性好、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，在食品原料檢測(cè)方面已成為了重要的分析手段［8］。已報(bào)道的EGCG分離、純化、制備的文獻(xiàn)中涉及的一些檢測(cè)方法［3，6－7］，大多未考慮EGCG與咖啡因的分離，但目前在保健食品中應(yīng)用的綠茶提取物原料中，咖啡因含量對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量控制非常重要，因此EGCG與咖啡因的分離尤為重要［1，16］。針對(duì)以上情況，本文對(duì)色譜條件進(jìn)行了選擇及優(yōu)化，建立了簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)綠茶提取物中EGCG的方法，適用于企業(yè)對(duì)綠茶提取物原料的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇 fisher公司，色譜純;超純水 屈臣氏;乙酸 北京化學(xué)試劑公司，分析純;EGCG標(biāo)準(zhǔn)品 杭州禾田生物技術(shù)有限公司，純度＞99%;綠茶提取物 福州日冕科技開(kāi)發(fā)有限公司。

高效液相色譜儀 配有996紫外檢測(cè)器，515泵及M32色譜工作站，美國(guó)Waters公司;TSK－GEL? ODS－100V色譜柱 C18，3μm，4.6×150mm，東曹達(dá)(上海)貿(mào)易有限公司;BS210S型電子分析天平 德國(guó)Sartorius公司;LDZ4－0.8型醫(yī)用離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;KQ－250DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;振蕩器 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司;FW80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 蘇州江東精密儀器有限公司;SHB－IIIA型真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 樣品制備 取綠茶提取物原料，準(zhǔn)確稱(chēng)取約0.1g，加一定量純水溶解，再定容至100mL容量瓶中，備用。

1.2.1.2 對(duì)照品制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取 EGCG對(duì)照品20.0mg，加一定量純水溶解，再定容至50mL的容量瓶中，備用。

1.2.2 色譜條件的選擇 分別精密吸取對(duì)照品與供試品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，測(cè)定樣品中EGCG的含量。

1.2.2.1 流動(dòng)相組成的優(yōu)化 在色譜柱為 Kromasil C18(5μm，4.6mm×150mm);進(jìn)樣量為20μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為276nm;流速為1.0mL/min;柱溫為室溫的條件下，分別采用甲醇∶水∶乙酸(20∶79∶1)、甲醇∶水∶乙酸(28∶71∶1)、甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2)、甲醇∶水∶乙酸(18∶80∶2)、甲醇∶水∶乙酸(20∶78∶2)的不同流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2.2 色譜柱的優(yōu)化 在流動(dòng)相采用甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2)，進(jìn)樣量為20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為276nm，流速為1.0mL/min，室溫條件下，分別采用色譜柱Kromasil C18(5μm，4.6mm×150mm)、Kromasil C18(5μm，4.6mm ×250mm)、Inertail ODS－4 C18(5μm，4.6mm × 250mm)、TSK－GEL? ODS－100V(3μm，4.6 mm× 150mm)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2.3 流速的優(yōu)化 在色譜柱為T(mén)SK－GEL? ODS－100V(3μm，4.6 mm×150mm)，流動(dòng)相為甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2)，進(jìn)樣量為20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為276nm，室溫條件下，分別在1.0、0.9、0.8mL/min流速下進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2.4 溫度的優(yōu)化 在色譜柱為T(mén)SK－GEL?ODS－100V(3μm，4.6mm ×150mm)，流動(dòng)相為甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2);進(jìn)樣量為20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為276nm，流速為1.0mL/min的條件下，分別將柱溫度設(shè)定為28、26、25、24℃進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取EGCG對(duì)照品9.0、19.5、29.7、39.6、51.3mg，分別加純水溶解，再定容至50mL容量瓶中，備用。在流動(dòng)相組成為:甲醇∶水∶乙酸=23∶75∶ 2;色譜柱為:TSK－GEL? ODS－100V (3μm，4.6×150mm);流速為 1.0mL/min;柱溫為24℃條件下，精密吸取各濃度的對(duì)照品溶液20μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。

1.2.4 精密度測(cè)定 在1.2.3中所述色譜條件下，準(zhǔn)確吸取EGCG對(duì)照品溶液20μL，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積及保留時(shí)間。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相組成的優(yōu)化

在其他色譜條件相同的情況下，分別對(duì)組成為甲醇∶水∶乙酸(20∶79∶1)、甲醇∶水∶乙酸(28∶71∶1)、甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2)、甲醇∶水∶乙酸(18∶80∶2)、甲醇∶水∶乙酸(20∶78∶2)的流動(dòng)相進(jìn)行考察，比較了不同流動(dòng)相組成對(duì)EGCG保留時(shí)間和分離度的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著甲醇含量的提高，EGCG的保留時(shí)間逐漸縮短，其與咖啡因的分離度出現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)甲醇含量為18%時(shí)，EGCG與咖啡因未能分開(kāi)(見(jiàn)圖1－A);當(dāng)甲醇含量為20%時(shí)，EGCG與咖啡因分離度提高，但未能達(dá)到基線分離(見(jiàn)圖1－B);當(dāng)甲醇含量為23%時(shí)，EGCG與咖啡因分離度進(jìn)一步提高，實(shí)現(xiàn)基線分離(見(jiàn)圖1－C);當(dāng)甲醇含量大于23%以后，分離度開(kāi)始下降(見(jiàn)圖1－D)。最終得到最優(yōu)流動(dòng)相組成為甲醇∶水∶乙酸=23∶75∶2。

2.2 色譜柱的優(yōu)化

在其他參數(shù)相同的條件下，分別采用以下色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn):Kromasil C18(5μm，4.6mm×150mm)、Kromasil C18(5μm，4.6mm×250mm)、Inertail ODS－4 C18(5μm，4.6mm×250mm)、TSK－GEL?ODS－100V (3μm，4.6mm×150mm)。分別考察了色譜柱的填料類(lèi)型、填料粒徑、柱長(zhǎng)幾方面對(duì)綠茶提取物中EGCG與咖啡因分離度的影響，如表1所示。

表1 不同色譜柱條件下咖啡因與EGCG的分離度

綠茶提取物中的成分復(fù)雜，包括EGCG、咖啡因以及EGCG的多種類(lèi)似物等，要實(shí)現(xiàn)EGCG的快速高效檢測(cè)，就必須實(shí)現(xiàn)EGCG與其他物質(zhì)的快速分離，由于EGCG與咖啡因出峰時(shí)間最為接近，因此以EGCG與咖啡因的分離情況為例，顯示各色譜柱在EGCG檢測(cè)中的性能，選擇適合綠茶提取物中EGCG檢測(cè)的色譜柱。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，色譜柱的長(zhǎng)度對(duì)分離度的影響不大，但對(duì)保留時(shí)間影響較大。采用 Kromasil C185μm色譜柱進(jìn)行分離，250mm與150mm的色譜柱檢測(cè)所得分離度較為接近，效果沒(méi)有太大差異性。采用250mm的色譜柱進(jìn)行檢測(cè)，EGCG的保留時(shí)間為20min左右，檢測(cè)全程時(shí)間需要60min;而用150mm的色譜柱檢測(cè)，EGCG的保留時(shí)間為6min左右，檢測(cè)全程時(shí)間需要30min。在能夠達(dá)到要求的情況下，選擇150mm的色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定，以實(shí)現(xiàn)EGCG的快速、高效檢測(cè)。

圖1 不同流動(dòng)相組成對(duì)綠茶提取物中ECGC與咖啡因的分離的影響

色譜柱填料的修飾情況及粒徑對(duì)分離效果有一定的影響。色譜柱Kromasil C18，其填料為常規(guī)未經(jīng)修飾的C18填料;Inertail ODS－4 C18與TSK－GEL? ODS－100V色譜柱，其填料均為C18經(jīng)過(guò)一定修飾的填料。從表1中可以發(fā)現(xiàn)，填料修飾情況對(duì)EGCG與咖啡因的分離有一定影響;同時(shí)，從色譜柱填料粒徑方面可以發(fā)現(xiàn)，隨著粒徑的減小，可以進(jìn)一步提高EGCG在綠茶提取物復(fù)雜體系中的分離能力，如采用填料粒徑為3μm的TSK－GEL?ODS－100V色譜柱進(jìn)行分離，分離度可以達(dá)到2.40，表現(xiàn)出了較為顯著的優(yōu)勢(shì)。綜合考慮，選擇色譜柱為T(mén)SK－GEL?ODS－100V(3μm，4.6×150mm)。

2.3 流速的優(yōu)化

在色譜柱為T(mén)SK－GEL?ODS－100V;流動(dòng)相為甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2);進(jìn)樣量為20μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為276nm;柱溫為室溫的條件下，分別對(duì)流速為1.0、0.9、0.8mL/min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)流速為1.0mL/min時(shí)，EGCG與咖啡因能夠得到較好的分離，分離度為2.19，并且EGCG與其后的EGCG類(lèi)似物也能實(shí)現(xiàn)有效分開(kāi)，分離度為5. 44;隨著流速的降低，其對(duì)EGCG的分離情況影響不大。因此，在保證EGCG分離效果的前提下，最終選擇流速為1.0mL/min。

2.4 溫度的優(yōu)化

在色譜柱為T(mén)SK－GEL?ODS－100V;流動(dòng)相為甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2);進(jìn)樣量為20μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為276nm;流速為1.0mL/min的條件下，分別選擇柱溫為28、26、25、24℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考查不同溫度對(duì)綠茶提取物中EGCG和咖啡因分離效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EGCG與咖啡因的分離對(duì)溫度較為敏感，且隨著溫度的升高，分離度呈下降趨勢(shì)。在28、26℃時(shí)EGCG與咖啡因不能分開(kāi)，為單峰;在25℃時(shí)EGCG與咖啡因分離不完全，分離度為0. 72;24℃時(shí)EGCG與咖啡因分離度為2.54，實(shí)現(xiàn)完全分離。故選擇24℃為最佳的柱溫。

2.5 線性關(guān)系

以峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，其標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，回歸方程為Y=29861582X－743171，r=0.9991，EGCG在0.2～1.0mg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。

圖2ECGC的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 精密度分析

按照1.2.4方法對(duì)綠茶提取物中EGCG含量進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)5次進(jìn)樣所得峰面積及特征峰保留時(shí)間RSD分別為1.62%和0.69%(n=5)。結(jié)果表明，該方法精密度較好，進(jìn)一步證明了方法的可行性。

3 結(jié)論

本方法在保證良好的精密度和線性關(guān)系的基礎(chǔ)上檢測(cè)綠茶提取物原料中EGCG的含量。經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)色譜柱、流動(dòng)相組成、流速、柱溫等高效液相色譜條件進(jìn)行了選擇和優(yōu)化。確定了色譜柱為T(mén)SK－GEL?ODS－100V，流動(dòng)相組成為甲醇∶水∶乙酸= 23∶75∶2，流速為1.0mL/min，波長(zhǎng)為276nm，柱溫為24℃為綠茶提取物原料中檢測(cè)EGCG的最佳參數(shù)。該方法分離效果好、精密度高、線性關(guān)系好，適用于保健品綠茶提取物原料中EGCG的測(cè)定，可作為產(chǎn)品原料質(zhì)量控制的方法。

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Determination of epigallocatechin gallate in green tea extract by high performance liquid chromatography

SHI Meng－meng，WANG Jia，XIE Yao*
(Beijing Dawn Aerospace Bio－Tech CO.，LTD.，Beijing 100190，China)

A method for determination of EGCG by HPLC in green tea extract was developed.The chromatographic conditions including mobile phase composition，chromatographic column，flow rate and temperature were optimized.Exactly，TSK－GEL?ODS－100V column was used with the mobile phase of methanol:water:aceticacid (23∶75∶2)at column temperature of 24℃，and the flow rate was 1.0mL/min with UV detection at 276nm.The results showed that EGCG was rapidlly separated and detected in the complex system contained caffeine and EGCG similarities.With the advantages of simple，low cost，high efficency and good reproducibility，this method could be successfully used for quality control in the determination of EGCG in green tea extract.

green tea extract;EGCG;HPLC;determination;quality control

TS207.3

A

1002－0306(2011)12－0476－04

2011－08－31 *通訊聯(lián)系人

石萌萌(1981－)，女，本科，工程師，從事保健品分析檢測(cè)方向的研究。