李 虹, 王 蕾, 肖傳實(shí), 楊慧宇

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科， 山西 太原 030001)

不同周齡自發(fā)性高血壓大鼠血管內(nèi)皮功能及氧化應(yīng)激的變化研究*

李 虹, 王 蕾, 肖傳實(shí)△, 楊慧宇

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科， 山西 太原 030001)

目的觀察不同周齡的自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)內(nèi)皮功能變化、體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)及其對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響。方法將SHR隨機(jī)分為3組：5周、16周及40周齡組，每組各15只。觀察SHR離體胸主動(dòng)脈和腎動(dòng)脈對(duì)乙酰膽堿(Ach)的反應(yīng)性，并對(duì)其內(nèi)皮功能變化進(jìn)行比較，分別使用放射免疫法、硝酸還原酶法、硫代巴比妥酸比色法和5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)法檢測(cè)血中內(nèi)皮素(ET)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)含量。結(jié)果內(nèi)皮依賴性血管舒張功能隨著周齡的增加而減弱。隨著周齡的增加，血管活性物質(zhì)NO/ET及氧化應(yīng)激標(biāo)志GSH-Px、MDA發(fā)生變化。16周及40周血清NO低于5周齡SHR[(12.84±1.58)μmol/L，(12.17±1.17)μmol/Lvs(22.64±1.69)μmol/L,P<0.01]；16周及40周ET分泌水平無(wú)明顯差別，與5周相比無(wú)顯著差別；40周MDA含量[(13.71±1.47) ng/L ] 與5周[ (7.54±1.19) ng/L ] 和16周 [ (7.94±0.83) ng/L ] 相比明顯增加(P<0.01)；而40周GSH-Px活力 [ (2 368.00±60.39)×103U/L ] 與5周[ (2 925.00±75.11)×103U/L ]和16周 [(2 976.00± 329.94)×103U/L] 相比明顯降低(P<0.01)。結(jié)論SHR存在內(nèi)皮功能損傷及氧化應(yīng)激的增加，隨著周齡的增加損傷加重。

自發(fā)性高血壓大鼠; 內(nèi)皮功能; 氧化性應(yīng)激; 高血壓

高血壓是危害人民健康最為常見(jiàn)的心血管疾病。其患病率隨年齡而增長(zhǎng)。目前對(duì)非血流動(dòng)力學(xué)機(jī)制內(nèi)皮-一氧化氮(nitric oxide,NO)-氧化應(yīng)力鏈(oxidation stress)在高血壓發(fā)生發(fā)展中的重要參與受到重視，血管內(nèi)皮是一個(gè)動(dòng)態(tài)的器官，其結(jié)構(gòu)和功能的正常對(duì)維持血流穩(wěn)態(tài)起著重要作用。在高血壓狀態(tài)下，血管內(nèi)皮功能失調(diào)，內(nèi)皮依賴性血管舒張功能下降。氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和抗氧化防御之間嚴(yán)重失衡的一種病理狀態(tài)，在高血壓的發(fā)生發(fā)展中起著不可忽視的作用。有實(shí)驗(yàn)研究表明，與年齡相關(guān)的自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)的主動(dòng)脈抗氧化酶活性改變，提示年齡增加，抗氧化酶活性降低。在內(nèi)皮功能與氧化應(yīng)力關(guān)系的研究中部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用抗氧化劑、外源性NO供體及過(guò)氧化物歧化酶類似物治療可以阻止年齡依賴性內(nèi)皮細(xì)胞凋亡且改善大鼠的內(nèi)皮功能并降低血壓[1-3]。然而對(duì)于不同周齡SHR體內(nèi)內(nèi)皮功能變化、氧化應(yīng)激狀態(tài)及其相互作用，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究主要采用離體血管環(huán)技術(shù)觀察不同周齡SHR內(nèi)皮功能變化、體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)及其對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響，以評(píng)價(jià)年齡對(duì)它們的影響，為進(jìn)一步觀察對(duì)不同周齡SHR的藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料及試劑

1.1動(dòng)物 雄性SHR 5周、16周、40周齡，重250 g，清潔級(jí)，購(gòu)自四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)中心[編號(hào)為SCXK(川)2004-16]。

1.2主要試劑 NO試劑盒、內(nèi)皮素(endothelin,ET)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(glutathione peroxidase,GHS-Px)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，胎牛血清購(gòu)自上海浦東新區(qū)高橋獸醫(yī)站，臺(tái)盼藍(lán)染液購(gòu)自Amresco，苯腎上腺素(phenylephrine，PE)購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司，乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)購(gòu)自Sigma。

1.3主要儀器 遙感測(cè)壓監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(DSI)；植入子(TAllPA-CA0)(DSI)；數(shù)據(jù)接收器(PRC-1 SN6301)(DSI)；外界壓力監(jiān)控器(APR-1 SN 1782)(DSI)；數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器(Matrix 2261)(DSI)；數(shù)據(jù)處理軟件(Silver 4．0)(DSI)；BL-410生物信號(hào)顯示與處理系統(tǒng)(成都泰盟電子有限公司)。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組 SHR分為3組：分別為5周齡、16周齡、40周齡，每組各15只。

2.2血壓遙感監(jiān)測(cè)系統(tǒng)建立 SHR使用1%戊巴比妥鈉(4 mL/kg)麻醉，于腹正中線切開(kāi)長(zhǎng)約2-3 cm的切口，分離腹主動(dòng)脈，用2%利多卡因沖洗血管。暫時(shí)夾閉血管，用25號(hào)針頭穿入腹主動(dòng)脈并順其孔將植入子導(dǎo)管插入約5-6 mm(逆血流方向)，用纖維片固定導(dǎo)管。之后，再次用2%利多卡因沖洗血管，避免血管收縮痙攣。將腸段送回腹腔。植入子被固定在腹壁并關(guān)腹。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)，可以無(wú)拘束自由活動(dòng)，術(shù)后7-10 d左右血壓、心率趨于穩(wěn)定，將籠置于接收板上收集數(shù)據(jù)，并由信號(hào)處理器轉(zhuǎn)換后用相關(guān)軟件分析整理，監(jiān)測(cè)血壓心率變化。

2.3胸主動(dòng)脈條制備及方法

① 胸主動(dòng)脈條制備 用1%戊巴比妥鈉，即4 mL/kg腹腔注射，麻醉動(dòng)物。迅速將胸主動(dòng)脈分離，清除掉脂肪和黏連的離體動(dòng)脈剪成3-4 mm的血管環(huán)備用。懸掛在盛有PSS液的器官浴管中，并與張力換能器相連，浴管中持續(xù)通以95%O2、5%CO2的混合氣體。

② 方法 將血管環(huán)水平懸吊于容積為10 mL的組織浴池中，并連接在Powerlab記錄儀張力轉(zhuǎn)感器上。置于37 ℃通95%O2、5%CO2的 PSS液[含(mmol·L-1) NaCl 144, KCl 5.8, MgCl21.2, CaCl22.5, 葡萄糖11.1, HEPES 5 (pH 7.4)]中,取靜息張力2 g平衡80 min,在PE(終濃度為10-7mol·L-1)預(yù)收縮的基礎(chǔ)上,觀察并計(jì)算ACh(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol·L-1)誘導(dǎo)的最大舒張百分比，間接反映血管內(nèi)皮功能。

2.4腎動(dòng)脈條制備及方法

① 腎動(dòng)脈條制備 用1%戊巴比妥鈉，即4 mL/kg腹腔注射，麻醉動(dòng)物。立即取出腎臟浸入4 ℃的 PSS液中。先用大頭針固定腎臟于盛有 PSS 液的平皿，腎組織中動(dòng)脈較韌，可用鑷子直接剝碎腎組織暴露腎動(dòng)脈各級(jí)分支，沿腎動(dòng)脈剝離動(dòng)脈的三級(jí)分支，分離干凈周圍的組織，剪取 2 mm 左右的血管環(huán)。

② 方法 將2根直徑為 40 μm 的鎢絲穿入管腔，固定血管環(huán)在 Multi Myograph System-610M 浴漕內(nèi)傳感器上，持續(xù)通以 100% O2。浴漕溫度恒定在 37 ℃，平衡 60 min 后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，平衡期間每隔 15 min 用預(yù)熱的 PSS 液(37 ℃)更換浴漕內(nèi)液體1次。血管環(huán)的張力變化通過(guò) DMT 的換能系統(tǒng)采集，并用 Chart 5.3 記錄在微機(jī)上。

2.6血清ET含量測(cè)定 大鼠斷頭處死后，取血2 mL加入含10%EDTA-Na230 μL，抑肽酶400 IU的冰預(yù)冷試管中，混勻，4 ℃ 3 000 r/min離心15 min，分離血漿，取上清，采用放免法測(cè)血漿ET水平。

2.7血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量測(cè)定 采用硫代巴比妥酸比色法(TBA)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。

2.8血清GSH-Px活性測(cè)定 用5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)直接顯色法測(cè)定GSH-Px活性。酶活性單位：0.1 mL血漿反應(yīng)5 min使反應(yīng)液中GSH濃度降低1 μmol/L為1個(gè)活性單位。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1不同周齡SHR動(dòng)態(tài)血壓變化

從圖1A中可以直觀地看到16周SHR的24 h血壓情況，血壓呈夜間高，白天低的晝夜變化，平均動(dòng)脈壓波動(dòng)在(133.50±7.83)mmHg左右，脈壓約(48.78±6.42)mmHg。從圖1B中同樣可以直觀地看到40周SHR的24 h血壓情況，血壓呈夜間高，白天低的晝夜變化，平均動(dòng)脈壓波動(dòng)在(140.6±14.7)mmHg左右，脈壓約(50.48±4.57)mmHg。監(jiān)測(cè)16周及40周SHR的24 h動(dòng)態(tài)血壓，發(fā)現(xiàn) 40周SHR較16周SHR 24 h血壓均值高，但沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

圖1通過(guò)遙感測(cè)壓監(jiān)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)不同周齡SHR24h動(dòng)態(tài)血壓變化

2不同周齡SHR胸主動(dòng)脈環(huán)、腎動(dòng)脈環(huán)內(nèi)皮功能的實(shí)驗(yàn)研究

不同周齡SHR胸主動(dòng)脈環(huán)對(duì)ACh的濃度依賴性比較：40周SHR最大內(nèi)皮依賴性舒張功能與5周及16周相比明顯降低(57.49%±7.04%vs78.88%±11.04%，76.81%±3.18%，P<0.01)，5周與16周之間無(wú)明顯差異；不同周齡SHR腎動(dòng)脈環(huán)對(duì)ACh的濃度依賴性比較：40周SHR最大內(nèi)皮依賴性舒張功能與5周及16周相比明顯降低(17.40%±10.34%vs55.72%±9.99%，65.07%±3.46%P<0. 01)，5周與16周之間無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖2A、B。

3不同周齡SHR血清NO、ET、MDA、GSH-Px含量測(cè)定

16周及40周SHR的血清NO含量[(12.84±1.58)μmol/L，(12.17±1.17)μmol/L]與5周SHR的NO含量(22.64±1.69)μmol/L相比明顯減少(P<0.01)，16周及40周NO含量無(wú)明顯差異,見(jiàn)表1。

5周SHR的ET含量[(147.19±13.11 ) ng/L]與16周及40周ET含量[(141.22±5.17) ng/L，(154.27±17.46) ng/L]相比無(wú)明顯差異,見(jiàn)表1。

40周MDA含量[(13.71±1.47) ng/L]較5周SHR的MDA[(7.54±1.19 ) ng/L]與16周[(7.94±0.83) ng/L]相比明顯增加(P<0.01)，5周及16周MDA含量無(wú)明顯差異，見(jiàn)表2。

圖2不同周齡SHR主動(dòng)脈環(huán)和腎動(dòng)脈環(huán)對(duì)ACh的濃度依賴性比較

表1不同周齡SHR血清NO、ET、MDA、GSH-Px含量測(cè)定

Index5-weekSHR16-weekSHR40-weekSHRNO(μmol/L)22.64±1.6912.84±1.58**12.17±1.17**ET(ng/L)147.19±13.11141.22±5.17154.27±17.46NO/ET(ratio)0.15380.09090.0788MDA(ng/L)7.94±0.83#7.54±1.19#13.71±1.47GSH-Px(103U/L)2925.00±75.11#2976.00±329.94#2368.00±60.39

**P<0.01vs5-week SHR;#P<0.05vs40-week SHR.

40周GSH-Px含量[(2 368.00±60.39)×103U/L]與5周SHR的GSH-Px[(2 925.00±75.11)×103U/L]和16周[(2 976.00±329.94)×103U/L]相比明顯降低(P<0.01)，5周及16周GSH-Px含量無(wú)明顯差異，見(jiàn)表1。

討 論

原發(fā)性高血壓的病因和發(fā)病機(jī)制與多種因素有關(guān)，其中內(nèi)皮-NO-OS鏈對(duì)血壓的調(diào)節(jié)具有重要意義。自從1973年Ross等[4]首先提出動(dòng)脈內(nèi)膜損傷可以促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的假說(shuō)后，內(nèi)皮細(xì)胞損傷學(xué)說(shuō)一直受到廣泛重視。新近研究表明，心血管活性物質(zhì)平衡失調(diào)在原發(fā)性高血壓的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。內(nèi)皮源性舒張因子NO與原發(fā)性高血壓的形成有著密切的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)觀察到16周及40周SHR的血清NO含量與5周SHR的NO含量相比明顯減少(P<0.01)，而16周及40周NO含量無(wú)明顯差異。5周SHR屬于高血壓的形成階段，而成熟期是在16周以后，在高血壓的形成階段，NO釋放減少，不隨著年齡的增加而變化。

與高血壓發(fā)病密切相關(guān)的血管活性物質(zhì)還包括ET。 ET與NO構(gòu)成了一對(duì)具有拮抗效應(yīng)的血管活性物質(zhì)。兩者合成釋放的協(xié)調(diào)是調(diào)節(jié)血管基礎(chǔ)張力、維持血壓穩(wěn)定的最主要因素。在各種高血壓動(dòng)物模型和人類原發(fā)性高血壓病人的研究中發(fā)現(xiàn)，血漿ET水平可表現(xiàn)為增高或降低[5-7]。本研究以同齡WKY大鼠為正常對(duì)照，發(fā)現(xiàn)SHR在高血壓發(fā)生前后其血漿ET水平顯著增高，提示SHR高血壓的形成可能與其高水平的ET含量有關(guān)，且與血壓正相關(guān)。但不同周齡的ET并未隨年齡的增加而增加，5周、16周及40周SHR的血漿ET含量無(wú)顯著差異。提示血漿ET在隨著年齡增加的高血壓發(fā)展中未發(fā)現(xiàn)明顯的作用，而可能僅與血壓升高的程度相關(guān)。

綜上所述，心血管活性物質(zhì)在原發(fā)性高血壓的發(fā)病過(guò)程中起著十分重要的作用，體內(nèi)調(diào)節(jié)血管舒縮及氧化應(yīng)力變化的活性物質(zhì)自身處在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡之中，各物質(zhì)之間互相影響與制約。

[1] Hirooka Y．Role of reactive oxygen species in brainstem in neural mechanisms of hypertension[J]．Auton Neurosci, 2008,142(1-2):20-24.

[2] Schnackenberg CG, Wilcox CS． Two-week administration of tempol attenuates both hypertension and renal excretion of 8-Iso prostaglandin F2α[J]．Hypertension, 1999, 33 (1 Pt 2): 424-428.

[3] Hoffmann J, Haendeler J, Aicher A,et al．Aging enhances the sensitivity of endothelial cells toward apoptotic stimuli:important role of nitric oxide[J]．Circ Rfes,2001,89 (8):709-715.

[4] Ross R,Glomset JA．Atherosclerosis and the artery smooth muscle cell: proliferation of smooth muscle cell is a key even in the genesis of the lesion of atherosclerosis [J]．Science,1973,180 (93):1332-1339.

[5] D’Amours M, Chbinou N, Beaudoin J,et al．Increased ET-1 and reduced ETBreceptor expression in uremic hypertensive rats[J]．Clin Exp Hypertens, 2010, 32(1):61-69.

[6] Ho SP, Chan-Yeung M, Chow KK,et al．Antioxidant enzyme activities in healthy Chinese adults: influence of age, gender and smoking[J]．Respirology, 2005, 10(3):305-309.

[7] Oztürk O, Gümülü S．Changes in glucose-6-phosphate dehydrogenase, copper, zinc-superoxide dismutase and catalase activities, glutathione and its metabolizing enzymes, and lipid peroxidation in rat erythrocytes with age[J]．Exp Gerontol,2004,39(2):211-216.

[8] 王業(yè)松，馬 虹，陳健文．苯那普利對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌缺血-再灌注心功能、氧自由基和肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶的影響[J]．中國(guó)病理生理雜志, 2004, 20(3): 425-428.

[9] Forgione MA, Weiss N, Heydrick S, et al． Cellular glutathione peroxidase deficiency and endothelial dysfunction[J]．Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2002，282(4):H1255-H1261.

[10]Meyer AJ．The integration of glutathione homeostasis and redox signaling[J]．J Plant Physiol, 2008, 165(13):1390-1403.

[11]Kerr S, Brosnan MJ, McIntyre M,et al．Superoxide anion production is increased in a model of genetic hypertension: role of the endothelium[J]．Hypertension, 1999, 33(6):1353-1358.

[12]De Sotomayor MA, Mingorance C, Rodriguez-Rodriguez R,et al． L-carnitine and its propionate: improvement of endothelial function in SHR through superoxide dismutase-dependent mechanisms[J]．Free Radic Res, 2007, 41(8):884-891.

[13]Simonsen U, Christensen FH, Buus NH．The effect of tempol on endothelium- dependent vasodilatation and blood pressure[J]．Pharmacol Ther, 2009, 122(2):109-124.

Endotheliumfunctionandoxidationstressinspontaneoushypertensiveratsofdifferentweeksofage

LI Hong, WANG Lei, XIAO Chuan-shi, YANG Hui-yu

(DepartmentofCardiology,TheSecondHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:ganxibaozhongxin@sina.com)

AIM: To observe the endothelial function and oxidation stress in spontaneous hypertensive rats (SHR) of different weeks of age.METHODSEndothelium-dependent vasodilation of exsomatized aorta thoracalis and renal artery in 5 week-, 16 week- and 40 week-old SHR was observed and compared. Radioimmunoassay and the methods of nitrate reductase, thiobarbituric acid and 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) were used to measure the levels of endothelin (ET), nitric oxide(NO),malondialdehyde(MDA) and glutathione peroxidase(GSH-Px),respectively.RESULTSThe results indicated that the endothelium-dependent vasodilation was weakened along with aging. Vasoactive substance such as NO/ET and the oxidized stress symbolized by GSH-Px or MDA were also changed along with aging. The level of serum NO in 16 and 40 week-old SHR were lower than that in 5 week-old SHR[ (12.84±1.58) μmol/L and (12.17±1.17) μmol/Lvs(22.64±1.69) μmol/L](P<0.01). No significant difference of the ET level among the 3 groups was observed. The level of MDA[ (13.71±1.47) ng/L] in 40 week-old animals was significantly higher than that in 5 week-old SHR[(7.54±1.19)ng/L] and 16 week-old SHR [(7.94±0.83) ng/L] (P<0.01). The activity of GSH-Px in 40 week-old SHR [(2 368.00±60.39)×103U/L] was significantly lower than that in 5 week-old SHR [(2 925.00±75.11)×103U/L] and 16 week-old SHR [(2 976.00± 329.94)×103U/L] (P<0.01).CONCLUSIONThe damaged endothelial function and increased oxidation stress are existed in SHR and are aggratated with aging.

Spontaneously hypertensive rats; Endothelial function; Oxidation stress; Hypertension

R331.3+6

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.035

1000-4718(2011)01-0179-04

2010-05-10

2010-10-19

山西省衛(wèi)生廳科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(No. 200818)

△ 通訊作者Tel:0351-3362132 ;E-mail-ganxibaozhongxin@sina.com