袁 非， 陳向武

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院眼科， 上海 200032)

氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管模型中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1的表達(dá)及機(jī)制研究*

袁 非△， 陳向武

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院眼科， 上海 200032)

目的觀察基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(SDF-1)在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管(OIR)模型中的表達(dá)情況，并初步研究其在OIR模型中的促新生血管生長(zhǎng)機(jī)制。方法30只C57BL/6J新生小鼠隨機(jī)分為2組。其中15只小鼠置于氧濃度為75%的容器內(nèi)飼養(yǎng)5 d，再轉(zhuǎn)移至正?？諝庀嘛曫B(yǎng)5 d，作為高氧誘導(dǎo)組；另15只小鼠一直在正常空氣中飼養(yǎng)，作為正常對(duì)照組。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)視網(wǎng)膜SDF-1、CD14蛋白的定位及含量，real-time PCR法檢測(cè)視網(wǎng)膜SDF-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，高氧誘導(dǎo)組突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目明顯增多(P<0.01)，血管分支減少，大血管擴(kuò)張、迂曲。兩組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮均可見(jiàn)SDF-1和CD14陽(yáng)性染色，但高氧誘導(dǎo)組的SDF-1和CD14含量明顯高于正常對(duì)照組(均P<0.01)。并且視網(wǎng)膜SDF-1與CD14的蛋白含量存在正相關(guān)(r=0.898，P<0.01)。視網(wǎng)膜SDF-1 mRNA表達(dá)在高氧誘導(dǎo)組也明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論OIR模型小鼠視網(wǎng)膜SDF-1表達(dá)增高，其促新生血管功能可能與CD14+細(xì)胞有關(guān)。

模型,氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管； 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1； CD14

視網(wǎng)膜新生血管是多種疾病如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity, ROP)、增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferating diabetic retinopathy, PDR)等發(fā)生的共同病理改變，其造成的滲出、出血和增生等一系列變化最終會(huì)導(dǎo)致視力喪失?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)是一類(lèi)具有趨化活性的細(xì)胞因子[1]，在新生血管的生成過(guò)程中起重要作用[2-4]，但具體機(jī)制尚未明了。大量資料顯示循環(huán)中的CD14+細(xì)胞(主要包括內(nèi)皮祖細(xì)胞[5-7]和單核/巨噬細(xì)胞)能促進(jìn)新生血管的生長(zhǎng)[8-11]。由于SDF-1是CD14+細(xì)胞的高效趨化因子[12, 13]，因此我們推測(cè)SDF-1的促新生血管能力是通過(guò)趨化循環(huán)中CD14+細(xì)胞到達(dá)缺血部位而發(fā)揮作用。本研究旨在了解氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管模型(oxygen-induced retinopathy，OIR)中SDF-1的表達(dá)情況，并通過(guò)視網(wǎng)膜SDF-1表達(dá)與CD14含量的相關(guān)研究來(lái)初步探討我們的推測(cè)。

材 料 和 方 法

1實(shí)驗(yàn)分組

由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)為SCXK(滬)2007-0005]7 d C57BL/6J清潔級(jí)新生小鼠共30只，隨機(jī)將其分為2組：正常對(duì)照組(n=15)和高氧誘導(dǎo)組(n=15)。其中正常對(duì)照組小鼠于正常環(huán)境中飼養(yǎng)10 d至17 d。而高氧誘導(dǎo)組小鼠首先生活在密閉玻璃容器內(nèi)(容器內(nèi)氧濃度保持在75%±2%，氣體流量為1.5 L/min)5 d后，轉(zhuǎn)移到正常環(huán)境繼續(xù)生活5 d至17 d。

2設(shè)備和試劑

2.1儀器設(shè)備 氧氣分析儀(CY-12C)購(gòu)自浙江省建德市梅城電化分析儀器廠。顯微鏡(Leica DM1RB)、高速冷凍離心機(jī)(Beckman GS-15R Centrifuge 和Eppendorf Centrifuge 5417R)、紫外線分光光度計(jì) (UV-1601 Shimadau)、熒光定量PCR儀(ABI 7500型)由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

2.2試劑 ADP酶、4%多聚甲醛、Tris-馬來(lái)酸緩沖液(0.05 mol/L和0.2 mol/L，pH 7.2)、硝酸鉛、氯化鎂、硫化銨，均由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院組胚實(shí)驗(yàn)室提供。氧氣(純度≥99.99%)與氮?dú)?純度≥99.8%)，由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院提供。堿石灰、75%乙醇、異丙醇、無(wú)水乙醇、氯仿，購(gòu)自上海五四化學(xué)試劑有限公司。Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen。引物由上海生工合成。兔抗鼠SDF-1及兔抗鼠CD14 Ⅰ抗、羊抗兔Ⅱ抗、DAB均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

3視網(wǎng)膜鋪片的制作及二磷酸腺苷酶(adenosinediphosphatase,ADP)酶染色

每組17 d齡小鼠各取3只(6眼)，行乙醚吸入麻醉，解剖小鼠胸腔，充分暴露心臟，將灌注針頭刺入左心室的同時(shí)用顯微剪刀剪開(kāi)右心房，先用生理鹽水灌注約5分鐘，然后灌注4%多聚甲醛溶液約5 min。再摘除小鼠眼球固定于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃過(guò)夜。之后在小鼠眼球的角膜緣后約1 mm沿角膜緣環(huán)行剪開(kāi)，去除角膜，取出晶狀體，以視乳頭為中心作4-5個(gè)放射狀切開(kāi)，盡可能清除鞏膜、脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜色素上皮層。將視網(wǎng)膜鋪片用Tris-馬來(lái)酸緩沖液(0.05 mol/L，pH7.2)沖洗數(shù)次后，于37 ℃反應(yīng)液(濃度為0.2 mol/L，pH7.2的Tris-馬來(lái)酸緩沖液中加入3 mmol/L硝酸鉛。6 mmol/L氯化鎂、1 g/L ADP)中反應(yīng)15 min。再用Tris-馬來(lái)酸緩沖液(0.05 mol/L，pH7.2)沖洗15 min×5次，然后10%硫化銨顯色反應(yīng)5 min。最后用Tris-馬來(lái)酸緩沖液(0.05 mol/L，pH7.2)沖洗，甘油明膠封片。

4眼球石蠟切片制作

每組17 d齡小鼠各取6只(12眼)，乙醚吸入麻醉，解剖胸腔，充分暴露心臟，將灌注針頭刺入左心室的同時(shí)用顯微剪刀剪開(kāi)右心房，先用生理鹽水灌注約5 min，然后灌注4%多聚甲醛溶液約5 min。摘除小鼠眼球固定于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃過(guò)夜后，進(jìn)行全層石蠟包埋，制作6 μm切片，方向平行于角膜至視乳頭的矢狀位平面，每張切片的眼環(huán)中角膜所占比例均不小于1/5且包括后極部視網(wǎng)膜。每個(gè)眼球制作10張切片，其中2張用于免疫組化染色(分別進(jìn)行SDF-1和CD14免疫組化染色)，8張用于HE染色。

5病理切片觀察和視網(wǎng)膜新生血管計(jì)數(shù)方法

眼球石蠟切片進(jìn)行常規(guī)HE染色和中性樹(shù)膠封片后，2組各隨機(jī)抽取30張制作和染色良好的眼球切片，在Leica DM1RB顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)每張切片突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)，不包括玻璃體腔內(nèi)其它與內(nèi)界膜無(wú)聯(lián)系的新生血管芽，比較2組差異。

6SDF-1、CD14視網(wǎng)膜免疫組織化學(xué)染色及圖像分析

每個(gè)眼球2張石蠟切片，分別行SDF-1和CD14的免疫組化染色。常規(guī)進(jìn)行SDF-1及CD14的免疫組化SABC法染色后，Leica DM1RB顯微鏡200倍下逐一拍攝切片并錄入電腦后，用ImagePro Plus準(zhǔn)確選取切片中視網(wǎng)膜部分(排除眼內(nèi)外其它組織以免測(cè)量誤差)，即AOI(area of interest)，測(cè)定其中積分吸光度值(integrated absorbance，IA)。計(jì)算單位視網(wǎng)膜面積的積分吸光度值，即IA/AOIIA。數(shù)據(jù)錄入SPSS 16.0，采用t檢驗(yàn)比較組間SDF-1(和CD14)的IA/AOIIA值差異，用Spearson法對(duì)SDF-1與CD14的IA/AOIIA值相關(guān)性進(jìn)行分析。

7熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜SDF-1mRNA含量

每組17 d齡小鼠各取6只(12眼)經(jīng)頸脫臼處死后立即取出雙眼眼球，迅速沿鋸齒緣環(huán)行剪除眼前節(jié)，4 ℃生理鹽水中剝離視網(wǎng)膜，以同一小鼠的2個(gè)眼球的視網(wǎng)膜組織作為1個(gè)標(biāo)本，加入1 mL Trizol后組織勻漿。常規(guī)分離抽提RNA，紫外吸收法測(cè)定RNA純度，隨后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

運(yùn)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，SDF-1引物序列如下：上游5’-GCCAACGTCAAGCATCTGAA-3’，下游5’-TGCACACTTGTTGTCTGTTGTTGTTCT-3’。反應(yīng)為40個(gè)循環(huán)(95 ℃30 s;β-actin:60 ℃ 1 min；SDF-1:55 ℃ 30 s;72 ℃ 40 s)。

結(jié)果與計(jì)算：2-△Ct為目的基因的量通過(guò)內(nèi)均一化處理之后相對(duì)于參照基因的值，由機(jī)器自動(dòng)生成。但為了結(jié)果表示的需要，在2-△Ct值的基礎(chǔ)上均擴(kuò)大1×105倍。

8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)輸入SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。用t檢驗(yàn)比較正常組和高氧組之間突破內(nèi)界膜新生血管芽數(shù)目、SDF-1的平均吸光度值(IA/AOIIA)和mRNA表達(dá)量(即2-△Ct×105)、CD14的平均吸光度值之間差異。用Spearson相關(guān)分析法分析2組眼球切片SDF-1與CD14平均吸光度值的相關(guān)性。

結(jié) 果

1OIR模型的建立情況

1.1HE染色 隨機(jī)抽取正常對(duì)照組和高氧誘導(dǎo)組各30張眼球HE染色切片于顯微鏡下觀察。正常對(duì)照組見(jiàn)圖1A，其神經(jīng)纖維層較薄，外叢狀層無(wú)血管，未見(jiàn)突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞 ；而高氧誘導(dǎo)組見(jiàn)圖1B，其神經(jīng)纖維層與內(nèi)界膜附近有大量的新生血管，并且血管內(nèi)皮細(xì)胞突破內(nèi)界膜，在視網(wǎng)膜前形成新生血管，圖片中黑色箭頭為突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞，白色箭頭為新生血管管腔。光鏡下正常對(duì)照組突破內(nèi)界膜的新生血管芽為0個(gè)，高氧誘導(dǎo)組685個(gè)。正常對(duì)照組突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)與高氧誘導(dǎo)組比較都有顯著差異(P<0.01),表明OIR模型成功。

Figure 1. HE-stained sections of retina (×200). A:control group ; B:oxygen-induced group. Black arrows：the endotheliocyte nuclei of new vessels from retinal inner limiting membrane into the vitreous. White arrow: retinal neovascularization.

圖1視網(wǎng)膜HE染色圖

1.2視網(wǎng)膜鋪片 正常對(duì)照組和高氧誘導(dǎo)組小鼠的視網(wǎng)膜鋪片經(jīng)過(guò)ADP酶染色后，置于光鏡下觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)，可見(jiàn)正常對(duì)照組視網(wǎng)膜血管發(fā)育完全成熟，自視盤(pán)向外周呈放射狀均勻分布，未見(jiàn)血管閉塞,見(jiàn)圖2A；高氧誘導(dǎo)組小鼠后極部視網(wǎng)膜見(jiàn)大片無(wú)灌注區(qū)，血管分支減少，大血管擴(kuò)張、迂曲，中周部大量新生血管形成，見(jiàn)圖2B,也表明OIR模型成功。

2視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮SDF-1、CD14定位及半定量圖像分析

SDF-1免疫組化染色見(jiàn)2組視網(wǎng)膜切片均有棕黃色顆粒形成，主要分布于內(nèi)層視網(wǎng)膜(以?xún)?nèi)顆粒層及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層最為明顯)，部分血管周?chē)?xì)胞也可見(jiàn)明顯陽(yáng)性染色。CD14免疫組化染色表現(xiàn)同SDF-1。但需要注意的是CD14與SDF-1的陽(yáng)性染色顆粒在視網(wǎng)膜上分布的層次相同。另外高氧誘導(dǎo)組SDF-1、CD14免疫組化染色的棕黃色顆粒較正常對(duì)照組顏色更深，分布范圍更大，見(jiàn)圖3。

通過(guò)半定量圖像分析，正常對(duì)照組SDF-1的IA/AOIIA為0.0451±0.0109；高氧誘導(dǎo)組SDF-1的IA/AOIIA為0.0779±0.0145。正常組與高氧組之間比較，差異顯著(P<0.01)，見(jiàn)圖4A。正常對(duì)照組CD14的IA/AOIIA為0.0454±0.0085；高氧誘導(dǎo)組CD14的IA/AOIIA為0.1021±0.0106。正常組和高氧組之間比較，差異顯著(P<0.01)，見(jiàn)圖4B。用Spearson相關(guān)分析法，SDF-1與CD14蛋白的IA/AOI值呈正相關(guān)(r=0.898，P<0.01)，見(jiàn)圖4C。

Figure 2. ADPase-stained sections of retina(×100). A:control group ; B:oxygen-induced group.

圖2視網(wǎng)膜鋪片圖

Figure 3. Immunohistochemistry detection of SDF-1 and CD14(×200). A: SDF-1 staining of control group; B: SDF-1 staining of oxygen-induced group; C: CD14 staining of control group; D: CD14 staining of oxygen-induced group. GCL：ganglion cell layer; IPL: inner plexiform layer; INL： inner nuclear layer.

圖3SDF-1、CD14免疫組化染色圖

3視網(wǎng)膜SDF-1mRNA的相對(duì)含量

將各個(gè)樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。高氧誘導(dǎo)組2-△Ct×105值為22.545±5.630；正常組為10.021±3.150，2組間差異顯著(P<0.01)，見(jiàn)圖4D。

討 論

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了OIR模型視網(wǎng)膜中SDF-1的表達(dá)增加。在SDF-1 mRNA水平，我們利用熒光實(shí)時(shí)定量的方法發(fā)現(xiàn)OIR模型小鼠視網(wǎng)膜中mRNA含量較正常小鼠增加。在SDF-1蛋白表達(dá)水平，我們利用免疫組化的方法，證實(shí)OIR模型視網(wǎng)膜SDF-1的表達(dá)以?xún)?nèi)層為主；且高氧滲導(dǎo)組SDF-1較正常對(duì)照組顏色更深、范圍更廣；同時(shí)結(jié)合數(shù)字圖像分析系統(tǒng)，用單位視網(wǎng)膜面積內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)累積吸光度作比較，進(jìn)行了半定量分析，我們可以證實(shí)該蛋白在OIR模型中視網(wǎng)膜組織表達(dá)明顯增加。

Figure 4. Graphs of the content and correlation of SDF-1 and CD14. A：scatter plot of SDF-1IA/AOIIA; B: scatter plot of CD14IA/AOIIA; C：scatter plot of collection between SDF-1 and CD14;D: scatter plot of SDF-1 mRNA expression.

圖4SDF-1與CD14的含量及其相關(guān)圖

近年SDF-1(CXCRL12)/CXCR4軸參與體內(nèi)新生血管生成的作用逐漸受到重視。Butler等[14]在缺血缺氧視網(wǎng)膜動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物玻璃體內(nèi)注射SDF-1中和抗體后，即使有外源性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的存在，也無(wú)視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生。此外，體外視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果還提示它可上調(diào)黏附分子(VCAM-1)的表達(dá)，而下調(diào)密封蛋白(occluding)的表達(dá)[14]。VCAM-1可促進(jìn)CD14+細(xì)胞的附壁、游走，occludin減少可加重血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的損傷，這些都是促進(jìn)新生血管的重要因素。既往的研究通過(guò)細(xì)胞離體培養(yǎng)或者測(cè)定增生性視網(wǎng)膜病變患者玻璃體、血清中SDF-1濃度等方法來(lái)間接提示SDF-1在視網(wǎng)膜新生血管中作用[15, 16]，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中直接觀察到OIR模型中視網(wǎng)膜內(nèi)層SDF-1的表達(dá)明顯增加，無(wú)疑進(jìn)一步提示該因子在視網(wǎng)膜新生血管發(fā)展中的地位，但SDF-1是通過(guò)何種具體機(jī)制而促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管的生長(zhǎng)？這還需要更多工作。

結(jié)合大量研究資料[10,11，17, 18]，我們推測(cè)SDF-1的促新生血管能力是通過(guò)趨化循環(huán)中CD14+細(xì)胞(如內(nèi)皮祖細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞)到達(dá)缺血部位而發(fā)揮作用。假如該推測(cè)正確，那么在SDF-1高表達(dá)部位應(yīng)該有更多CD14+細(xì)胞的聚集。我們前面的研究已發(fā)現(xiàn)，OIR模型中視網(wǎng)膜SDF-1表達(dá)較正常視網(wǎng)膜明顯增加，那么CD14+細(xì)胞聚集是否也隨之增多？

我們的研究采用視網(wǎng)膜CD14免疫組化染色來(lái)反應(yīng)CD14+細(xì)胞聚集程度，初步探討其與SDF-1之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)無(wú)論是在正常對(duì)照組，還是高氧誘導(dǎo)組視網(wǎng)膜中均有SDF-1和CD14的陽(yáng)性染色，并且值得注意的是這2種蛋白的陽(yáng)性染色在視網(wǎng)膜分布層次相同;(2)視網(wǎng)膜CD14與SDF-1的IA/AOIIA值存在正相關(guān)。假如我們的推測(cè)成立，那么受趨化的CD14+細(xì)胞所在位置應(yīng)該與SDF-1表達(dá)部位相一致，并且SDF-1表達(dá)越高聚集的CD14+細(xì)胞越多。而上面兩個(gè)結(jié)果都很好地吻合我們的推測(cè)。但是根據(jù)這些研究就判定我們前面的推測(cè)成立證據(jù)尚嫌不足，初步研究結(jié)果僅僅提示了這種存在的可能性。SDF-1與CD14+細(xì)胞的確切聯(lián)系還需要進(jìn)一步的研究。

我們利用免疫組化的半定量和熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)從兩方面證實(shí)，OIR模型中視網(wǎng)膜SDF-1的表達(dá)水平較正常老鼠明顯增加。對(duì)于其調(diào)控、應(yīng)答機(jī)制的進(jìn)一步研究，及其視網(wǎng)膜玻璃體濃度對(duì)比的動(dòng)態(tài)變化研究，都有助于闡明視網(wǎng)膜新生血管性疾病的發(fā)病機(jī)制。

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Expressionofstromalcell-derivedfactor1inretinaswithoxygen-inducedretinalneovascularization

YUAN Fei, CHEN Xiang-wu

(DepartmentofOphthalmology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China.E-mail:yuanfei07@yahoo.cn)

AIM: To observe the expression of stromal cell-derived factor 1(SDF-1) in oxygen-induced retinopathy (OIR) model.METHODSThirty C57BL/6J newborn mice were randomly divided into 2 groups: 15 mice in oxygen-induced group were exposed to 75% oxygen for 5 days and to room air for another 5 days to establish the model of OIR, and the other 15 mice were kept in room air as control group. The mRNA expression of SDF-1 was determined by real-time RT-PCR. Retinal proteins of SDF-1 and CD14 were determined by immunohistochemistry.RESULTSThe numbers of the endotheliocyte nuclei in new vessels extending from retina to vitrous were lower in control group than that in oxygen-induced group (P<0.01). Positive immunohistochemical staining for SDF-1 and CD14 was found in both group, and significant differences of SDF-1 and CD14 between oxygen-induced group and control group (bothP<0.01) were observed. A strong correlation of retinal content of CD14 with the expression of SDF-1 was found (r=0.898,P<0.01). The difference of SDF-1 mRNA expression between oxygen-induced group and control group (P<0.01) was significant.CONCLUSIONThe expression of SDF-1 is increased in the retinas of OIR mice. Involvement of CD14+cells is a possible mechanism of SDF-1 in promoting neovascularization.

Models, oxygen-induced retinal neovascularization; Stromal cell-derived factor 1; CD14

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.027

1000-4718(2011)01-0139-06

2010-09-19

2010-11-11

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃資助項(xiàng)目 (No.074119510)

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