劉坤平， 鐘雪云， 羅 楓， 趙 彤

(1 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院病理科， 廣東 廣州 510515； 2 暨南大學醫(yī)學院附屬清遠醫(yī)院病理科， 廣東 清遠 511500；3 暨南大學醫(yī)學院病理學教研室， 廣東 廣州 510632)

GSK-3β抑制劑對結(jié)腸癌SW480細胞增殖和凋亡的影響*

劉坤平1，2， 鐘雪云3， 羅 楓2， 趙 彤1△

(1南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院病理科， 廣東 廣州 510515；2暨南大學醫(yī)學院附屬清遠醫(yī)院病理科， 廣東 清遠 511500；3暨南大學醫(yī)學院病理學教研室， 廣東 廣州 510632)

目的探討糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)抑制劑(2’Z,3’E)-6-溴靛’-3’-肟(BIO)對結(jié)腸癌SW480細胞β-catenin 、Bcl-2蛋白表達及細胞周期、凋亡的影響。方法應(yīng)用不同濃度BIO作用于結(jié)腸癌SW480細胞，采用流式細胞術(shù)檢測細胞周期及凋亡，Western blotting檢測β-catenin 和Bcl-2蛋白表達，免疫細胞化學檢測β-catenin 及cyclin D1的表達，HE染色觀察細胞形態(tài)。結(jié)果與BIO處理前SW480細胞相比，BIO處理組SW480細胞β-catenin蛋白表達明顯上調(diào)并出現(xiàn)部分細胞核移位，cyclin D1蛋白表達及S期和G2/M期細胞不同程度增多，Bcl-2蛋白表達有所下調(diào)，細胞凋亡率明顯下降，并出現(xiàn)細胞形態(tài)改變。結(jié)論GSK-3β抑制劑BIO作用于結(jié)腸癌SW480細胞呈現(xiàn)促增殖及抑凋亡作用，其機制主要與β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活以及與Bcl-2調(diào)控通路的平衡有關(guān)，其中β-catenin上調(diào)可能是影響結(jié)腸癌SW480細胞轉(zhuǎn)歸的主要因素。

結(jié)直腸腫瘤； 糖原合酶激酶3β； β-catenin； Bcl-2； 細胞增殖； 細胞凋亡

糖原合成酶激酶-3β ( glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β )是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶, 參與細胞內(nèi)糖代謝、細胞增殖、分化和凋亡等多種重要生理過程。研究表明，GSK-3β是細胞內(nèi)Wnt/β-鏈接素(β-catenin)、核因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB)等眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要調(diào)控酶, 通過對下游核轉(zhuǎn)錄因子的影響參與細胞增殖與凋亡的調(diào)控，已成為腫瘤治療所關(guān)注的藥物靶點，但調(diào)節(jié)GSK-3β對腫瘤細胞增殖、凋亡影響的實驗結(jié)果不一，GSK-3β對腫瘤細胞生長起促進還是抑制作用目前仍存有爭議[1, 2]。為此，本實驗應(yīng)用GSK-3β抑制劑(2’Z,3’E)-6-溴靛’-3’-肟[(2’Z,3’E)-6-bromoindirubin-3’-oxime,BIO]作用于結(jié)腸癌SW480細胞，比較BIO作用前后結(jié)腸癌細胞β-catenin、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/ leukemia-2，Bcl-2)及細胞周期素D1(cyclin D1)蛋白表達變化與細胞周期及凋亡變化的關(guān)系，觀測GSK-3β抑制劑對SW480細胞增殖、凋亡的影響，探討調(diào)控機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細胞及主要試劑 人結(jié)腸癌細胞株SW480由南方醫(yī)科大學病理系實驗室提供。BIO及二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自Sigma。細胞培養(yǎng)基RPMI-1640購自Gibco。標準胎牛血清購自天津TBD生物技術(shù)發(fā)展中心，Western blotting檢測所用鼠抗人β-catenin、Bcl-2抗體購自Santa Cruz，兔抗人α-tubulin抗體購自Bioworld。辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠及羊抗兔IgG購自Proteintech Group。細胞裂解液及蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。增強型化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)液購自Pierce。免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術(shù)公司。碘化乙啶(propidium iodide，PI)周期檢測試劑盒及FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒均購自BD Pharmingen。

1.2主要儀器 CO2培養(yǎng)箱購于Shellab，低溫高速離心機購于Eppendorf，超凈工作臺購于蘇州凈化設(shè)備廠，全波長多功能酶標儀購于Tecan，普通光學顯微鏡購于Leica，F(xiàn)ACS Aria流式細胞儀由BD Bioscience生產(chǎn)。

2方法

2.1流式細胞儀檢測細胞周期 對數(shù)生長期細胞經(jīng)0.25%的胰酶消化后，以2×108cells/L的密度接種于6孔板中，2 d后加入由DMSO溶解的不同濃度的BIO(0、1、2、4 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細胞，PBS離心重懸2次，70%預(yù)冷乙醇4 ℃固定30 min，PBS洗1次，加入含PI的染色液(按說明書操作)，避光孵育15 min經(jīng)尼龍膜濾過后，上流式細胞儀檢測。實驗重復(fù)3次。

2.2流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞加入不同濃度BIO(0、1、2、4 μmol/L)培養(yǎng)24 h，經(jīng)0.25%不含EDTA的胰酶消化，收集各組細胞，PBS離心重懸1次，用Annexin V-FITC/PI雙染法上流式細胞儀檢測細胞凋亡，具體操作嚴格按試劑盒說明書進行，凋亡細胞為Annexin V高染(Annexin V+)。實驗重復(fù)3次。

2.3Western blotting檢測β-catenin和Bcl-2蛋白表達 細胞加入不同濃度BIO(0、1、2、4 μmol/L)培養(yǎng)24 h ，按蛋白提取試劑盒操作步驟提取細胞總蛋白并測定蛋白濃度，每泳道加20 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加鼠抗β-catenin(1∶100)、鼠抗Bcl-2 (1∶200)、內(nèi)參照兔抗α-tubulin(1∶1 000)抗體，4 ℃搖床孵育過夜，TBS-T洗膜10 min×3次，加入相應(yīng)辣根過氧化物酶標記羊抗鼠及羊抗兔IgG(1∶4 000)室溫搖床孵育1 h，TBS-T洗膜10 min×3次后，ECL化學發(fā)光系統(tǒng)顯色。掃描膠片，Quantity One軟件分析灰度值，計算相對蛋白含量。實驗重復(fù)3次。

2.4細胞塊制備及HE染色、免疫細胞化學染色 細胞加入BIO(4 μmol/L)，對照組(0 μmol/L)加入等量DMSO，培養(yǎng)24 h 后收集細胞，離心棄上清，加入0.1%蛋清液混合，離心棄上清加入10%甲醛固定24 h后用濾紙包裹放入脫水盒按常規(guī)石蠟包埋制備蠟塊，4 μm連續(xù)切片，一張做HE染色，其余備做免疫細胞化學。應(yīng)用免疫細胞化學SP法染色，Ⅰ抗β-catenin及cyclin D1均為鼠單克隆抗體，購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。用已知大腸癌陽性組織切片作陽性對照，PBS 代替各Ⅰ抗作陰性對照，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染。Cyclin D1以細胞核出現(xiàn)棕黃色細顆粒為陽性，200倍鏡下隨機選擇5個視野，至少計數(shù)1 000個細胞，計算陽性表達率，細胞陽性表達率(%)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1不同濃度BIO對SW480細胞周期的影響

不同濃度BIO(0、1、2、4 μmol/L)作用24 h后，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果顯示，與對照組(BIO 0 μmol/L)細胞比較，BIO處理組G0/G1期細胞不同程度減少，S期和G2/M期細胞不同程度增多，見表1。

表1不同濃度BIO對SW480細胞周期分布的影響

ConcentrationofBIO(μmol/L)Cellcycledistribution(%)G0/G1SG2/M044.70±4.1643.33±1.3811.97±4.13136.70±2.99*52.90±7.4010.40±4.34235.93±2.0452.03±1.65*12.04±1.67441.13±3.5245.77±2.0313.10±3.26

*P<0.05vs0 μmol/L.

2不同濃度BIO對SW480細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞儀檢測SW480細胞凋亡結(jié)果顯示，隨著BIO濃度增加(0、1、2、4 μmol/L)，SW480細胞凋亡率(Annexin V+)逐漸降低，見圖1，各組細胞凋亡率分別為(4.40±0.36)%、(2.67±0.47)%、(2.07±1.00)%、(1.47±0.49)%。

3不同濃度BIO對SW480細胞β-catenin、Bcl-2蛋白表達的影響

Western blotting結(jié)果顯示不同濃度BIO處理SW480細胞后，細胞中β-catenin蛋白表達量逐漸增加，Bcl-2蛋白表達有所下調(diào)，見圖2。

圖1流式細胞術(shù)分析不同濃度BIO對SW480細胞凋亡的影響

圖2Westernblotting檢測不同濃度BIO作用SW480細胞β-catenin、Bcl-2蛋白表達

4BIO對SW480細胞形態(tài)、β-catenin核移位及cyclinD1表達的影響

HE染色結(jié)果顯示，相比BIO處理前(圖3A1)，BIO處理組(圖3B1)細胞大小形態(tài)不一、瘤巨細胞數(shù)量增多、細胞核染色質(zhì)增粗、核仁明顯、核分裂數(shù)增多。免疫細胞化學結(jié)果顯示，BIO處理前(圖3A2)β-catenin蛋白表達主要定位于細胞膜、細胞質(zhì)，BIO處理組(圖3B2)β-catenin蛋白在細胞膜、細胞質(zhì)表達明顯增強并可見部分細胞核強表達；cyclin D1蛋白表達定位于細胞核，BIO處理組(圖3B3)陽性表達率(7.15%)較對照組(圖3A3) (6.86%)高，但未見顯著差異(P>0.05)。

Figure 3. The morphological features (HE staining，×400) and β-catenin and cyclin D1 expression (immunohistochemical staining，×400)in SW480 cells before and after exposure to BIO.A1-A3: the morphological features and β-catenin and cyclin D1 expression in SW480 cells 24 h after DMSO exposure; B1-B3: the morphological features and β-catenin and cyclin D1 expression in SW480 cells 24 h after BIO(4 μmol/L, diluent DMSO)exposure.

圖3BIO作用前后SW480細胞形態(tài)及β-catenin、cyclinD1蛋白表達

討 論

結(jié)直腸癌是我國常見惡性腫瘤并呈上升趨勢[3]，但治療效果并未因多年的努力而得到明顯改善，尋找新的腫瘤治療靶點已是近年關(guān)注的熱點。GSK-3β作為細胞內(nèi)眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要調(diào)控酶，已在不同的腫瘤細胞株如結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌中發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)GSK-3β活性可影響腫瘤細胞的生長及凋亡[4-7]，但抑制GSK-3β活性對腫瘤細胞生長影響的實驗結(jié)果不一，Gould等[4]在實驗性鼠腸腫瘤及Farago等[5]在乳腺上皮抑制GSK-3β的活性不同程度呈現(xiàn)促腫瘤生長作用，Li等[6]在人肺腺癌細胞通過抑制GSK-3β活性細胞凋亡受抑制，S期細胞數(shù)量增多，而Shakoori等[7]則觀察到通過化學抑制劑及RNA干擾抑制結(jié)腸癌細胞GSK-3β活性，減弱了癌細胞的生長、誘導(dǎo)了細胞凋亡，出現(xiàn)了不同的實驗結(jié)果，提示抑制GSK-3β活性對腫瘤細胞增殖、凋亡的影響及其機制尚不明確。 本實驗顯示不同濃度的GSK-3β抑制劑BIO作用于結(jié)腸癌SW480細胞后，細胞凋亡率隨著BIO濃度增加由4.40%減少到1.47%，S、M期細胞數(shù)量和cyclin D1表達不同程度增多并出現(xiàn)細胞核染色質(zhì)增粗、核仁明顯、核分裂數(shù)增多等高增殖狀態(tài)的細胞形態(tài)學變化，提示本細胞模型下抑制GSK-3β活性對腫瘤生長起促進作用。

GSK-3β抑制劑BIO是一種小分子ATP競爭性抑制劑，通過與ATP競爭以及影響GSK-3β調(diào)節(jié)因子磷酸化進一步抑制GSK-3β的活性[1, 8]。目前的研究顯示GSK-3β抑制劑對腫瘤細胞產(chǎn)生不同的影響，其原因可能與GSK-3β下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在不同細胞株作用機制不同有關(guān)， 已有文獻報道不同癌細胞NF-κB與β-catenin/TCF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用機制不同[9]，推測GSK-3β作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要調(diào)控酶在不同的細胞可能產(chǎn)生不同的影響。

β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用[10-12]，高表達β-catenin可通過TCF4等下游核轉(zhuǎn)錄因子促進細胞增殖與凋亡抑制。GSK-3β作為細胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要調(diào)控酶，滕穎等[13]在體外實驗用不同濃度的GSK-3β抑制劑LiCl作用肺癌細胞導(dǎo)致β-catenin表達增加并出現(xiàn)核移位,同時增殖能力與克隆形成能力增強 ，本實驗應(yīng)用不同濃度的GSK-3β抑制劑BIO明顯上調(diào)了SW480細胞β-catenin蛋白含量并出現(xiàn)部分細胞β-catenin核移位，與滕穎等應(yīng)用LiCl對β-catenin的影響結(jié)果一致，提示不同種類的GSK-3β抑制劑均可上調(diào)β-catenin并影響細胞的增殖及凋亡。Cyclin D1 是Wnt/β-catenin通路重要靶基因之一[10]，其啟動區(qū)被β-catenin/TCF激活并轉(zhuǎn)錄，本實驗GSK-3β抑制劑BIO作用后cyclin D1陽性表達僅輕度增高，與β-catenin上調(diào)幅度不同步，此現(xiàn)象提示cyclin D1表達不僅受Wnt/β-catenin通路的調(diào)控，而且還受GSK-3β調(diào)控的其它下游通路的影響，Ougolkov等[14]在實驗中觀察到GSK-3β抑制劑降低胰腺癌細胞cyclin D1蛋白表達與NF-κB活性改變有關(guān)。

Bcl-2是NF-κB下游因子，作為凋亡抑制因子在細胞凋亡調(diào)控機制中起重要作用，實驗表明GSK-3β作為細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要調(diào)控酶影響B(tài)cl-2的表達，Ougolkov等[14，15]及Bilim等[16]分別在胰腺癌、慢性淋巴細胞白血病及腎癌細胞發(fā)現(xiàn)小分子GSK-3β抑制劑或RNA干擾抑制GSK-3β活性對腫瘤細胞有抑增殖或促凋亡作用，其機制可能與Bcl-2 表達下調(diào)有關(guān)。Thotala等[17]在GSK-3β抑制劑對正常腸黏膜防輻射作用的實驗中檢測到GSK-3β抑制劑導(dǎo)致腸黏膜組織Bcl-2表達上調(diào)及凋亡受抑，本實驗發(fā)現(xiàn)隨GSK-3β抑制劑劑量增大，結(jié)腸癌SW480細胞Bcl-2的含量呈下降趨勢，提示GSK-3β抑制劑對腸癌細胞、正常腸黏膜細胞Bcl-2表達的影響不同。本實驗GSK-3β抑制劑BIO作用于結(jié)腸癌SW480細胞雖然出現(xiàn)凋亡抑制因子Bcl-2表達下調(diào)，但仍然呈現(xiàn)凋亡抑制的現(xiàn)象，提示此細胞模型下Bcl-2對凋亡的調(diào)控未占主導(dǎo)作用，其凋亡受抑有更有效的途徑調(diào)控。

本實驗結(jié)果顯示β-catenin與Bcl-2參與了GSK-3β抑制劑BIO對結(jié)腸癌SW480細胞的促腫瘤生長作用，其機制與β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活以及與Bcl-2調(diào)控通路的平衡有關(guān)，其中β-catenin上調(diào)起到關(guān)鍵作用，提示GSK-3β抑制劑對腫瘤細胞生長的影響取決于促進和抑制通路的激活、平衡與自我穩(wěn)定，在不同的細胞可能出現(xiàn)不同的轉(zhuǎn)歸。此外，GSK-3β抑制劑BIO明顯上調(diào)結(jié)腸癌SW480細胞β-catenin表達、降低凋亡水平的現(xiàn)象，提示在眾多結(jié)直腸癌實體腫瘤組織出現(xiàn)的β-catenin高表達狀態(tài)[10,18]可能與腫瘤細胞凋亡抑制密切相關(guān)，并且可能是結(jié)直腸癌腫瘤組織多藥耐藥的原因之一。

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EffectsofGSK-3βinhibitoronproliferationandapoptosisofSW480cells

LIU Kun-ping1,2, ZHONG Xue-yun3, LUO Feng2, ZHAO Tong1

(1DepartmentofPathology,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2DepartmentofPathology,QingyuanHospital,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Qingyuan511500,China;3DepartmentofPathology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tongzhao@fimmu.com)

AIM: To investigate the mechanism and the effect of glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) inhibitor (2’Z,3’E)-6-bromoindirubin-3’-oxime (BIO) on the protein expression of β-catenin and Bcl-2, and proliferation and apoptosis in colon carcinoma SW480 cells.METHODSThe immunohistochemical staining and Western blotting were performed to detect the protein expression of β-catenin, cyclin D1 and Bcl-2. The cell cycle distribution and apoptotic rate were detected by flow cytometry. The morphologic features of SW480 cells before and 24 h after BIO exposure at different concentrations were observed under microscope with HE staining.RESULTSCompared with the untreated SW480 cells, the protein expression of β-catenin significantly increased and some β-catenin positive nuclear staining positive cells appeared in BIO treated cells. and The cells exposed to BIO showed that the cyclin D1 protein and the cells in S stage and G2/M stage moderately increased, the protein level of Bcl-2 moderately decreased, and the cell apoptosis rate was significantly lower than those in control cells. Furthermore, the morphological changes of the SW480 cells were observed 24 h after BIO treatment.CONCLUSIONOur results indicate that GSK-3β inhibitor BIO participates in the cellular processes of promoting proliferation and inhibiting apoptosis in colon carcinoma cells. The mechanisms are mainly associated with activating the β-catenin pathway and regulating the balance of Bcl-2 pathway, and the up-regulation of β-catenin is most likely the possible factor for SW480 cell regression.

Colorectal neoplasms; Glycogen synthase kimase 3β; β-catenin; Bcl-2; Cell proliferation; Apoptosis

R735.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.019

1000-4718(2011)01-0097-05

2010-06-10

2010-11-10

廣東省科技計劃資助項目(No.2009B080800023)

△通訊作者 Tel: 020-61648228； E-mail: tongzhao@fimmu.com