李玉娟， 柳垂亮， 張 靜， 陳偉強(qiáng)， 曾敏婷

(1中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院麻醉科， 2廣東省中醫(yī)院麻醉科， 廣東 廣州 510120)

異氟醚和七氟醚對新生大鼠皮質(zhì)凋亡以及JNK和p38表達(dá)的不同影響*

李玉娟1△， 柳垂亮2， 張 靜1， 陳偉強(qiáng)1， 曾敏婷1

(1中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院麻醉科，2廣東省中醫(yī)院麻醉科， 廣東 廣州 510120)

目的研究同等劑量的異氟醚和七氟醚對新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的影響以及對JNK和p38蛋白表達(dá)的不同影響。方法55只出生后7 d(P7)的新生大鼠(共5窩，每窩取11只)，隨機(jī)均分為異氟醚組(Ⅰ組)、七氟醚組(S組)和對照組(C組)，各組分別吸入1.1%異氟醚、1.8%七氟醚和空氣4 h。在麻醉結(jié)束后2 h每窩每組各取1只幼鼠灌注取腦，免疫組織化學(xué)法檢測皮質(zhì)壓部后區(qū)caspase-3表達(dá)(n=5)；另外，每窩C組在麻醉處理0 h，Ⅰ組和S組分別在麻醉2 h、4 h取新鮮腦皮質(zhì)，Western blotting檢測磷酸化SAPK/JNK、磷酸化p38，以及SAPK/JNK、p38表達(dá)的變化(n=5)。結(jié)果Ⅰ組和S組caspase-3表達(dá)分別較對照組增加441%(P<0.01)和151%(P<0.01)，Ⅰ組比S組增加115%(P<0.05)；Ⅰ組磷酸化SAPK/JNK表達(dá)在麻醉2 h和4 h較對照組分別增加219%(P<0.05)和181%(P<0.05)，S組在2 h和4 h均與對照組無顯著差異；Ⅰ組磷酸化p38表達(dá)在麻醉2 h和4 h較對照組分別增加38.9%(P<0.05)和36.9%(P<0.05)，S組在2 h和4 h較對照組分別增加32.6%(P<0.05)和128.0%(P<0.01)。結(jié)論0.5最低肺泡有效濃度(MAC)異氟醚比七氟醚誘導(dǎo)更多新生大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡，異氟醚誘導(dǎo)凋亡可能與激活SAPK/JNK磷酸化有關(guān)，而七氟醚誘導(dǎo)凋亡可能與激活p38磷酸化有關(guān)。

異氟醚； 七氟醚； 腦； 有絲分裂素激活蛋白激酶類

異氟醚和七氟醚均屬于吸入麻醉藥，常用于臨床手術(shù)麻醉。它們對心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[1]，但近年來國內(nèi)外有多篇文章報道異氟醚能誘導(dǎo)突觸發(fā)育高峰期的動物腦神經(jīng)元凋亡增加，以及成年期認(rèn)知功能改變[2-7]，引起對麻醉藥物神經(jīng)毒性作用的關(guān)注。我們前期體外實驗研究發(fā)現(xiàn)七氟醚比異氟醚對神經(jīng)元的毒性更小[8]，因此假設(shè)七氟醚對新生幼鼠的神經(jīng)毒性也比異氟醚低。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)信號通路在細(xì)胞生長分化以及細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中起著重要作用，MAPKs主要包括EKR1/2(extracellular signal-regulated kinase,)、SAPK/JNK(stress-activated protein kinases/c-Jun NH2-terminal kinases)和p38 MAPK 3個主要的亞家族。正常情況下，ERK、JNK和p38可促分化，而在應(yīng)激狀態(tài)下，ERK起抗凋亡作用，JNK和p38則起促凋亡作用。缺血、缺氧、炎癥反應(yīng)等各種刺激均可引起MAPKs的磷酸化狀態(tài)改變。許多研究證實JNK和p38通路激活在腦、心臟等的缺血再灌注的病理損傷起著重要作用[9，10]。

異氟醚和七氟醚如果對新生大鼠神經(jīng)毒性存在差異，這種差異是否與JNK和p38的通路的不同激活有關(guān)？本研究擬采用給新生大鼠吸入1.1%異氟醚或1.8%七氟醚[相當(dāng)于0.5最低肺泡有效濃度(minimum alveolar concentration,MAC)]4 h的實驗?zāi)Ｐ停ㄟ^對鼠腦皮質(zhì)凋亡和磷酸化SAPK/JNK、p38蛋白表達(dá)變化的檢測來研究異氟醚和七氟醚對P7新生大鼠腦發(fā)育影響的差異，并初步探討其機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1儀器與試劑 Detax麻醉氣體檢測儀(歐米達(dá)公司)，Olympus IX70 倒置顯微鏡 (奧林巴斯公司)，血糖儀(拜爾公司)，i-STAT血氣分析儀(雅培有限公司)；異氟醚(雅培有限公司)，七氟醚(百特醫(yī)療用品有限公司)。兔抗大鼠磷酸化SAPK/JNK多克隆抗體、兔抗大鼠SAPK/JNK多克隆抗體(Cell Signaling)；小鼠抗大鼠磷酸化p38單克隆抗體、小鼠抗大鼠磷酸化p38單克隆抗體、β-actin單克隆抗體(碧云天生物技術(shù)公司)。羊抗兔Ⅱ抗、羊抗小鼠Ⅱ抗(武漢博士德公司)。

1.2動物及分組 55只出生后7 d(P7)的新生大鼠(總共5窩，每窩取11只，由廣東省動物中心提供)，隨機(jī)分為異氟醚組(Ⅰ組)、七氟醚組(S組)和對照組(C組)。在麻醉4 h時每窩每組各取1只幼鼠經(jīng)心臟穿刺抽血，檢測血糖和血氣(n=5)。麻醉結(jié)束后2 h每窩每組各取1只進(jìn)心臟灌注，取腦組織制作石蠟切片，免疫組織化學(xué)法檢測皮質(zhì)caspase-3表達(dá)(n=5)；另外，每窩C組在麻醉0 h、Ⅰ組和S組分別在麻醉2 h和4 h取新鮮腦皮質(zhì)，Western blotting檢測磷酸化SAPK/JNK和磷酸化p38，以及SAPK/JNK和p38表達(dá)的變化(n=5)。

2方法

2.1麻醉處理 將新生大鼠放置于密閉麻醉箱中，該麻醉箱放置于預(yù)設(shè)溫度為35 ℃的水浴箱中。麻醉箱與麻醉機(jī)相連，Ⅰ組使用1.1%異氟醚處理4 h，S組使用1.8%七氟醚處理4 h，麻醉氣體通過麻醉機(jī)的揮發(fā)罐由壓縮空氣輸送通過該麻醉箱。幼鼠呼氣末麻醉氣體的濃度、氧氣和二氧化碳濃度由連接于麻醉箱的麻醉氣體監(jiān)測儀監(jiān)測。C組暴露于空氣中4 h。

2.2生理指標(biāo)監(jiān)測 在麻醉過程中每隔30 min監(jiān)測幼鼠膚色，記錄呼吸頻率，在麻醉4 h時每窩每組各取1只幼鼠經(jīng)左心室心臟穿刺抽血行血氣分析和血糖檢測(n=5)。

2.3組織準(zhǔn)備 每窩C組在麻醉處理0 h、Ⅰ組和S組分別在麻醉2 h和4 h取1只幼鼠，斷頭取腦，冰上分離腦皮質(zhì)，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存，組織用來做Western blotting分析。在麻醉結(jié)束后2 h每窩每組各取1只幼鼠，經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛固定液15 min后取腦。腦組織在同樣的灌注液中4 ℃后固定48 h后梯度脫水，石蠟包埋，經(jīng)冠狀平面切取5 μm連續(xù)石蠟切片，參照幼鼠腦解剖圖譜，每只幼鼠選擇3個相同的海馬平面的切片進(jìn)行免疫組化染色。

2.4免疫組化法檢測細(xì)胞凋亡 組織切片通過梯度乙醇脫蠟、水化、抗原修復(fù)，3% H2O2室溫孵育5 min以去除內(nèi)源性過氧化物酶活性。10%正常羊血清封閉液室溫封閉1 h，1∶100 caspase-3抗體4 ℃孵育過夜，羊抗兔Ⅱ抗(1∶200，武漢博士德公司)室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素反染。使用IP lab 7.0和 Olympus IX70 倒置顯微鏡獲得大腦皮質(zhì)壓部后區(qū)(retrosplonial cortex,RS)200倍圖像，2個人分別計數(shù)caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)，并計算單位面積的陽性細(xì)胞數(shù)的均值。

2.5Western blotting法檢測MAPK通路 新鮮冰凍的腦皮質(zhì)勻漿后提取蛋白，根據(jù)其蛋白濃度(BAC法測定)，各樣本等量蛋白10%SDS-DEPG電泳，轉(zhuǎn)膜，1∶500兔抗大鼠磷酸化SAPK/JNK多克隆抗體，1∶500兔抗大鼠磷酸化p38單克隆抗體，1∶1 000兔抗大鼠SAPK/JNK多克隆抗體以及1∶1 000兔抗大鼠p38多克隆抗體4 ℃孵育過夜，1∶1 000Ⅱ抗室溫孵育2 h，使用ECL(Amersham公司)進(jìn)行膠片顯影。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1生理指標(biāo)檢測

Ⅰ組和S組幼鼠在麻醉處理過程中呼吸均勻，膚色紅潤，脈搏血氧飽和度(SPO2)均>95%，無1例出現(xiàn)呼吸抑制。各組pH值均在正常范圍無顯著差異(C組：7.39±0.55；Ⅰ組：7.37±0.89；S組：7.38±0.78)。各組均無低血糖發(fā)生，C組為(4.56±0.53) mmol/L，Ⅰ組為(8.08±0.76) mmol/L，S組為(5.46±0.33) mmol/L。3組間血糖差異顯著(P<0.01)。Ⅰ組比C組和S組血糖明顯增加(均P<0.01)，S組與C組血糖差異無顯著。

2大腦皮質(zhì)caspase-3表達(dá)的變化

免疫組化染色顯示3組大腦皮質(zhì)壓部后區(qū)caspase-3陽性表達(dá)有明顯差異，見圖1A。C組RS區(qū)單位面積的caspase-3陽性染色細(xì)胞數(shù)為(5.92±1.05)個/mm2，Ⅰ組為(32.02 ±6.74)個/mm2和S組為(14.89±2.28)個/mm2。Ⅰ組和S組caspase-3表達(dá)分別較C組增加441%(P<0.01)和151%(P<0.01)，Ⅰ組比S組增加115%(P<0.05),見圖1B。

圖1新生鼠腦皮質(zhì)壓部后區(qū)caspase-3表達(dá)的免疫組化結(jié)果

3磷酸化SAPK/JNK表達(dá)的變化

Ⅰ組磷酸化SAPK/JNK在麻醉2 h和4 h分別較對照組增加了219%(P<0.05)和181%(P<0.05)，S組磷酸化SAPK/JNK在麻醉2 h和4 h與對照組無顯著差異，而且Ⅰ組4 h比S組4 h增加了41.5%(P<0.05),見圖2。提示SAPK/JNK通路在異氟醚麻醉的早期就已經(jīng)激活，而七氟醚可能沒有激活該通路。

4磷酸化p38表達(dá)的變化

Ⅰ組磷酸化p38表達(dá)在麻醉2 h和4 h較對照組增加38.9%(P<0.05)和36.9%(P<0.05)，S組在2 h和4 h較對照組增加32.6%(P<0.05)和128.0%(P<0.01)，S組4 h較2 h增加72.3%(P<0.05)，S組4 h較Ⅰ組4 h增加66.8%(P<0.05),見圖3。提示異氟醚輕度激活p38通路，而七氟醚在麻醉2 h輕度激活p38通路，4 h能顯著激活該通路。

討 論

在各種誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性改變的模型中，神經(jīng)細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是細(xì)胞損傷的潛在機(jī)制。目前已有多篇研究報道吸入麻醉藥異氟醚可以引起腦突觸發(fā)育高峰期的動物神經(jīng)元凋亡[2-7]。Jevtovic等[2]報道0.75%異氟醚6 h可誘導(dǎo)P7新生大鼠腦區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡，與咪唑安定和氧化亞氮聯(lián)合使用凋亡程度更大，并且會導(dǎo)致成年期學(xué)習(xí)記憶功能減退。單獨使用異氟醚麻醉P7新生鼠0.75%4 h、1.50%2 h和2.00%1 h，均可誘導(dǎo)鼠腦出現(xiàn)廣泛凋亡[5]，而異氟醚不會增加新生鼠神經(jīng)元凋亡的最高濃度為0.55%[6]。有關(guān)豚鼠的研究也發(fā)現(xiàn)0.55%異氟醚麻醉4 h就誘導(dǎo)caspase-3增加3至6倍[7]。作為目前臨床廣泛使用的吸入麻醉藥七氟醚是否也具有同樣的神經(jīng)毒性，與MAPK通路中的蛋白改變是否有關(guān)系是本研究關(guān)注的重點。

我們前期研究使用PC12細(xì)胞和原代培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元模型已經(jīng)證明異氟醚比七氟醚的毒性更大，誘導(dǎo)更多的caspase-3和caspase-9表達(dá)[8]，因此本研究擬在整體動物實驗中進(jìn)一步證實同等劑量的七氟醚比異氟醚誘導(dǎo)更小程度的細(xì)胞凋亡。本研究的實驗?zāi)Ｐ褪沁x用1.1%異氟醚或1.8%七氟醚麻醉P7新生大鼠4 h。腦突觸發(fā)育的高峰期在嚙齒類為出生后2周[11]，人類為妊娠晚期至出生后3歲。本研究選擇P7的新生大鼠作為研究對象，腦發(fā)育階段相當(dāng)于人類成熟的新生兒期。根據(jù)Orliaguet等[12]的研究，P9新生大鼠的MAC濃度異氟醚為2.34%，七氟醚為3.74%。本研究選用P7新生大鼠與P9新生大鼠年齡接近，因此推斷本研究中1.1%異氟醚和1.8%七氟醚的麻醉深度相當(dāng)于0.5MAC。而Liang等[13]認(rèn)為0.75%的異氟醚和1.1%的七氟醚相當(dāng)于0.5MAC，主要是他們使用的動物為小鼠，參考文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)不一致所致。在預(yù)試驗中我們使用1.5%異氟醚麻醉新生大鼠1 h，新生鼠出現(xiàn)明顯的呼吸抑制，而1.1%異氟醚和1.8%七氟醚麻醉新生幼鼠4 h，新生鼠沒有出現(xiàn)呼吸抑制，血氣檢測在正常范圍內(nèi)，各組均無低血糖發(fā)生，而且異氟醚組的血糖高于其它2組。因此，本研究使用該麻醉劑量作為研究，排除了呼吸抑制、低血糖等生理性干擾對細(xì)胞凋亡和蛋白表達(dá)結(jié)果的影響。

圖2Westernblotting檢測0.5MAC異氟醚和七氟醚麻醉新生大鼠2h和4h磷酸化SAPK/JNK的變化

圖3Westernblotting分析0.5MAC異氟醚和七氟醚麻醉新生大鼠2h和4h磷酸化p38的變化

本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.5 MAC七氟醚誘導(dǎo)新生鼠腦皮質(zhì)RS區(qū)caspase-3的表達(dá)明顯少于異氟醚組，七氟醚組比對照組增加1.5倍，而異氟醚組比對照組增加4.4倍。這與最近Liang等[13]研究的結(jié)果一致，他們使用1.1%七氟醚和0.75%異氟醚麻醉P7新生小鼠6 h，也發(fā)現(xiàn)七氟醚誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的程度比異氟醚要小，但是2種藥物都不會影響大鼠青少年期的空間學(xué)習(xí)能力。本研究檢測到的單位面積細(xì)胞凋亡數(shù)目比他們報道的少，這主要是由于檢測的腦區(qū)不同所致，Li等[14]研究的為海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，而本研究選擇的是皮質(zhì)RS區(qū)神經(jīng)元。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)單位面積海馬神經(jīng)元的凋亡數(shù)目比皮質(zhì)RS區(qū)要多近10倍。但兩項研究結(jié)果中異氟醚和七氟醚對神經(jīng)元凋亡影響的趨勢是一致的。Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)1.7%七氟醚麻醉2 h可誘導(dǎo)P5-P7的C57BL/6小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元caspase-3表達(dá)增加4倍，大于本研究中七氟醚增加的幅度，主要與檢測的時點選擇不同有關(guān)。他們選擇麻醉后12 h，此時為caspase-3陽性表達(dá)高峰期。而Bercker等[16]使用3-5%七氟醚麻醉P6 d的Wister新生大鼠6 h，caspase-3表達(dá)與對照組無明顯差異，可能是他們選擇24 h后檢測已經(jīng)難以檢測到caspase-3陽性的細(xì)胞。

異氟醚和七氟醚誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的機(jī)制目前研究尚未完全明確。有研究證實異氟醚與咪唑安定和氧化亞氮聯(lián)合使用通過激活BDNF神經(jīng)元凋亡通路[4]而激活內(nèi)源性線粒體通路，4 h后也激活外源性通路誘導(dǎo)凋亡[3]。我們前期細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)異氟醚能通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP3受體比七氟醚誘導(dǎo)更高的細(xì)胞漿鈣離子濃度[17]，而且異氟醚顯著降低Bcl-2/Bax比值[8]。而這兩種吸入麻醉藥誘導(dǎo)發(fā)育期神經(jīng)細(xì)胞凋亡與MAPKs信號通路的關(guān)系尚未見報道。本研究在整體動物實驗中發(fā)現(xiàn)異氟醚在麻醉早期就顯著增加磷酸化SAPK/JNK表達(dá)2倍多，并持續(xù)至麻醉4 h，而對磷酸化p38也有激活，但增加幅度不大，提示異氟醚誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡可能激活SAPK/JNK和p38這兩條通路有關(guān)，但激活SAPK/JNK更明顯。而七氟醚對磷酸化SAPK/JNK影響不大，而在麻醉4 h顯著增加磷酸化p38表達(dá)超過1倍，提示七氟醚誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡可能與激活p38通路有關(guān)。由于誘導(dǎo)凋亡的信號通路有許多，是否這兩條通路激活肯定參與了異氟醚和七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，尚不能完全定論。如果確實相關(guān)，異氟醚對神經(jīng)毒性的誘導(dǎo)過程SAPK/JNK和p38哪一條通路的激活更重要，下游的哪些信號蛋白被激活，這些都需要進(jìn)一步實驗證明。

總之，本研究通過給P7新生大鼠吸入同等劑量(0.5MAC)的異氟醚和七氟醚4 h，發(fā)現(xiàn)異氟醚比七氟醚均可以增加腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡，而異氟醚增加神經(jīng)元凋亡的程度比七氟醚更顯著。異氟醚誘導(dǎo)凋亡可能主要與激活SAPK/JNK磷酸化有關(guān)，而七氟醚誘導(dǎo)凋亡可能與激活p38磷酸化有關(guān)。

本研究也存在一定的局限性，沒有同時使用SAPK/JNK和p38的拮抗劑來進(jìn)一步證實異氟醚和七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡與這兩條通路的激活相關(guān)性，沒有研究caspase-3激活與這兩條通路的因果關(guān)系，缺乏行為學(xué)實驗的結(jié)果來評價這兩種藥物的長期影響，在后續(xù)的研究中將繼續(xù)完善?？傊?，本研究結(jié)果證明0.5 MAC異氟醚比七氟醚誘導(dǎo)P7新生大鼠更嚴(yán)重的神經(jīng)元凋亡，可能與它們不同地激活SAPK/JNK和p38磷酸化有關(guān)。研究提示七氟醚的神經(jīng)毒性作用小于異氟醚，在嬰幼兒和小兒手術(shù)中使用可能更加安全。

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EffectsofisofluraneandsevofluraneonapoptosisofcorticalneuroninneonatalratsandtheroleofMAPKspathway

LI Yu-juan1, LIU Chui-liang2, ZHANG Jing1, CHEN Wei-qiang1, ZENG Min-ting1

(1DepartmentofAnesthesiology,TheSunYat-senHospitalofSunYat-senUniversity,2DepartmentofAnesthesiology,TCMHospitalofGuangdongProvince,Guangzhou510120,China.E-mail:yujuan_04@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the effects of isoflurane and sevoflurane at the same dose on apoptosis of cortical neuron in neonatal rats and the role of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) pathway.METHODSEleven neonatal rats were selected at postnatal day 7 from 1 litter (altogether 5 litters) and assigned randomly into control group (C group), isoflurane group (Ⅰ group) and sevoflurane group (S group). The rats in Ⅰ group, S group or C group were exposed to 1.1% isoflurane, 1.8% sevoflurane[ (equivalent to 0.5 minimum alveolar concentration(MAC)] and room air for 4 h, respectively. The brain of neonatal rats were perfused and embedded by paraffin. Caspase-3 positive expression in the retrosplenial cortex (RS) of the brain was observed by immunohistochemical staining. Meanwhile, the fresh cortex was separated at 0 h in C group and at 2 h and 4 h in Ⅰ group and S group. The levels of phospho-SAPK/JNK and SAPK/JNK, phospho-p38 and p38 in fresh cortex were detected by Western blotting.RESULTSCaspase-3 positive cells in the the cortex were increased by 441% in Ⅰ group (P<0.01) and 151% in S group (P<0.01) as compared to C group, and increased by 115% in Ⅰ group (P<0.05) as compared to S group. The protein levels of phospho-SAPK/JNK in the cortex were increased by 219% at 2 h (P<0.05) and 181% at 4 h (P<0.05) in Ⅰ group, while no significant difference between S group and C group was observed. The phospho-p38 protein in the cortex was increased by 38.9% at 2 h (P<0.05) and 36.9% at 4 h (P<0.05) in Ⅰ group, and increased by 32.6% (P<0.05) at 2 h and 128.0% at 4 h (P<0.01) in S group as compared to C group.CONCLUSIONIsoflurane induces more apoptotic neurons in the cortex of the brain in neonatal rats at postnatal day 7 than sevoflurane. Isoflurane induces apoptosis mainly by activating SAPK/JNK phosphorylation, while sevoflurane induces aopotosis by activating p38 phosphorylation.

Isoflurane; Sevoflurane; Brain; Mitogen-activated protein kinases

R729

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.014

1000-4718(2011)01-0072-05

2010-08-02

2010-10-16

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 30700787)；廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No.8151040701000062)

△通訊作者 Tel：020-81332060; E-mail: yujuan_04 @yahoo.com.cn