常 利， 張博愛， 賈延劼， 付振強， 沈 雷， 石進峰， 文全慶， 趙二義

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 河南 鄭州 450052)

P2Y1受體介導Aβ25-35所致大鼠星形膠質細胞活化*

常 利， 張博愛△， 賈延劼， 付振強， 沈 雷， 石進峰， 文全慶， 趙二義

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 河南 鄭州 450052)

目的觀察嘌呤受體P2Y1在Aβ25-35所致的大鼠星形膠質細胞活化中所起的作用。方法體外分離培養(yǎng)大鼠星形膠質細胞，按空白對照、Aβ25-35和P2Y1受體阻斷劑MRS2179+Aβ25-35和MRS2179分組干預后，通過免疫細胞化學、免疫熒光法和Western blotting方法觀察GFAP和P2Y1表達的變化。結果各組細胞數(shù)量無明顯變化。與對照組相比，Aβ25-35組GFAP熒光強度明顯增加；MRS2179+Aβ25-35和MRS2179組均降低，兩組間無明顯差異。Western blotting顯示GFAP在各組間表達與免疫熒光法有相似趨勢；與對照組相比，P2Y1表達在Aβ25-35組明顯增多(P<0.05)和MRS2179+Aβ25-35和MRS2179組無明顯變化(P>0.05)。結論Aβ25-35通過P2Y1受體活化激活星形膠質細胞。

受體，P2Y1; 淀粉樣β蛋白; 星形細胞

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一種以進行性認知障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。星形膠質細胞(astrocyte,AC)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫吞噬細胞,在致炎因素作用下被激活成反應性AC。反應性AC既具有保護神經(jīng)元的作用,也能分泌細胞毒因子、炎癥因子、補體蛋白而損害神經(jīng)元。盡管目前其發(fā)病機制還不清楚,但大多數(shù)學者認為β淀粉樣蛋白(amyloid beta, Aβ)Aβ沉積激活AC引起的炎癥反應、氧化應激是AD的重要病理機制。嘌呤型受體(purinergic receptor)在1978年首次被Burnstock發(fā)現(xiàn)，并分為P1、P2兩種亞型。其中P2受體是一類核苷酸受體，分為P2X(離子通道受體)和P2Y(G蛋白偶聯(lián)受體)。迄今已從人體組織細胞克隆出8種P2Y受體，廣泛分布在腦部，執(zhí)行不同的生理功能。有研究表明，星形膠質細胞表達P2Y1受體，且后者在星形膠質化進程中起重要作用[1]。AD的病理改變之一為老年斑的形成，老年斑的核心成分為 Aβ，在AD發(fā)病機制中起到重要作用[2]，其主要毒性片段為25-35。Aβ25-35是Aβ中第25-35位氨基酸殘基組成的序列，常用于體外神經(jīng)毒實驗的AD模型。早在2000年，Moore等發(fā)現(xiàn)在AD患者腦內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結、神經(jīng)斑(塊)和神經(jīng)纖維網(wǎng)線等處發(fā)現(xiàn)有大量P2Y1受體存在。本實驗旨在研究Aβ25-35刺激下星形膠質細胞的變化，并探索P2Y1受體可能的作用。

材 料 和 方 法

1動物

新生24 h內(nèi)的Wistar大鼠(SPF級)，由河南省實驗動物中心提供。

2主要試劑和儀器

DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco。胰蛋白酶、多聚賴氨酸和P2Y1受體阻斷劑MRS2179(N6-methyl-2’-deoxyadenosine-3’,5’-bisphosphate )購自Sigma。兔抗大鼠多克隆膠質纖維酸性蛋白(GFAP)抗體和兔抗大鼠多克隆P2Y1抗體和兔抗大鼠β-肌動蛋白抗體(β-actin)購自Santa Cruz。Aβ25-35、辣根過氧化物標記羊抗兔IgG和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京博奧森公司。預染marker和熒光(Cy3)標記羊抗兔IgG購自碧云天公司。硝酸纖維素(nitrocellulose filter membrane，NC)膜購自PALL。二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-diaminobenzidine, DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司。其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Forma)，超凈工作臺(AIR TECH)，倒置相差顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(Olympus)，電泳儀、半干式電轉儀、酶標儀(Bio-Rad)。

3方法

3.1大鼠星形膠質細胞的分離、培養(yǎng)和純化 參照Jagdeep等[3]的方法，略改動。取新生24 h內(nèi)Wistar大鼠，用75%的乙醇消毒2次，無菌條件下斷頭取大腦皮層，并置于盛有冰冷PBS液的培養(yǎng)皿內(nèi)。分離并剝除腦膜、血管等結締組織后，用冰冷D-Hanks液洗3次，剪碎腦組織(在冰上操作)至1 mm×1 mm×1 mm大小。用0.25%胰蛋白酶溶液消化組織塊，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化10 min，用胎牛血清終止消化，用細口徑吸管反復輕輕吹打成均勻一致的細胞懸液。將制成的細胞懸液1 000 r/min離心5 min后棄上清，共3次，加培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清)吹打成均勻的細胞懸液。按5×105/cm2接種于25 cm2培養(yǎng)瓶于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液。約14 d后細胞可鋪滿瓶底。連續(xù)傳3代以獲取純化的星形膠質細胞，具體方法參照文獻[3]。

3.2實驗分組 本研究分為以下4組：(1)空白對照組：加入普通培養(yǎng)基;(2)Aβ25-35組：根據(jù)預實驗結果，加入5 μmol/L Aβ25-35的培養(yǎng)基;(3)MRS2179+Aβ25-35組:參考Sun等[4]法稍改動。先加入10 μmol/L MRS2179作用45 min，再加入5 μmol/L Aβ25-35; (4)MRS2179組：加入10 μmol/L MRS2179。以上各組均作用24 h。Aβ25-35提前放入37 ℃培養(yǎng)箱24 h凝聚以增強其毒性。

3.3星形膠質細胞的鑒定 將細胞接種于放有多聚賴氨酸處理載玻片的24孔培養(yǎng)板中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，倒置顯微鏡觀察細胞爬片情況，用4%多聚甲醛固定4 ℃過夜。第2 d取出載玻片，用PBS浸洗3 min×3次。參照免疫組化試劑盒說明書操作，其中GFAP工作效價為1∶100。細胞圖像通過顯微鏡用×10或×20攝取，圖像均采用300 dpi分辨率。每組獨立的實驗都會采集超過40個區(qū)域的細胞。而且，在明視野下所采集的每幅圖像都盡量包含相同的細胞數(shù)目。采用雙人雙盲隨機記數(shù)陽性細胞，計算陽性細胞百分比例。

3.4免疫熒光染色 經(jīng)多聚甲醛固定后的各組細胞，采用免疫熒光染色。基本步驟：0.2% Triton X-100處理10 min，并用10%牛血清白蛋白封閉1 h。然后用GFAP抗體4 ℃孵育24 h。采用Cy3標記山羊抗兔IgG(1∶100)在室溫下進行染色。倒置熒光顯微鏡采集圖片。

3.5Western blotting 收集各組細胞,在預冷細胞裂解液[50 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8),10 mmol/L EDTA, 2% SDS,5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF]100 μL中裂解、變性、離心。以BSA作為標準，根據(jù)Bradford法對蛋白質進行定量分析。蛋白裂解液加入5×凝膠上樣緩沖液進行SDS-丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，轉移到NC膜上。以含5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1 h，然后用相應的抗體(用含5%脫脂牛奶的TBST配制)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次15 min。再用相應的辣根過氧化物酶標記的IgG(用含5%脫脂牛奶的TBST配制)室溫反應1 h，TBST洗膜3次，每次15 min。然后進行ECL反應，并曝光顯影。對于相同的實驗重復至少3次(n=3)。所得條帶采用Quantity One 圖像分析軟件,分析底片上條帶的吸光度值,以同一膜上靶蛋白灰度/β-actin灰度比值作為目的蛋白的相對表達灰度。

4統(tǒng)計學處理

結 果

1大鼠星形膠質細胞的分離和培養(yǎng)

倒置顯微鏡下，初接種的細胞呈球形，4-6 h后開始貼壁，伸出突起，成片狀聚集生長。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞體積逐漸增大，突起伸長。原代培養(yǎng)細胞在7-9 d內(nèi)生長緩慢，之后生長速度顯著增快，12-14 d即可鋪滿全瓶。原代星形膠質細胞可見原漿型與纖維性混合，胞體呈梭形、圓形或多邊形,見圖1，胞核位于一側，單核或多核，胞漿豐富，原漿型星形膠質細胞胞體較大，突起多而短，纖維性星形膠質細胞胞體相對較小，但突起較長。傳代3次以后，細胞形態(tài)趨于一致，以纖維性星形膠質細胞為主。

Figure 1. Primary cultured astrocytes(×100).

圖1原代培養(yǎng)的星形膠質細胞2星形膠質細胞的鑒定

GFAP主要表達于胞漿和突起內(nèi)，胞核顯色淡，多呈空泡狀，見圖2。免疫組化染色陽性細胞統(tǒng)計在95%以上，達到實驗要求。

Figure 2. GFAP-positive astrocytes(×200).

圖2免疫組化GFAP陽性的星形膠質細胞

3Aβ25-35及P2Y1受體阻斷劑(MRS2179)對星形膠質細胞GFAP表達的影響

3.1免疫熒光結果 倒置顯微鏡下，每個實驗組采集20個區(qū)域的細胞，采用雙人雙盲隨機記數(shù)細胞數(shù)。各組每個區(qū)域細胞數(shù)分別為70.30±2.66，70.20±3.29，69.80±2.35，69.80±2.40，P>0.05。各組細胞數(shù)量變化不明顯，與對照組相比，Aβ25-35組細胞胞體肥大、突起增多， MRS2179+Aβ25-35組及MRS2179組細胞形態(tài)及數(shù)量無明顯變化。與對照組相比,Aβ25-35組GFAP熒光強度明顯增加，MRS2179+Aβ25-35及MRS2179組均減少,2組間無明顯差異，見圖3。

Figure 3. GFAP-positive astrocytes(Cy3,×100).Compared with the control group,the fluorescence intensity of GFAP significantly increased in Aβ25-35group, and was reduced in MRS2179+ Aβ25-35and MRS2179 groups by immunofluorescence.A:control; B:Aβ25-35;C:MRS2179+Aβ25-35；D：MRS2179.

圖3GFAP陽性星形膠質細胞

3.2Western blotting結果 各組細胞干預24 h后提取蛋白，檢測GFAP、P2Y1表達變化。與對照組相比，Aβ25-35組GFAP、P2Y1表達明顯增多(P<0.05)；MRS2179+Aβ25-35組及MRS2179組GFAP表達顯著減少(P<0.05)，2組間無明顯差異(P>0.05)，2組P2Y1表達與對照組無明顯差異(P>0.05),見圖4、5。

Figure 4. Western blotting assay for GFAP and P2Y1protein expression.

圖4Westernblotting檢測GFAP和P2Y1蛋白表達結果

圖5目的蛋白與內(nèi)參照相對吸光度比值

討 論

1Aβ與星形膠質化

近年來，星形膠質細胞在整個神經(jīng)網(wǎng)絡的功能日益受到重視。星形膠質細胞是具有多種效應和功能狀態(tài)的細胞，正常情況下，星形膠質細胞處于靜息狀態(tài)，對外界環(huán)境刺激敏感、迅速做出反應性變化是其顯著特點之一。當中樞神經(jīng)系統(tǒng)遭遇炎癥、缺血、損傷時，星形膠質細胞將會出現(xiàn)形態(tài)和功能的改變，稱為“反應性星形膠質化”。最近，通過綜合大量的實驗結果，Sofroniew[5]給出以下定義，包括4個主要特點：(1)反應性星形膠質化是星形膠質細胞對CNS所有形式和嚴重性損傷和疾病做出的分子、細胞、功能方面的變化，包括極微小的病變；(2)這種變化涵蓋了分子表達、細胞肥大、增殖和膠質瘢痕形成等一系列改變，依據(jù)損傷程度而定；(3)這種變化由胞內(nèi)外特定的信號分子調(diào)節(jié)；(4)這種變化將通過獲得或喪失某些功能改變星形膠質細胞的活性，從而給周圍的神經(jīng)或非神經(jīng)細胞帶來有益或有害的影響。研究表明，反應性星形膠質化時GFAP的表達水平是增加的，伴有星形膠質細胞谷氨酸鹽轉運蛋白表達下降，增加了局部神經(jīng)元對興奮性毒性的易損性[6]。上述研究表明星形膠質細胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷反應極其敏感，程度依損傷性質、程度而定。因此，探明星形膠質細胞活化時相關分子機制、信號通路顯得尤為重要。

作為AD老年斑的主要成分，Aβ常用來制作體外神經(jīng)毒模型。不過以往的研究多集中在神經(jīng)元，膠質細胞研究得不多。在AD，人體和動物模型研究表明，衰老斑周圍的星形膠質細胞在Aβ的沉積和清除方面可能起著決定性作用[7],且有研究Aβ42在星形膠質細胞內(nèi)蓄積，且活化星形膠質細胞內(nèi)的Aβ42的含量與AD局部病理的嚴重程度相關[8]。這提示Aβ有可能直接而非間接作用于星形膠質細胞，引起相應的病理生理改變。

本實驗用Aβ25-35作用于星形膠質細胞，肉眼觀察細胞數(shù)量無明顯變化，免疫熒光可見GFAP表達明顯增多，Western blotting GFAP表達有相似趨勢，表明Aβ25-35可以激活星形膠質細胞，與報道相符。

有研究顯示應用Aβ后體外培養(yǎng)的星形膠質細胞內(nèi)鈣升高，但卻不致細胞死亡[9]，這說明Aβ的沉積可能會催化星形膠質細胞胞內(nèi)外信號轉導。在體實驗還發(fā)現(xiàn)，AD小鼠腦內(nèi)星形膠質細胞網(wǎng)絡靜息鈣水平明顯升高[10]。在皮層或海馬星形膠質細胞和神經(jīng)元共培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，Aβ作用于星形膠質細胞，通過增加星形膠質細胞[Ca2+]c，Aβ激活NOX(NADPH氧化酶)，產(chǎn)生氧化性應激，導致神經(jīng)元死亡[11]。另外有數(shù)據(jù)顯示，Aβ通過降低GLAST(谷氨酸-天冬氨酸轉運蛋白)和GLT-1(谷氨酸鹽轉運蛋白-1)的水平和活性，以非競爭性抑制的方式降低體外培養(yǎng)星形膠質細胞對谷氨酸鹽的吸收。這種對谷氨酸鹽轉運功能的廣泛抑制可能部分通過ERK、JNK、p38信號轉導通路活性的改變來調(diào)節(jié)，這一過程被Aβ介導的氧化應激所觸發(fā)[12]。

2P2Y1受體與星形膠質化

P2Y1受體表達于星形膠質細胞表面，參與調(diào)節(jié)星形膠質細胞鈣信號傳播[13]，有報道稱其還參與痛覺的產(chǎn)生和持續(xù)。研究表明，當中腦動脈閉塞、皮質及伏核穿刺損傷時，星形膠質細胞活化，P2Y1受體表達升高[1]；且P2Y1受體在戳傷時表達增加，P2Y1受體激動劑ADP-βS可增加星形膠質細胞P2Y1受體和GFAP的表達，P2Y1受體阻斷劑MRS2179和P2Y1受體抗體可抑制激動劑介導的增殖效應[1]。說明P2Y1受體與GFAP的表達可能有相關性?；诖?，本實驗擬探討P2Y1受體在星形膠質細胞活化中的作用。

本實驗中，與對照組相比，Aβ25-35組GFAP表達明顯增多，說明Aβ25-35可使星形膠質細胞活化，但被MRS2179阻斷后GFAP表達減少，說明GFAP的表達與P2Y1相關；Western blotting顯示Aβ25-35組P2Y1表達增多，其余2組P2Y1表達與對照組相比無差異，證實Aβ25-35通過活化P2Y1受體進而激活星形膠質細胞。

電生理及分子生物學技術發(fā)現(xiàn)，ATP、ADP、ADP-βs激活星形膠質細胞P2Y1受體，后者可與G蛋白偶聯(lián)，激活磷脂酶C，水解磷脂酰肌醇，生成IP3(1,4,5-三磷酸肌醇)和DAG(二?；视?，胞內(nèi)IP3含量升高，與內(nèi)質網(wǎng)膜上IP3受體結合，引起Ca2+從內(nèi)質網(wǎng)鈣庫釋放，細胞[Ca2+]i迅速升高，誘發(fā)胞內(nèi)多種信號轉導途徑[14]，另一方面促進ATP從膠質細胞釋放，再激活鄰近膠質細胞P2Y受體，引起鈣波遠距離擴散。且P2Y1受體C末端Thr339(蘇氨酸)與蛋白激酶C(PKC)相互作用是鈣波產(chǎn)生的重要環(huán)節(jié)之一。

P2Y1受體通路的活化可致星形膠質細胞谷氨酸鹽釋放，進而調(diào)節(jié)星形膠質細胞-神經(jīng)元間相互作用和增加體外培養(yǎng)的背側角神經(jīng)元興奮性[15]。另外，缺血情況下P2Y1受體通過JAK2/STAT3信號通路及下游區(qū)的Ras/ERK信號通路導致星形膠質細胞GFAP表達下降，從而干擾星形膠質化[4]。

綜上所述，本研究提示，Aβ25-35可使星形膠質細胞P2Y1受體活化，進而激活星形膠質細胞，具體信號通路有待進一步研究。因此，進一步認識星形膠質細胞及P2Y1受體功能，特別是其特定信號轉導途徑以及開發(fā)高度特異性的受體亞型激動劑和拮抗劑，對我們研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病尤其是變性病的發(fā)生機制有重要意義，并可能為這類疾病的處理提供新的治療思路。

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RoleofP2Y1receptorinactivationofastrocytesinducedbyAβ25-35

CHANG Li, ZHANG Bo-ai, JIA Yan-jie, FU Zhen-qiang, SHEN Lei, SHI Jin-feng, WEN Quan-qing, ZHAO Er-yi

(DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China.E-mail:zhangboaidoctor@163.com)

AIM: To study the role of P2Y1receptor in the activation of astrocytes induced by Aβ25-35.METHODSAstrocytes were isolated and cultured from newborn Wistar rats and divided into control group, Aβ25-35group, MRS2179(P2Y1receptor inhibitor)+Aβ25-35group and MRS2179 group by treating the cells with the corresponding reagents. The expression levels of GFAP and P2Y1were determined by the methods of immunohistochemistry, immunofluorescence and Western blotting.RESULTSNo significant change of the astrocyte numbers in all groups was observed. Compared with the control cells, the fluorescence intensity of GFAP significantly increased in Aβ25-35group and decreased in both MRS2179+Aβ25-35group and MRS2179 group. The expression level of GFAP determined by Western blotting and immunofluorescence showed the similar trend of change in each group. Compared with control group, the expression of P2Y1in Aβ25-35group was significantly increased (P<0.05), and no significant change between MRS2179+Aβ25-35group and MRS2179 group was found (P>0.05).CONCLUSIONAβ25-35activates astrocytes by activation of P2Y1receptor.

Receptors, P2Y1; Amyloid beta-protein; Astrocytes

R741.02

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.013

1000-4718(2011)01-0067-05

2010-06-04

2010-11-23

國家自然科學基金資助項目(No.30770758)

△通訊作者 Tel:0371-66295112; E-mail:zhangboaidoctor@163.com